Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:100

Thêm vào BST

Báo xấu

70
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận văn nhằm xác định đặc điểm di truyền gen HA và NA của virus cúm B lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012; xác định đặc tính kháng nguyên và các axit amin thay đổi liên quan đến sự thay đổi đặc tính kháng nguyên của virus cúm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------- PHẠM HOÀI LINH LY NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng GS. TS. Phạm Văn Ty HÀ NỘI-2014 1
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. HỌC VIÊN Phạm Hoài Linh Ly 2
LỜI CẢM ƠN Tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:  Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học QGHN  Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ TƯ Đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình chỉ bảo và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu từ bước đầu tới khi hoàn thiện luận văn, tạo mọi điều kiện nghiên cứu thuận lợi để tôi có được kết quả như ngày hôm nay. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến GS. TS. Phạm Văn Ty, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã hướng dẫn tôi những kiến thức chuyên ngành hữu ích trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã cho tôi những kiến thức chuyên ngành quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa học. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS. TS. Lê Thị Quỳnh Mai, Phó Viện trưởng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, ThS. Hoàng Vũ Mai Phương, ThS. Nguyễn Cơ Thạch cùng các anh chị công tác tại Phòng Thí nghiệm Cúm, Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp - những người đã tiếp thêm cho tôi nguồn động viên quý giá, luôn bên cạnh chia sẻ và giúp đỡ để tôi đạt được thành quả hôm nay. Hà Nội, ngày 14 tháng 4 năm 2014 Phạm Hoài Linh Ly 3
MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU………………………………………………………................ 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……………………………………………. 3 1.1. VIRUS CÚM B…………..…………………………………...…… 3 1.1.1. Đặc điểm chung………………………………..………………… 3 1.1.2. Hình thái và cấu trúc virion của virus cúm B................................. 4 1.1.3. Cấu trúc phân tử của virus cúm B và chức năng….……………... 5 1.1.4. Cơ chế nhân lên của virus cúm B……………………..…………. 8 1.2. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TRÊN THẾ GIỚI…….. 10 1.3. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TẠI VIỆT NAM………. 12 1.4. SỰ TIẾN HÓA CỦA VIRUS CÚM B…………..…..…………… 13 1.5. BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ SINH BỆNH HỌC BỆNH CÚM.. 14 1.5.1. Biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm……………………………….. 14 1.5.2. Sinh bệnh học bệnh cúm………………………….……………… 14 1.6. ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM………………………. 15 1.6.1. Các thuốc kháng virus……………………………...……...…….. 15 4
1.6.2. Dự phòng…………….……………………………………...……. 17 1.7. CHẨN ĐOÁN VIRUS HỌC…...………………………..……….. 19 1.7.1. An toàn phòng thí nghiệm………………………………………... 19 1.7.2. Thu thập mẫu để chẩn đoán virus …...………….……………...… 20 1.7.3. Phương pháp phân lập chủng và định typ virus…………….......... 20 1.7.4. Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence)………………...... 21 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…. 23 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..………………………..……….. 23 2.2. VẬT LIỆU...……………………………………………………… 23 2.2.1. Chủng virus cúm B……….……………………………………….. 23 2.2.2. Sinh phẩm……………...………………………………………….. 23 2.2.3. Trang thiết bị và dụng cụ………………..………….……...……… 25 2.3. PHƯƠNG PHÁP..………………..…………………...…………. 25 2.3.1. Định typ virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HAI)……………………………………………………..……….. 25 2.3.2. Giải trình tự gen…………………………...………...………….... 27 2.3.3. Phương pháp phân tích kết quả và xử lý số liệu………..…………. 34 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………….………….…. 36 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ KHUẾCH ĐẠI CÁC CHỦNG VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012…….……... 36 36 3.1.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012. 3.1.2. Kết quả phân lập virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010- 2012………………………………………………….………. 37 5
3.2. ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM B, 2010- 2012 ……………………………………………………………………… 39 3.3. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN HA CÁC CHỦNG VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012……….…... 46 3.3.1. Sự phân bố các chủng virus cúm B theo thời gian...……………… 46 3.3.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen HA của virus cúm B………………. 46 3.3.3. Cây gia hệ gen HA……………………………………………...… 48 3.3.4. Protein HA….………………...…………………………………… 52 3.4. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN NA CÁC CHỦNG VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012…………… 57 3.4.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen NA của virus cúm B.…………….... 57 3.4.2. Cây gia hệ gen NA………………………………………………... 61 3.4.3. Protein NA………………………………………….…………….. 65 KẾT LUẬN……………………………………………………………… 72 KIẾN NGHỊ………………………………………………………........... 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 6
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxy Ribonucleic ARN Acid Ribonucleic CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm phòng chống và kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ) HA Hemaglutination Assay (Phương pháp ngưng kết hồng cầu) HI Hemaglutination Inhibition test (Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu) ILI Influenza like illness (Hội chứng cúm) MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells (Tế bào thận chó thường trực) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase) QIV Quadrivalent Influenza Vaccine (Vắc xin gồm 4 thành phần virus H1N1, H3N2, B/Yamagata và B/Victoria) RNP Phức hợp Ribonucleoprotein TCYTTG World Health Oganization (Tổ chức Y tế Thế giới ) VSDTTƯ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 7
DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Các phân đoạn ARN của virus cúm và chức năng………................ 5 3.1. Kết quả phân lập virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012.. 38 3.2. Kết quả định typ virus cúm B bằng phương pháp HAI, 2010-2012.. 39 3.3. Hiệu giá HI của các chủng virus cúm B, 2010-2012………………. 41 3.4. So sánh hiệu giá HAI giữa hai dòng B/Victoria và B/Yamagata….. 42 3.5. So sánh kháng nguyên virus cúm B tại Miền Bắc Việt Nam với thành phần vắc xin cúm tại Bắc và Nam Bán cầu theo khuyến cáo của TCYTTG, 2010-2012…………………………………………. 43 3.6. Số lượng chủng phân tích gen HA và NA ………………………… 46 3.7. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Vitoria, 2010- 2012................................................................................................... 53 3.8. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Yamagata, 2010- 2012…………………………………................................................ 55 3.9. Số lượng trung bình axit amin thay đổi trên protein HA so với virus dự tuyển vắc xin của TCYTTG, 2010 -2012………………… 57 3.10. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Vitoria, 2010- 2012………………………………………………………………… 64 3.11. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata, 2010- 2012………………………………………………………………… 65 3.12. Số lượng trung bình axit amin thay đổi trên protein NA so với virus dự tuyển vắc xin của TCYTTG, 2010 -2012………………… 66 8
DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1. Mô hình cấu trúc chung của virus cúm...................................... 4 1.2. Chu trình nhân lên của virus cúm ……………………………. 8 1.3. Các vị trí đột biến trên cấu trúc không gian 3 chiều của Neuraminidase ………………………………….……………. 16 3.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010 - 2012…………………………………....................................... 37 3.2. Tỷ lệ lưu hành 2 dòng kháng nguyên virus cúm B theo năm ... 40 Sản phẩm gen HA sau PCR ………………………………….. 3.3. 47 Sản phẩm gen HA sau khi tinh sạch…………………………. 47 3.4. 3.5. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata và dòng B/Victoria, 2010-2012.........................…………………. 48 3.6. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Victoria, 2010- 2012…………………………………………….……………... 49 3.7. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata, 2010-2012…………………………………..………………… 50 3.8. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Victoria…… 53 3.9. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Yamagata..... 54 3.10. Số axit amin khác nhau trên protein HA dòng B/Victoria giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin……………. 56 9
3.11. Số axit amin khác nhau trên protein HA dòng B/Yamagata giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin………. 56 3.12. Sản phẩm gen NA sau PCR…………………………………... 58 3.13. Sản phẩm gen NA sau khi tinh sạch…………………………. 58 3.14. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Victoria và dòng B/Yamagata, 2010-2012……………..…………………. 59 3.15. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Victoria, 2010- 2012............…………………………………………………… 60 3.16. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Yamagata, 2010-2012………………………………………………….…. 61 3.17. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Victoria…… 63 3.18. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata… 64 3.19. Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Victoria giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin………….… 65 3.20. Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Yamagata giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin………. 66 3.21. Các vị trí axit amin trên protein NA của 2 dòng B/Yamagata và B/Victoria liên quan đến đột biến kháng thuốc hoặc giảm độ nhạy của thuốc oseltamivir và zanamivir………………… 68 10
MỞ ĐẦU Hàng năm trên Thế giới cũng như tại Việt Nam, virus cúm vẫn tiếp tục gây ra các vụ dịch/ đại dịch cúm với tỉ lệ mắc và tử vong cao [31]. Trong đó, virus cúm A được quan tâm nghiên cứu hơn cả do loại virus này có khả năng gây ra các dịch/đại dịch nghiêm trọng, gần đây nhất có thể kể đến đại dịch H1N1 (2009) cũng như các vụ dịch do virus cúm độc lực cao lây truyền từ gia cầm sang người A/H5N1. Nguyên nhân là do virus cúm A có đối tượng gây nhiễm đa dạng như gia cầm, thủy cầm, chim di cư, động vật có vú và người [8]. Trong nhiều thập kỷ qua, virus cúm B được biết đến như một loại virus gây bệnh cảm lạnh thông thường, không gây thành dịch/đại dịch lớn. Khác với virus cúm A, virus cúm B chỉ có những thay đổi nhỏ kháng nguyên (đột biến) [43]. Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu đã cho thấy triệu chứng lâm sàng khi nhiễm cúm B cũng như tỷ lệ nhập viện và tử vong liên quan đến cúm B và viêm phổi do bội nhiễm cũng tương tự khi nhiễm virus cúm A. Tại Mỹ, trong giai đoạn 2004-2008, trong 309 trẻ tử vong liên quan đến virus cúm mùa có 34% trường hợp tử vong do virus cúm B [23]. Trong mùa cúm 2011-2012, tỷ lệ trẻ em tử vong do virus cúm B chiếm tới 38 % (44/115), trong đó chỉ có 50% số trẻ em được điều trị các loại thuốc kháng virus. Chính vì vậy, các trường hợp nhiễm cúm B này đã không có cơ hội được điều trị và can thiệp kịp thời tránh bội nhiễm, biến chứng dẫn tới tử vong [18]. Khi nghiên cứu 45 trường hợp tử vong do virus cúm B cho thấy 1/3 trong số này bội nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus, trong đó số trường hợp tử vong trong 3 và 4 ngày sau khi nhiễm virus là 50% và 70% [20]. Như vậy, thời gian từ khi nhiễm virus cúm B đến khi tử vong nhanh hơn so với virus cúm A/H1N1 1918, A/H2N2 1957, A/H3N2 1968, A/H1N1pdm 2009 và A/H3N2 [21, 26, 32, 35,]. Mặt khác, virus cúm B kết hợp với các virus gây viêm đường hô hấp khác sẽ có khả năng gây biến chứng nguy hiểm cho trẻ em, người già, người suy giảm miễn dịch hoặc mắc các bệnh mạn tính và phụ nữ mang thai nếu không có biện pháp phòng ngừa kịp thời. 11
Trên thế giới, từ những năm 1970, vắc xin cúm được sản xuất là vắc xin đa giá, thành phần vắc xin bao gồm 2 phân týp virus cúm A (A/H1N1, A/H3N2) và 1 dòng virus cúm B (Trivalent influenza vaccine - TIV). Vào những năm của thập kỷ 80, virus cúm B đã xuất hiện 2 dòng, B/Yamagata và B/Victoria, lưu hành đồng thời ở nhiều nước nhưng thành phần vắc xin vẫn lựa chọn chủng đại diện cho một dòng kháng nguyên virus cúm B [37, 48]. Vì vậy, những năm virus cúm B lưu hành cả 2 dòng kháng nguyên thì hiệu quả của vắc xin dự phòng sẽ hạn chế. Mặt khác, nhiều năm đã có sự không phù hợp giữa chủng virus cúm B đang lưu hành và chủng virus cúm B được lựa chọn trong thành phần vắc xin hàng năm. Tại Việt Nam, kể từ khi dịch viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARS), cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện năm 2003 đến nay gánh nặng bệnh cúm gần đây đã được quan tâm nhiều hơn. Tuy nhiên, virus cúm B dường như vẫn chưa đươc quan tâm đúng mực. Với những gánh nặng bệnh của virus cúm B như vậy, việc triển khai nghiên cứu về sự lưu hành, đặc điểm di truyền cũng như đặc tính kháng nguyên của virus cúm B tại Việt Nam là hết sức cần thiết. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam” Với mục tiêu: 1. Xác định đặc điểm di truyền gen HA và NA của virus cúm B lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012. 2. Xác định đặc tính kháng nguyên và các axit amin thay đổi liên quan đến sự thay đổi đặc tính kháng nguyên của virus cúm. 12
Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. VIRUS CÚM B 1.1.1. Đặc điểm chung Virus cúm B thuộc họ Orthomyxoviridae [9], ngoài ra trong họ này còn có các nhóm virus khác như: virus cúm A, virus cúm C, virus Thogoto và virus Isa. Trong đó, virus cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và các động vật khác như lợn, ngựa..., là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Virus cúm B và C chỉ lưu hành chủ yếu ở người và thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ [8]. Gây ra dịch bệnh theo mùa là đặc tính của virus cúm A và B, xảy ra chủ yếu vào cuối mùa thu và đầu mùa đông. Khi có những thay đổi lớn kháng nguyên (antigenic shift) xuất hiện ở kháng nguyên của virus cúm A, các vụ dịch lớn có thể xảy ra với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao. Virus cúm B không có những thay đổi lớn kháng nguyên nhưng có thể tiến hóa bởi những thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigenic drift) và không gây nên các vụ đại dịch nghiêm trọng. Tuy nhiên những biến chứng thể nặng có thể dẫn tới tử vong do virus cúm B đã được ghi nhận. Danh pháp quốc tế được quy định cho virus cúm B được viết như sau: B/nơi phân lập/mã số PTN/năm phân lập (ví dụ: B/HongKong/330/2001). Do sự thay đổi về kháng nguyên bề mặt của virus cúm B hầu như không quan sát được nên danh pháp quốc tế của virus cúm B không có sự tham gia của kháng nguyên bề mặt HA và NA như đối với danh pháp quốc tế được quy định cho virus cúm A. Virus cúm B được phân chia thành 2 dòng kháng nguyên phân biệt vào những năm 1980, đó là dòng B/Victoria (B/Victoria/2/87-lineage viruses) và dòng B/Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage viruses). Các dòng virus này được đặt tên sau khi xuất hiện các đại diện đầu tiên là B/Victoria/2/87 - like virus và B/Yamagata/16/88 - like virus [48]. 13
1.1.2. Hình thái và cấu trúc của virus cúm B Thành phần cấu trúc của virus cúm B gồm có: 1% ARN, 70% protein, 20% lipit và 5-8% carbohydrate. Virion cúm (hạt virus hoàn chỉnh, dạng virus nghỉ ở ngoài tế bào) có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc hình sợi kéo dài tới 2000nm, đường kính trung bình từ 80-120nm. Virus cúm B có cấu trúc phức tạp và có vỏ ngoài bao bọc. Vỏ ngoài virus có bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào chất của vật chủ, bao gồm một số glycoprotein và một số protein dạng trần không được glycosyl hoá. Các virion cúm có các tính chất hóa lý như rất nhạy cảm khi xử lý bằng cách đun nóng, dùng dung môi lipit, chất tẩy rửa không chứa ion, formaldehyde, tác nhân ô xi hóa, khả năng lây nhiễm của các virus cúm cũng bị giảm đi sau khi chúng tiếp xúc với bức xạ. Hình 1.1. Mô hình cấu trúc chung của virus cúm *Nguồn: Funtional and structure studies of influenza B virus Hemagglutinin by Fengyun Ni [22 ] Trên bề mặt vỏ ngoài virus có đính các gai glycoprotein, đó là các kháng nguyên haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Virus cúm C chỉ có một gai glycoprotein. Protein HA gây ngưng kết hồng cầu, có vai trò quyết định trong việc 14
gắn virus vào tế bào chủ, protein NA có chức năng phá vỡ liên kết giữa virus và tế bào chủ để giải phóng virus ra khỏi tế bào nhiễm. Tỉ lệ HA/NA là 4/1 (hình 1.1). 1.1.3. Cấu trúc phân tử của virus cúm B và chức năng Genome của virus cúm B gồm 8 phân đoạn giống như virus cúm A, còn virus cúm C chỉ gồm 7 phân đoạn, trên mỗi phân đoạn có thể ghi dấu cho nhiều mật mã di truyền. Sợi ARN của virus cúm là sợi đơn âm, có chiều dài khoảng ~13.6kb đối với virus cúm A và ~14.6kb đối với virus cúm B [6]. Mỗi phân đoạn mã hoá cho 1 hoặc 2 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc. Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của virus cúm và chức năng [52] Phân đoạn Protein Chức năng ARN 1 PB2 Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN thông tin (mRNA). Đóng vai trò làm enzyme phiên mã: gắn kết, 2 PB1 kéo dài, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp virus thế hệ mới trong tế bào chủ 3 PA Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN virion (vRNA). 4 HA Phân tử có cấu trúc trimer, cắt bởi enzyme thuỷ phân thành HA1 và HA2, là cơ sở cho khả năng nhiễm trùng. (Haemagglutinin HA gắn với tế bào túc chủ, dung hợp giải phóng phức ) hợp ribonucleoprotein (RNP), mở đầu cho quá trình nhân lên của virus. 5 NP Là thành phần protein chủ yếu của phức hợp RNP, chứa một trong các kháng nguyên đặc hiệu týp, phân biệt 3 (Nucleoprotein) 15
týp cúm A, B, C. 6 NA Phân tử có cấu trúc tetramer, thuỷ phân bằng protease, cho phép virus tiến qua lớp niêm dịch tới các tế bào của (Neuraminidase) đường hô hấp trong quá trình nhiễm trùng. Loại bỏ phân tử axít sialic của phân tử HA từ các virion NB (=M2) mới được tổng hợp, làm lộ HA ra ngoài, tăng khả năng nhiễm trùng. 7 M1-M2 M1: là kháng nguyên đặc hiệu týp, có chức năng ổn định cấu trúc virus, điều khiển hoạt tính RNA- (matrix protein) polymerase và tham gia vào quá trình lắp ráp virus (70%). M2: kênh ion. 8 NS1-NS2 Là protein không cấu trúc, kết thúc quá trình tổng hợp protein của tế bào túc chủ, chỉ có trong tế bào nhiễm virus. Qua những nghiên cứu về hoạt động chức năng các protein của virus cúm trong quá trình nhân lên và sao chép trong tế bào chủ cho thấy vùng gen HA của virus cúm B tiến hóa chậm hơn vùng gen của virus cúm A. Phân đoạn HA của virus cúm B có cấu trúc và chức năng tương tự phân đoạn HA của virus cúm A, đó là một kháng nguyên bề mặt chủ yếu, giúp virus bám dính và xâm nhập vào tế bào chủ [10, 47]. Khác với virus cúm A, virus cúm B được ghi nhận chỉ lưu hành ở người và hải cẩu. Vì vậy chỉ quan sát thấy các thay đổi nhỏ kháng nguyên ở virus cúm B. Các thay đổi nhỏ kháng nguyên ở phân đoạn HA của virus cúm B xuất hiện như ở virus cúm A, bởi sự tích tụ của các axit amin thay thế trong polypeptide HA1, nhưng chỉ 16
khoảng ¼ tỉ lệ này ở virus cúm A. Do đó virus cúm B không gây ra đại dịch như một số virus cúm A. Vào những năm 1980, virus cúm B đã được phân chia thành hai dòng kháng nguyên phân biệt là B/Victoria và B/Yamagata. Hai dòng virus cúm B được phân biệt bởi sự khác nhau ở axit amin vị trí 269. Axit amin vị trí 269 của dòng Yamagata là Pro nhưng ở tất cả các virus dòng Victoria là Ser. Sự biến đổi từ Pro sang Ser là một biến đổi bất bảo toàn, liên quan đến sự phân phối điện tích (trung tính thành có cực) và hình dạng của các axit amin [19]. Hiện nay, thử nghiệm ngăn ngưng kết hồng cầu (Heamagglutinin inhibition test - HI) sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu với hai dòng virus đã cho phép phân biệt hai dòng kháng nguyên này của virus cúm B. 17
1.1.4. Cơ chế nhân lên của virus cúm B Gắn vào các receptor Nảy chồi Biến đổi sau dịch mã Dịch mã Nhập bào Thể nội bào Cởi vỏ Màng tế bào Màng nhân Hình 1.2. Chu trình nhân lên của virus cúm * Nguồn: Funtional and structure studies of influenza B virus Hemagglutinin [22] Đầu tiên, virus sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất của tế bào chủ nhờ gai glycoprotein HA theo nguyên tắc khóa - chìa. Các thụ thể đặc hiệu có bản chất là các axit sialic (N- acetyl neuraminic acid - NANA). Sau đó virus xâm nhập vào bên trong tế bào theo cơ chế nhập bào. Các virion virus ấn sâu vào màng 18
tế bào tạo hốc rồi khép lại tạo túi nội bào hay bọng (endosome) nằm bên trong tế bào chất. Bơm proton trong endosome vận chuyển H+ vào làm cho pH trong endosome giảm xuống 5, pH thấp tạo điều kiện cho protein F (fusion) chồi lên cắm vào màng endosome như chiếc neo, kéo vỏ ngoài virus sát với endosome và tiến hành dung hợp với màng endosome để giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất. Sự hợp nhất này chỉ xảy ra khi phân tử HA tiền thân (HA0) phân tách thành HA1 và HA2 nhờ protease phổ biến là furin. Phân tử HA2 có đầu - N đóng vai trò hoà tan trung gian giữa vỏ virus và màng nội bào (hình 1.2). Protein M2 ở virus cúm A hay còn gọi là kênh ion (ion - channels) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình thay đổi pH và dung hợp này. Hầu hết các virus ARN tiến hành sao chép trong tế bào chất vì chúng có thể mã hóa cho tất cả các enzym cần cho sao chép genome mà không cần đến các enzym của tế bào nằm trong nhân, nhưng đối với virus cúm, chúng lại cần bộ máy cắt nối của tế bào nên genome của chúng phải được đưa vào nhân. Sau khi hợp nhất màng, nucleocapsid được vận chuyển vào trong nhân tế bào. Trong nhân, sợi ARN (-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN (+) theo cơ chế bổ sung [cARN (+)] nhờ enzyme RNA - polymerase phụ thuộc ARN của virus. Chính các cARN (+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên vật liệu di truyền của virus. Các sợi ARN (-) được tạo thành này là một sợi hoàn chỉnh về độ dài (có độ dài đủ - full length ARN), không được mũ hoá ở đầu 5’ và không được adenyl hoá ở đầu 3’. Các ARN (-) mới này một phần được phiên mã tạo ra các mRNA (+) ngắn hơn. Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein với các chức năng khác nhau xảy ra ở tế bào chất. Các protein này bao gồm 7 protein cấu trúc PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc NS1, NS2 và M2 đối với virus cúm A và 1 protein không cấu trúc NB đối với virus cúm B. Các protein NS1, M1 và NP được vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi ARN (-) mới tổng hợp để hình thành nên nucleocapsid, sau đó được vận chuyển ra tế bào chất. Tại đây, các protein HA, NA, M2 được chuyển qua lưới nội chất tới bộ máy Golgi, tương tác với nhau, bao bọc nucleocapsid, khởi đầu cho việc nảy chồi của virus. Hạt 19
virion mới được tạo thành bằng cách nảy chồi từ màng sinh chất. Phân tử NA phân cắt axit sialic giải phóng virus ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây nhiễm mới [8]. 1.2. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TRÊN THẾ GIỚI Hoạt động của virus cúm B được báo cáo trên nhiều quốc gia trong những năm gần đây với sự lưu hành đồng thời của cả 2 dòng B/Yamagata và dòng B/Victoria. Cúm B lưu hành đồng thời từ cuối thập niên 80 thế kỷ 19 khi biến thể của virus cúm B là B/Panada/45/90 lần đầu tiên được quan sát thấy. Chủng này và các biến thể thuộc dòng Yamagata đã lan ra khắp thế giới, trong khi các chủng của dòng B/Victoria/2/87 trước đó lại tiếp tục lưu hành ở Châu Á rồi sau đó trải qua các tiến hóa không phụ thuộc trở thành dòng phân biệt về đặc tính kháng nguyên [46]. Trên thế giới, hai dòng virus cúm B đều được xác định lưu hành hàng năm, tuy nhiên một trong hai dòng sẽ chiếm ưu thế trong từng năm. Dựa vào kết quả giám sát này, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) sẽ đưa ra khuyến cáo về sự lựa chọn dòng kháng nguyên B trong thành phần vắc xin cúm hàng năm cho các nước thuộc khu vực Bắc bắn cầu hoặc Nam bán cầu. Trong giai đoạn từ năm 1999 đến năm 2002, dòng B/Yamagata chiếm ưu thế hơn đã được lựa chọn vào thành phần vắc xin. Các virus cúm B thuộc dòng Yamagata trong giai đoạn này có đặc tính kháng nguyên và di truyền giống với chủng B/Sichuan/379/99. Trong giai đoạn tiếp theo từ năm 2002 đến năm 2004, ở cả Nam bán cầu và Bắc bán cầu dòng virus cúm B chiếm ưu thế lại là dòng Victoria với các virus có đặc tính kháng nguyên và di truyền giống với chủng B/HongKong/330/2001. Tương tự như vậy, dường như sự lưu hành của virus cúm B có một quy luật lặp lại 2-3 năm một lần. Khi mà trong giai đoạn từ năm 2004 đến năm 2006, dòng Yamagata quay trở lại chiếm ưu thế trên thế giới với đại diện là chủng B/ShangHai/361/2002. Trong giai đoạn từ năm 2006 đến năm 2008, trên cả Nam bán cầu và Bắc bán cầu, dòng chiếm ưu thế là dòng Victoria với đại diện là chủng B/Malaysia/2506/2004. Trong giai đoạn tiếp theo từ 20