Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:78

Thêm vào BST

Báo xấu

42
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP để phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người; đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình kỹ thuật LAMP trong xác định sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên mẫu phân thu thập từ người bệnh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********** HOÀNG THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT LAMP ĐỂ CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ Clonorchis sinensis TRÊN NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********** HOÀNG THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT LAMP ĐỂ CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ Clonorchis sinensis TRÊN NGƢỜI Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Trương Văn Hạnh TS. Đỗ Thị Phúc H Nội– Năm 2019
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tâm của các thầy, cô, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trương Văn Hạnh, Khoa Sinh học Phân tử, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương, người hướng dẫn trực tiếp, đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Phúc, Bộ mộn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, là thầy đồng hướng dẫn, đã luôn luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và động viên tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn: Chủ nhiệm đề tài KC.10.16/16-20 PGS.TS. Trần Thanh Dương và các thành viên tham gia nghiên cứu của đề tài đã giúp đỡ tôi cùng tham gia thực hiện nghiên cứu quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người. Các anh chị em đồng nghiệp tại khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương đã hỗ trợ tôi trong quá trình tham gia học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn chân thành đến tập thể Giáo sư, Tiến sĩ trong Hội đồng khoa học chấm Luận văn. Tôi vô cùng biết ơn gia đình và những người bạn thân thiết đãđộng viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn. Hoàng Thị Hạnh
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3 1.1. Bệnh sán lá gan nhỏ ...........................................................................................3 1.1.1. Các triệu chứng lâm sàng ...............................................................................3 1.1.2. Các phƣơng pháp chẩn đoán[1] .....................................................................3 1.2. Đặc điểm phân loại, hình thái của sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis .........4 1.2.1. Phân loại ...........................................................................................................4 1.2.2. Hình thái sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis ...............................................4 1.3. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ...............................................................5 1.4. Một số đặc điểm di truyền phân tử của sán lá gan nhỏ sử dụng trong giám định loài ......................................................................................................................6 1.4.1.DNA ribosome(rDNA)trong hệ gen nhân ......................................................6 1.4.2. Hệ gen ty thể mtDNA ......................................................................................7 1.5. Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới và Việt Nam .........................8 1.5.1 Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới .............................................8 1.5.2. Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ở Việt Nam ...........................................10 1.6. Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sán lá gan nhỏ......................................10 1.6.1. Xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ trong phân hoặc dịch tá tràng ......10 1.6.2. Các xét nghiệm miễn dịch.............................................................................11 1.6.3. Chẩn đoán bằng các kỹ thuật sinh học phân tử .........................................11 1.7. Kỹ thuật LAMP ................................................................................................12 1.7.1. Nguyên lý kỹ thuật LAMP ...........................................................................12 1.7.2. Đánh giá kết quả của LAMP ........................................................................15 1.8. Các nghiên cứu về ứng dụng kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán C.sinensis những năm gần đây .................................................................................................17 CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................19 2.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu ......................................19 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu....................................................................................19
2.1.2. Thời gian nghiên cứu: ...................................................................................19 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu .....................................................................................19 2.1.4. Hóa chất, vật tƣ tiêu hao, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................19 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................22 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu .......................................................................................22 2.2.1.1. Thu thập mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trƣởng thành ........................23 2.2.1.2. Tách ADN tổng số ......................................................................................23 2.2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ......................................................25 2.3. Các chỉ số nghiên cứu ......................................................................................29 2.4. Thu thập số liệu, xử lý số liệu ..........................................................................30 2.5. Đạo đức trong nghiên cứu ...............................................................................31 CHƢƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................32 3.1.Kết quả nghiên cứu thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensistrên ngƣời .......................................................................................32 3.1.1. Kết quả thiết kế mồi cho phản ứng LAMP xác định C. sinensis ..............32 3.1.2. Kết quả tối ƣu các điều kiện của phản ứng LAMP xác định C. sinensis .38 3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. Sinensis trên ngƣời ..........................................................................48 3.2.1. Kết quả điều tra thu thập mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trƣởng thành48 3.2.2. Kết quả thiết lập bộ mẫu sử dụng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis ........................................49 3.2.3. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP phát hiện C. sinensis trên ngƣời ..............................................................................................51 KẾT LUẬN ..............................................................................................................54 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................56
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thể, cấu tạo sán lá gan nhỏ C. sinensistrưởng thành ..........................5 Hình 1.2. Sán lá gan nhỏ và trứng sán lá gan nhỏ ......................................................5 Hình 1.3. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ .........................................................6 Hình 1.4. Minh họa rTU eukaryote ............................................................................6 Hình 1.5. Bộ gen ty thể của sán lá gan nhỏ ................................................................8 Hình 1.6. Sơ đồ mô tả quá trình phản ứng LAMP ....................................................14 Hình 1.7. Đánh giá kết quả LAMP ...........................................................................15 Hình 1.8. Sơ đồ quy trình thực hiện kỹ thuật LAMP ...............................................16 Hình 3.1.Kết quả tìm kiếm trình tự gen nad1 của C. sinensis trên NCBI ................32 Hình 3.2. Ảnh phân tích gióng hàng 24 trình tự gen nad1 của C. sinensis bằng phần mềm Bioedit v.2.6.7 ..................................................................................................33 Hình 3.3. Ảnh điện di kết quả thử nghiệm các mồi LAMP thiết kế dựa trên khả năng tổng hợp ADN ...........................................................................................................35 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi F3/B3 của C. sinensis ...............36 Hình 3.5. Ảnh giản đồ trình tự ADN của đoạn gen nad1 được nhân bản với cặp mồi CS-Nad1-F3/B3 với mẫu C. sinnensis tại Ninh Bình ...............................................36 Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CS-Nad1-F3/B3 trên các mẫu thử nghiệm là ADN của một số loài giun, sán. ...............................................................37 Hình 3.7. Ảnh điện di kết quả khảo sát nhiệt độ ủ của phản ứng LAMP .................38 L: Ladder 100 bp .......................................................................................................38 Hình 3.8.Kết quả khảo sát thời gian của phản ứng LAMP .......................................39 Hình 3.9.Kết quả khảo sát tối ưu nồng độ Mg2+cho phản ứng LAMP .....................40 Hình 3.10.Kết quả khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng LAMP ...............................41 Hình 3.11.Kết quả khảo sát nồng độ dNTP mix cho phản ứng LAMP ....................42 Hình 3.12. Kết quả khảo sát thể tích ADN khuôn đưa vào phản ứng LAMP ..........43 Hình 3.13.Kết quả khảo sát nồng độ HNB sử dụng cho phản ứng LAMP ...............44 Hình 3.14.Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện LAMP xác định C. sinensis.............46 Hình 3.15. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện của phản ứng LAMP xác định C. sinensis sử dụng chất chỉ thị màu HNB ....................................................................47 Hình 3.16.Kết quả khảo sát khả năng lai chéo của kỹ thuật LAMP với các loài giun, sán gây bệnh trên người ............................................................................................52
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các hóa chất, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu ................................19 Bảng 2.2. Trình tự các bộ mồi sử dụng cho LAMP, real time PCR .........................20 Bảng 2.3. Danh mục vật tư tiêu hao chính sử dụng trong nghiên cứu ......................21 Bảng 2.4. Danh mục máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu............................21 Bảng 2.5. Bảng tính độ nhạy và độ đặc hiệu.............................................................30 Bảng 3.1. Trình tự mồi LAMP được thiết kế để khuếch đại gen nad1 .....................34 Bảng 3.2. Kết quả phát hiện sản phẩm LAMP sử dụng HNB bằng mắt thường ......45 Bảng 3.3. Kết quả xét nghiệm phân bằng kỹ thuật Kato-Katz .................................49 ảng 3.4. ết quả tẩy, đãi thu sán lá gan nhỏ C. sinensis ........................................49 Bảng 3.5 Kết quả thiết lập bộ mẫu để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP ........................................................................................................................51 Bảng 3.6. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis tại phòng thí nghiệm .................................................................51
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BLAST Basic Local Alignment Công cụ tìm kiếm, đối chiếu nội Search Tool bộ cơ bản trên NICB bp Base pairs Cặp bazơ Ct Threshold Cycle Chu kỳ ngưỡng DNA Deoxyribonucleic Acid Axit Deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleotide Deoxynucleotide Triphosphate Triphosphate IDT Integrated DNA Công nghệ DNA tích hợp Technologies LAMP Loop – Mediated Isothermal Khuếch đại đẳng nhiệt tạo cấu Amplification trúc vòng nad1 NADH dehydrogenase NADH dehydrogenase subunit 1 subunit 1 NCBI National Center for Trung tâm thông tin công nghệ Biotechnology Information sinh học quốc gia Mỹ PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp rTU Ribosomal transcriptome Đơn vị phiên mã Ribosome unit RNA Ribonucleic Acid Axit Ribonucleic UTRs Untranslated Regions Vùng không dịch mã UV Ultra violet Tia cực tím WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới
MỞ ĐẦU Cá là món ăn giàu năng lượng được ưa thích và cũng chứa nhiều nguy cơ mầm bệnh tiềm tàng nếu chưa được nấu chín. Nhiều thống kê đã chỉ ra rằng có khoảng 50 loại giun sán ký sinh chủ yếu được tìm thấy ở các loại hải sản, trong đó phổ biến là những loại cá nước ngọt. Nhiễm sán lá gan nhỏ là bệnh gắn liền với tập quán ăn gỏi cá từ lâu đời ở nhiều vùng trong cả nước như: Ninh ình, Nam Định, Hòa ình, Phú Yên, ình Định… Theo ước tính trên thế giới số người mắc sán lá gan nhỏ khoảng 45 triệu người, số người có nguy cơ mắc khoảng hơn 600 triệu [13]. Tại Việt Nam đã phát hiện được hai loài sán lá gan nhỏ là Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini với hai vùng dịch tễ rõ rệt. Loài C.sinensis lưu hành cao ở vùng đồng bằng Bắc bộ như Nam Định, Hoà Bình, Ninh Bình 20-30%. Trong khi đó loài sán lá gan nhỏ O. viverrini lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam như Phú Yên có tỷ lệ nhiễm 36,9%, ình Định 11,9%, Đăk Lăk 7,6%, Đà Nẵng 0,3%, Quảng Nam 4,6%, Khánh Hoà 1,4% [9]. Sán lá gan nhỏ ký sinh gây tổn thương gan, lách, tụy. Nhiễm sán lá gan nhỏ gây tăng sinh tổ chức xơ trong gan, ống mật có thể dày lên và có khi gấp 2-3 lần bình thường; ống tụy có thể dày; lách có khi sưng to và xơ hóa; đặc biệt nhiễm sán lá gan nhỏ kéo dài sẽ ảnh hưởng đến chức năng gan, dẫn đến xơ gan, có thể gây ung thư đường mật và gây tử vong [2], [13]. Tuy nhiên, từ khi nhiễm sán lá gan nhỏ đến khi xuất hiện các triệu chứng bệnh lý là một khoảng thời gian dài không có triệu chứng lâm sàng hoặc các triệu chứng không đặc hiệu. Do không biểu hiện rầm rộ như những bệnh khác nên dễ bị lãng quên, ít được quan tâm. Thậm trí cho đến khi triệu chứng tổn thương gan đã rõ, nhiều bác sĩ lâm sàng vẫn không nghĩ đến nguyên nhân là do sán lá gan nhỏ. Vì vậy, việc chẩn đoán xác định bệnh sán lá gan nhỏ cần dựa vào các xét nghiệm cận lâm sàng [19], [46]. Xét nghiệm tìm thấy trứng sán trong phân hoặc dịch tá tràng bằng phương pháp Kato- atz được WHO (1994) đưa ra như là tiêu chuẩn vàng chẩn đoán xác 1
định. Mặc dù vậy, tùy vào giai đoạn nhiễm và mức độ đào thải trứng qua phân mà xét nghiệm trứng trong phân có thể bỏ sót, không phát hiện được, độ nhạy không cao (chỉ khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên, dễ nhầm lẫn giữa trứng của các loài sán lá gan nhỏ và với trứng của sán lá ruột nhỏ [46]. Chẩn đoán bằng sinh học phân tử sử dụng các gen đích ITS1, ITS2 và DNA ty thể với các kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini hay C. sinensis cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao [18], [20], [24]. Tuy vậy chưa được áp dụng rộng rãi do giá thành cao và kỹ thuật phức tạp, hạn chế khi thực hiện tại những phòng xét nghiệm được trang bị nghèo nàn [11]. Gần đây, cùng với sự ra đời của một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt axit nucleic, việc ứng dụng phát triển các kỹ thuật đẳng nhiệt phát hiện nhanh các ký sinh trùng gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước. Trong đó kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng (LAMP-Loop-Mediated Isothermal Amplification) được sử dụng phổ biến hơn cả. Hơn nữa, với khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP, không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích [4],[19], [37]. Ở Việt Nam, đến nay chủ yếu vẫn sử dụng phương pháp xét nghiệm bằng Kato- atz để phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ, hiện chưa có nghiên cứu nào về ứng dụng kỹ thuật LAMP phát hiện sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người” với mục tiêu: 1. Thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP để phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người. 2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình kỹ thuật LAMP trong xác định sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên mẫu phân thu thập từ người bệnh. 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh sán lá gan nhỏ Bệnh sán lá gan nhỏ là bệnh mắc phải do nhiễm sán lá gan nhỏ thuộc chi Clonorchis và Opisthorchis. Trên thế giới, có 3 loài sán lá gan nhỏ gây bệnh ở người là Clonorchis sinensis; Opisthorchis viverrini; Opisthorchis felineus.Ở Việt Nam, bệnh do hai loài sán Clonorchis sinensis hoặc Opisthorchis viverrini ký sinh trong đường mật gây nên [2]. 1.1.1. Các triệu chứng lâm sàng Giai đoạn mới nhiễm Người bệnh thường không có triệu chứng rõ rệt, một số trường hợp có rối loạn tiêu hoá, ăn chậm tiêu, mệt mỏi. Giai đoạn phát bệnh Người bệnh có thể có một trong số các triệu chứng như rối loạn tiêu hoá, đau tức hạ sườn phải và vùng gan, đôi khi có cơn đau gan điển hình và kèm theo vàng da, nước tiểu vàng. Một số trường hợp người bệnh bị xạm da, gan có thể sưng to dưới bờ sườn với mật độ mềm, mặt nhẵn và tiến triển chậm, lúc này có thể đau điểm túi mật, viêm đường mật hoặc viêm tụy. Giai đoạn mạn tính Người bị nhiễm sán lá gan nhỏ có thể ăn kém, gầy yếu, sụt cân, giảm sức lao động, đường mật dày lên, kém đàn hồi, có thể bị tắc, có thể xơ gan, cổ trướng và chết. Đặc biệt sán lá gan có thể đẫn đến ung thư đường mật. 1.1.2. Các phương pháp chẩn đoán[1] Chẩn đoán lâm sàng Dựa vào các triệu trứng lâm sàng như rối loạn tiêu hoá, ậm ạch khó tiêu, đau tức vùng gan, có thể biểu hiện viêm đường mật hoặc viêm tụy... Dựa vào tiền sử như sống trong vùng dịch tễ sán lá gan hoặc đã từng ăn gỏi cá nghĩ đến bệnh sán lá gan. Chẩn đoán cận lâm sàng Dựa vào kết quả của các xét nghiệm cận lâm sàng gồm: 3
Xét nghiệm phân có trứng sán lá gan trong phân hoặc dịch tá tràng là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định. Siêu âm gan có hình ảnh gan tăng sáng, ống mật có thể bị giãn, thành ống mật và thành túi mật dày. Công thức máu: Bạch cầu ái toan, chức năng gan. Miễn dịch học: Với độ chính xác phụ thuộc nguồn kháng nguyên hay kháng thể sử dụng làm chuẩn. Các xét nghiệm sinh học phân tử: PCR, real time PCR, đến nay đã có nhiều tác giả đề xuất kỹ thuật LAMP cho xét nghiệm phát hiện sán lá gan nhỏ [15], [31]. 1.2. Đặc điểm phân loại, hình thái của sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis 1.2.1. Phân loại Giới: Animalia (Linnaeus, 1758) Ngành: Platyhelminthes (Claus, 1887) Lớp: Trematoda (Rudolphi, 1808) Bộ: Opisthorchiida (La Rue, 1957) Họ: Opisthorchiidae (Looss, 1899) Chi: Clonorchis (Looss,1907) Loài: sinensis (Looss,1907) 1.2.2. Hình thái sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis 1.2.2.1. Sán trưởng thành Con sán hình chiếc lá nhỏ (bằng hạt thóc lép) dài 10 - 20 mm, rộng 2 - 4 mm, có 2 mồm hút (hấp khẩu). Sán lưỡng tính có nghĩa là trên một con sán có 2 bộ phận sinh dục đực và cái, dựa vào hình dạng tinh hoàn người ta xác định loài của sán. Clonorchis sinensis có tinh hoàn phân nhánh, khác với loài Opisthorchis viverrini có tinh hoàn phân thùy. 4
Hình 1.1. Hình thể, cấu tạo sán lá gan nhỏ C. sinensistrƣởng thành[2] 1.2.2.2. Đặc điểm hình thái trứng sán lá gan nhỏ Trứng có kích thước 26 - 30 x 16 - 17 m có nắp ở đầu và gai nhỏ ở cuối, nhìn dưới kính hiển vi giống như hạt vừng. Hình 1.2. Sán lá gan nhỏ và trứng sán lá gan nhỏ [2] 1.3. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ Sán trưởng thành k‎ý sinh ở đường mật, đẻ trứng, trứng theo mật xuống ruột rồi theo phân ra ngoài. Trứng được rơi vào môi trường nước. Trứng bị ốc nuốt và nở ra ấu trùng lông trong ốc để phát triển thành ấu trùng đuôi. Ấu trùng đuôi rời ốc bơi tự do trong nước. Ấu trùng đuôi xâm nhập vào cá nước ngọt, rụng đuôi phát triển thành ấu trùng nang (nang ấu trùng) ở trong thịt của cá (bằng mắt thường khó nhìn thấy ấu trùng nang). Người (hoặc động vật) ăn phải cá có ấu trùng nang chưa được nấu chín. Sau khi ăn, ấu trùng này vào dạ dày, xuống tá tràng rồi ngược theo đường mật lên gan, nở ra sán lá gan trưởng thành, ký sinh và gây bệnh ở đó [2], [23]. 5
Hình 1.3. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ [2] 1.4. Một số đặc điểm di truyền phân tử của sán lá gan nhỏ sử dụng trong giám định lo i 1.4.1.DNA ribosome(rDNA)trong hệ gen nhân Đơn vị phiên mã ribosome (rTU) của rDNA thường được sử dụng để chuẩn đoán phân tử và nghiên cứu hệ thống, phát sinh gen. Một rTU của ba vùng mã hóa bao gồm các gen: 18S, 5.8S và 28S được phân tách bằng hai vùng giao gen (ITS1 và ITS2) [27], [29] (Hình 1.4). Vùng ITS1 và ITS2 thường được sử dụng trong giám định sán lá gan nhỏ [27]. Hình 1.4. Minh họa rTU eukaryote [44] 6
Đoạn gen của rDNA chứa các vùng 18S, 5.8S và 28S tạo thành một cụm lặp đi lặp lại song song. NTS: không được phiên mã spacer, ETS: spacer sao chép bên ngoài, ITS: spacers phiên mã nội bộ 1 và 2, được đánh số từ 5’ kết thúc [44]. - Các đoạn gen ITS (internal transcribed spacer) nằm trên RNA ribosome, là một đoạn gen không chức năng (không mã hóa) nằm giữa các tiểu đơn vị lớn (28S) và tiểu đơn vị nhỏ (18S) [12]. + ITS gồm ITS1 và ITS2 ngăn cách bởi vùng gen rRNA 5,8S. Đây là khu vực điển hình được bảo tồn tương đối trong một loài hoặc một chi, do vậy rất hữu ích để xác định ranh giới loài [36]. + Vùng ITS1 có khả năng bảo tồn cao hơn vùng ITS2. ên cạnh đó, vùng đầu 5’ của ITS1 có độ biến thiên cao hơn vùng đầu 3’, điều này cho phép phân biệt giữa các loài. Tuy nhiên, hạn chế của việc sử dụng ITS1 trong những nghiên cứu sinh học phân tử là sự hiện diện của các đoạn trình tự lặp lại. Hầu hết vùng ITS1 có cấu trúc gồm 3 yếu tố lặp lại: một là tại đầu ngắn 5’; hai là tại đầu 3’; ba là bên trong vùng ITS1 chứa ít nhất 2 đoạn lặp. Do vậy, số lượng các bản sao của vùng lặp lại xuất hiện rất khác nhau khi nghiên cứu giữa các loài và trong cùng 1 họ. + Vùng ITS2 chứa nhiều vị trí biến đổi hơn ITS1 và không chứa các yếu tố lặp. Đoạn này có chiều dài thay đổi trong cùng 1 họ, tuy nhiên, nó có tính bảo tồn khá cao ở mức độ loài. Do đó, vùng ITS2 không phù hợp cho các nghiên cứu từ mức độ chi trở lên [28], [36]. 1.4.2. Hệ gen ty thể mtDNA Gần đây hệ gen ty thể của sán lá gan nhỏ đã được giải trình tự, có chiều dài khoảng 14000 bp [45]. Giống như các sinh vật nhân chuẩn khác, bộ gen ty thể của sán lá gan nhỏ được sử dụng rộng rãi như là dấu hiệu di truyền để nghiên cứu phân loại hệ thống và di truyền loài từ dòng mẹ, do tốc độ tiến hóa nhanh, thiếu tái tổ hợp và cấu trúc bộ gen tương đối bảo tồn. Các gen cox1, nad1 thường được sử dụng trong xác định loài sán lá gan nhỏ [15], [41]. 7
Hình 1.5. Bộ gen ty thể của sán lá gan nhỏ [15] Do mức độ tiến hóa cao, DNA ty thể của sinh vật trở thành chỉ thị phân tử phổ biến cho các kỹ thuật sinh học phân tử, không chỉ ở cấp độ loài, mà còn ở cấp độ trong cùng 1 loài. 1.5. Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới v Việt Nam 1.5.1 Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới Hai loài sán lá gan nhỏ chính thường gặp gây bệnh ở người là Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini. Các vùng dịch tễ của sán lá gan nhỏ là khu vực Đông Nam Á (Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan), khu vực Đông Á (Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài loan, Nhật Bản) và một phần Đông ắc của Nga. Trong đó, loài sán lá gan nhỏ C. sinensis phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Triều Tiên và Việt Nam [26]. Clonorchis sinensis được Mc.Conell tìm ra đầu tiên năm 1875 trên tử thi người Trung Quốc ở Calcutta Ấn Độ và được Cobbold đặt tên là Distoma sinense. Dựa vào hình thái học, Loose (1907) và Kobayashi (1912) thống nhất đặt tên là Clonorchis sinensis. Bệnh phân bố ở phía Đông từ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc (trừ Tây Nam), Đài Loan và miền Bắc của Việt Nam. Năm 1947, Stoll thông báo có 19 triệu người bị nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis. 8
Tại Nhật:Từ năm1886-1898, tỷ lệ nhiễm sán lá gannhỏ là 30-67% dọc sông Ton, hồ asumigaura, đồng bằng Nobi, Aichi và Gifu, vùng hồ Biwa, sông Onga và sông Chigugo. Năm 1963 có nơi tỷ lệ nhiễm là 40-50%. Tại Triều Tiên và Hàn Quốc: Trường hợp C. sinensis đầu tiên được công bố năm 1915 (Matsumoto). Seo và cộng sự (1958) công bố tỷ lệ nhiễm 11,7%, năm 1969 tỉ lệ nhiễm 4,7% bằng xét nghiệm phân Kato. Tỷ lệ nhiễm 11,1-21,1% bằng test trong da[40]. Bằng test trong da với kháng nguyên C. sinensis xét nghiệm ở học sinh tiểu học sống dọc sông lớn như sông Han, sông Nakdong, sông uno, sông Yeongsan và sông Mangyong và trên 4.676 giáo viên có tỷ lệ dương tính 11,1%. Tại sông Nakdong gần Pusan miền Đông Hàn Quốc tỷ lệ nhiễm tới 82,9%, ở làng imhae Gun có cường độ nhiễm 10.698 trứng/gram phân trong số 284 trường hợp [21]. Gần đây Seo và cộng sự (1981) xét nghiệm phân 13.373 người, tỷ lệ nhiễm trung bình là 21,5% trong đó cao nhất ở sông Nakdong (40,2%) và thấp nhất ở sông Mangyong (8%) ước tính có 830.000 - 890.000 người trong số 4 triệu người trong vùng lưu hành bệnh [21] Tại Trung Quốc: C. sinensis phân bố ở hầu hết các vùng ở Trung Quốc, trừ vùng Tây - Nam. Miền Nam Trung Quốc, đặc biệt ở tỉnh Quảng Đông tỷ lệ nhiễm trên 40%, có làng nhiễm 100% [30]. Bệnh phân bố ở ít nhất 21 tỉnh của Trung Quốc với tỷ lệ nhiễm từ 0,08-57%, nhiều vùng nhiễm trên 5% (Xu Long Qi, 2004) [30] Tại Đài Loan: Trường hợp đầu tiên C. sinensis được phát hiện năm 1915 (Choi) và được nghiên cứu chi tiết bởi Chow (1960), Kim và Kuntz (1964), Cross (1969). Có 3 vùng lưu hành bệnh như Meinung, aohsing, Hsien ở miền Nam, hồ Sun-Moon và Miao-Li ở miền Trung. Bằng xét nghiệm phân tại Meinung cho thấy 10-52% nhiễm C. sinensis (Chow 1960, Hsieh 1989, Huang 1957, Kuntz 1961) [23], tại vùng gần hồ Sun-Moon tỷ lệ nhiễm 39-51% (Clarke 1971) và tại Miao-Li tỷ lệ nhiễm 57% (Ong và Lu, 1979) [23] Hiện nay, ước lượng số người nhiễm bệnh trên toàn cầu với C. sinensis là khoảng 35 triệu và gần một nửa trong số bệnh nhân này (khoảng 15 triệu) ở Trung Quốc [33]. 9
1.5.2. Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ở Việt Nam Ở Việt Nam, đã xác định lưu hành 2 loài sán lá gan nhỏ là C. sinensis và O. viverrini. Đến nay, đã ghi nhận bệnh sán lá gan nhỏ lưu hành ở ít nhất 32 tỉnh trong cả nước, tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ có khác nhau ở mỗi điểm nghiên cứu [7], [9]. Trong đó, sán lá gan nhỏ C. sinensis lưu hành ở ít nhất 22 tỉnh thành phía Bắc, O. viverrini được xác định lưu hành ít nhất ở 10 tỉnh miền Trung - Tây Nguyên [7]. Theo thống kê của Viện Sốt rét, ý sinh trùng, Côn trùng Trung ương từ năm 1976 đến 2004, đã xác định bệnh sán lá gan nhỏ C. sinensis lưu hành ít nhất ở 15 tỉnh với tỷ lệ nhiễm trung bình 19%, một số nơi có tỷ lệ nhiễm cao tới 37 % như Nam Định, Hoà Bình, Ninh Bình 20-30%. Trong khi đó loài sán lá gan nhỏ O. viverrini lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam như Phú Yên có tỷ lệ nhiễm 36,9%, ình Định 11,9%, Đăk Lăk 7,6%, Đà Nẵng 0,3%, Quảng Nam 4,6%, Khánh Hoà 1,4% [7] Do khó xác định trong gian đoạn đầu nhiễm bệnh, việc chẩn đoán xác định phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên, dễ nhầm lẫn giữa trứng của các loài sán lá gan nhỏ và với trứng của sán lá ruột nhỏ [25]. Với các kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini hay C. sinensis cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao [19], [20] nhưng chưa được áp dụng rộng rãi do giá thành cao, kỹ thuật phức tạp [11]. Đặc biệt khó triển khai ở vùng sâu vùng xa. Đây là những thông tin quan trọng và là cơ sở khoa học cho tính khả thi của đề tài này. 1.6. Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sán lá gan nhỏ Xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ trong phân hoặc dịch tá tràng, các xét nghiệm miễn dịch, sinh học phân tử. 1.6.1. Xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ trong phân hoặc dịch tá tràng Có nhiều phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng sán lá gan nhỏ khác nhau như xét nghiệm phân theo phương pháp ato (định tính) và Kato- atz (định lượng); Phương pháp ly tâm lắng cặn formalin-ether (FECT, formalin-ether concentration technique). Phương pháp ato (1954), ato- atz (1972) được WHO (1994) khuyến cáo sử dụng để xét nghiệm phân phát hiện trứng giun sánbằng kính hiển vi tại những 10
vùng dịch tễ có tỷ lệ nhiễm giun ≥ 20%, các loài sán ≥ 10%. Đây là kỹ thuật có thể phát hiện được trứng giun, sán lá gan nhỏ, sán lá ruột, sán dây, sán lá gan lớn trong phân, áp dụng được tại thực địa. Tuy nhiên, do lượng trứng trong phân thấp nên các phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng giun sán có độ nhạy không cao (chỉ khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên, dễ nhầm lẫn giữa trứng của các loài sán lá gan nhỏ và với trứng của sán lá ruột nhỏ [46]. Phương pháp tập trung trứng bằng ly tâm lắng cặn theo Esteban và cộng sự (1997)hoặc ly tâm lắng cặn formalin–ether cải tiến là phương pháp tập trung trứng giun sán và bào nang đơn bào dựa trên nguyên lý ly tâm lắng cặn có độ chính xác cao, ngoài trứng giun sán có thể phát hiện được đơn bào thể kén, dễ dàng kiểm tra lại các mẫu nghi ngờ do phân có thể được bảo quản trong formalin 10%. Đến nay kỹ thuật này có nhiều cải tiến, để có thể đánh giá định tính và định lượng được số trứng giun sán trong một gram phân. Tuy vậy, do lượng trứng trong phân ít nên dễ bỏ sót bệnh nhân, khó áp dụng trong xét nghiệm tại thực địa. 1.6.2. Các xét nghiệm miễn dịch Thử test trong da (intradernal test), phản ứng cố định bổ thể (complement fixation test), miễn dịch điện di (immuroelectrophoresis), phản ứng kháng nguyên gián tiếp (Indirect hemagglutination test: IHA), phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent Antibody (IFA), phản ứng ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tùy thuộc vào từng loại test và còn nhiều tranh luận, có hiện tượng dương tính kéo dài và lai chéo giữa các loài, khó triển khai tại thực địa. 1.6.3. Chẩn đoán bằng các kỹ thuật sinh học phân tử Nhiều nghiên cứu sử dụng các gen đích ITS1 (Internal Transcribed Spacer 1), ITS2 và DNA ty thể phát triển các kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini hay C. sinensis cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Wongratanacheewin và cộng sự (2002) sử dụng kỹ thuật PCR để xác định O. viverrini trên các mẫu phân người cho độ nhạy là 100% và độ đặc hiệu là 98% với các mẫu phân có mật độ nhiễm trứng sán> 1000 trứng/1gram phân, tuy vậy 11
độ nhạy giảm còn 68% với các mẫu có mật độ nhiễm trứng sán < 200 trứng/1 gram phân. Kỹ thuật PCR đã phát hiện được thêm 29% các mẫu dương tính với sán lá gan nhỏ từ số các mẫu âm tính bằng kỹ thuật soi kính hiển vi [47] Cai X.Q và cộng sự 2012, đã phát triển kỹ thuật real time PCR sử dụng TaqMan để phát hiện nhiễm C. sinensis từ mẫu phân người và mẫu ấu trùng trên cá nước ngọt. Các cặp mồi được thiết kế trên vùng gen đích ITS1 được chứng minh đặc hiệu cho C. sinensis và không lai chéo với các loài giun sán khác. Kết quả đánh giá độ nhạy cho thấy kỹ thuật real time PCR cho giới hạn phát hiện là 1 fg DNA tinh khiết hoặc 5 trứng/1g phân hoặc 1 ấu trùng/1 gram mô cá. Kết quả xét nghiệm bằng real time PCR được thử nghiệm trên 22 mẫu phân và 37 mẫu ấu trùng đã được xét nghiệm bằng kính hiển vi cho thấy real time PCR cho kết quả tương đồng [17]. 1.7. Kỹ thuật LAMP LAMP là viết tắt của từ “Loop-Mediated Isothermal Amplification” có nghĩa là sự khuếch đại DNA ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng hay móc (Loop). LAMP được phát triển đầu tiên vào năm 2000 bởi nhóm tác giả Notomi T. và cộng sự. Đây là một phương pháp khuếch đại DNA có tính đặc hiệu, hiệu quả cao và thời gian ngắn bằng cách tận dụng ưu điểm của enzyme Bst DNA polymerase và 4 mồi được thiết kế đặc biệt để nhận biết 6 vùng trình tự khác nhau trên DNA đích [37]. Dù mới được phát minh nhưng LAMP được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực như chẩn đoán mầm bệnh, virus trong thủy sản, phát hiện nhanh vi sinh vật trong thực phẩm, môi trường… LAMP là một phương pháp khuếch đại gen tiềm năng có nhiều hứa hẹn nếu tiếp tục được nghiên cứu và thử nghiệm để áp dụng vào những hướng nghiên cứu mới [3], [34]. 1.7.1. Nguyên lý kỹ thuật LAMP Phương pháp này dựa trên sự tổng hợp DNA thay thế chuỗi tự xoay vòng, được thực hiện bởi một DNA polymerase và cặp mồi ngoài và cặp mồi trong được thiết kế đặc biệt. Ở các bước đầu của phản ứng LAMP cả 4 mồi được sử dụng, 12