Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp HPLC

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:86

Thêm vào BST

Báo xấu

89
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là lập được một số hoạt chất chính trong cây hương thảo dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng các hoạt chất đó, xây dựng được quy trình định lượng các hoạt chất chính trong cây hương thảo bằng phương pháp HPLC ứng dụng xác định, đánh giá hàm lượng các hoạt chất chính trong một số mẫu hương thảo ở các vùng khác nhau.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp HPLC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ OANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ OANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS. Tạ Thị Thảo 2. TS. Lê Thị Huyền Hà Nội - 2020
LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS. TS. Tạ Thị Thảo và TS. Lê Thị Huyền - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô trong bộ môn hoá phân tích và các cán bộ phòng đào tạo sau đại học của trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển đã quan tâm giúp đỡ, với những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 10 năm 2020 Học viên Lê Thị Oanh
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC ...................................................................................................................i MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2 1.1. Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae) 2 1.2. Chi Rosmarinus 2 1.3. Loài Hương thảo (R. officinalis L.) 3 1.3.1. Đặc điểm thực vật .....................................................................................3 1.3.2. Nguồn gốc phân bố ...................................................................................4 1.3.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học ...........................................4 1.3.4. Công dụng và hoạt tính sinh học loài R. officinalis ..................................9 1.4. Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học của loài R. officinalis 11 1.4.1. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu ..............11 1.4.2. Các nghiên cứu về xác định thành phần hóa học trong loài R. officinalis ………………………………………………………………………….12 1.4.3. Các phương pháp chiết tách chất phân tích ra khỏi mẫu dược liệu ........14 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................. 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 16 2.2.1. Chất chuẩn ............................................................................................... 16 2.2.2. Các hoá chất khác....................................................................................17 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Phương pháp phân tách các dịch chiết và phân lập các hợp chất ...........18 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các chất .................................................21 2.3.3. Tối ưu hóa điều kiện hệ thống sắc ký .....................................................21 2.3.4. Phương pháp xử lý mẫu ..........................................................................22 2.4. Đánh giá phương pháp phân tích 25 2.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký.........................................................25 i
2.4.2. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu ....................................................................25 2.4.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ........................................................26 2.4.4. Độ lặp lại của phương pháp ....................................................................26 2.4.5. Độ đúng (đánh giá qua độ thu hồi).......................................................... 27 2.5. Phân tích mẫu thực tế 28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 29 3.1. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được 29 3.2. Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký 33 3.2.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện tách trên hệ sắc ký HPLC .......................... 33 3.2.2. Xây dựng các phương trình đường chuẩn ...............................................37 3.3. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu R. officinalis 42 3.3.1. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết ..................................................................42 3.3.2. Khảo sát phương pháp chiết ....................................................................43 3.4. Đánh giá phương pháp phân tích 46 3.4.1. Đánh giá tính phù hợp của hệ thống sắc ký ............................................46 3.4.2. Độ đặc hiệu.............................................................................................. 47 3.4.3. Độ lặp lại của phương pháp ....................................................................48 3.4.4. Độ đúng của phương pháp ......................................................................49 3.5. Định lượng bốn hoạt chất chính trên mẫu thực 51 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 55 PHỤ LỤC ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13 C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng t hạt nhân carbon resonance spectroscopy 13 1 H-NMR Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng t hạt nhân proton resonance spectroscopy ACN Acetonitrile Acetonitrile CDL Limit of detection of calibration Giới hạn phát hiện của đường chuẩn CDQ Limit of quantitation of Giới hạn định lượng của đường calibration chuẩn DAD Diod Array Detector Detector mảng diod EtOH Ethanol Ethanol EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetate HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography MeOH Methanol Methanol R2 Correlation coefficient Hệ số tương quan RO1 7α-methoxyrosmanol 7α-methoxyrosmanol RO2 Carnosol Carnosol RO3 Demethylsalvicanol Demethylsalvicanol RO4 Rosmarinoside A Rosmarinoside A RO5 Sageone Sageone RO6 20-deoxocarnosol 20-deoxocarnosol RO7 11,12,20-trihydroxy-abieta- 11,12,20-trihydroxy-abieta-8,11,13- 8,11,13-triene triene RO8 Rosmanol Rosmanol RO9 7 -methoxyrosmanol 7 -methoxyrosmanol RO10 7α-ethoxyrosmanol 7α-ethoxyrosmanol RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SKĐ Sắc ký đồ v/v Volume/volume Thể tích/thể tích iii
DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2. 1. Các mẫu R. officinalis dùng trong nghiên cứu .............................................................. 16 Bảng 3. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RO1 và hợp chất tham khảo..................................... 30 Bảng 3. 2. Các hợp chất RO1-RO5 phân lập t loài R. officinalis ................................................ 31 Bảng 3. 3. Các hợp chất RO6-RO10 phân lập t loài R. officinalis .............................................. 32 Bảng 3. 4. Hệ gradient với pha động MeOH/H2O và ACN/ H2O. ............................................... 35 Bảng 3. 5. Thông số đánh giá pic các chất định phân trong các điều kiện rửa giải..................... 35 Bảng 3. 6. Ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột đến thông số pic các chất ........................ 36 Bảng 3. 7. Hệ gradient chạy HPLC ................................................................................................... 37 Bảng 3. 8. Khoảng tuyến tính RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................. 38 Bảng 3. 9. Giá trị hệ số b’ .................................................................................................................... 40 Bảng 3. 10. Các đại lượng thống kê................................................................................................... 40 Bảng 3. 11. Phương trình đường chuẩn của các chất ...................................................................... 41 Bảng 3. 12. CDL và CDQ của RO1, RO3, RO9 và RO10 bằng HPLC-DAD .......................... 41 Bảng 3. 13. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống.............................................................. 46 Bảng 3. 14. Thời gian lưu mẫu đối chiếu và mẫu thử ..................................................................... 48 Bảng 3. 15. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu RO1.................................. 49 Bảng 3. 16. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực................................... 49 Bảng 3. 17. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ............................................................... 50 Bảng 3. 18. Kết quả định lượng bốn hoạt chất trong một số mẫu lá và thân R. officinalis ........ 52 iv
DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. 1. Cây Bạc hà (Mentha arvensis) ........................................................................................... 2 Hình 1. 2. Cây Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) ........................................................................ 2 Hình 1. 3. Loài Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) .................................................................. 3 Hình 1. 4. Cấu trúc của một số terpene phân lập t loài R. officinalis............................................. 6 Hình 1. 5. Cấu trúc của một số flavonoid phân lập t loài R. officinalis......................................... 8 Hình 1. 6. Cấu trúc của một số phenolic phân lập t loài R. officinalis .......................................... 8 Hình 2. 1. Sơ đồ phân lập các hợp chất t loài R. officinalis................................... 20 Hình 3. 1. Công thức cấu tạo chất RO1 ………………………………………….. 29 Hình 3. 2. Khảo sát bước sóng phát hiện tối ưu của các chất ......................................................... 33 Hình 3. 3. Sắc ký đồ ứng với điều kiện sắc ký lựa chọn được ....................................................... 37 Hình 3. 4. Đường chuẩn các chất RO1, RO3 ................................................................................... 38 Hình 3. 5. Đường chuẩn các chất RO9, RO10................................................................................. 39 Hình 3. 6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng RO1, RO3, RO9 và RO10 ...................................................................................................................................................... 42 Hình 3. 7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................................................................................. 43 Hình 3. 8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................................................................................. 44 Hình 3. 9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dung môi chiết/khối lượng dược liệu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10..................................................................................... 45 Hình 3. 10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết hồi lưu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................................................................................. 46 Hình 3. 11. SKĐ của chất đối chiếu RO1, RO3, RO9, RO10....................................................... 47 Hình 3. 12. SKĐ của mẫu thử ............................................................................................................ 48 v
MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên có nguồn dược liệu rất phong phú và đa dạng. Nhân dân ta t lâu đã biết dùng cây cỏ để chữa bệnh và phòng bệnh, nhưng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian tùy theo t ng địa phương. Phần lớn các cây thuốc Việt Nam chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhất là về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và hàm lượng các hoạt chất do đó chưa có được các cơ sở khoa học để tạo được các sản phẩm ứng dụng mới trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm và nông nghiệp. Trong số đó có cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) là một loại cây có nhiều ứng dụng trong cuộc sống. Nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng nó có các khả năng như chống oxi hóa, kháng viêm và chống ung thư, ức chế mạnh sự tăng trưởng tế bào trong tất cả các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, có tác dụng hạ đường huyết, kích thích hệ thần kinh.... Với mong muốn tìm hiểu về chất lượng cây Hương thảo, chúng tôi lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây Hƣơng thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phƣơng pháp HPLC‖. Mục tiêu nghiên cứu: - Phân lập được một số hoạt chất chính trong cây Hương thảo dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng các hoạt chất đó. - Xây dựng được quy trình định lượng các hoạt chất chính trong cây Hương thảo bằng phương pháp HPLC. - Ứng dụng xác định, đánh giá hàm lượng các hoạt chất chính trong một số mẫu Hương thảo ở các vùng khác nhau. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae) Họ Hoa môi (Lamiaceae) còn được gọi bằng nhiều tên khác như họ Húng, họ Bạc hà…là một họ thực vật có hoa [32]. Chúng phân bố rộng khắp trên toàn cầu nhưng tập trung chủ yếu ở Địa Trung Hải. Một số loài là cây bụi hay cây gỗ, hiếm gặp hơn là các dạng dây leo. Chúng có lá đối xứng và xếp chồng chéo hình chữ thập hay mọc vòng, thân cây thường hình vuông, có nhiều lông tuyến, nơi giải phóng những hợp chất thơm mà ta ngửi thấy. Các loài thực vật trong họ này nói chung có hương thơm trong mọi phần của cây và nhiều loại cây thân thảo được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực và dùng làm thuốc như: Húng quế, Bạc hà (hình 1.1), Hoàng cầm (hình 1.2) Hương thảo (hình 1.3), Xô thơm, Tía tô... Bên cạnh những loài lấy lá để ăn, làm gia vị còn một số loài được trồng làm cảnh như húng chanh. Một số loài khác được trồng vì mục đích lấy hạt (chứ không phải lá) làm thực phẩm như hạt cây chia [32]. Trên thế giới, Lamiaceae có khoảng 245 chi và 7886 loài khác nhau. Ở Việt Nam có trên 40 chi và khoảng 145 loài. Chi Rosmarinus có khoảng 40 loài, chi Thymus có khoảng 350 loài và hầu hết chúng sống ở Châu Á. Có khoảng 150 loài điển hình của chi Ocimum được biết đến sinh sống ở Ấn Độ, còn ở Châu Âu có 15- 20 loài, Có hơn 100 loài thuộc chi Phlonis, 40-50 loài thuộc chi Lamuim,...[30, 31]. Hình 1. 1. Cây Bạc hà Hình 1. 2. Cây Hoàng cầm (Mentha arvensis) (Scutellaria baicalensis) 1.2. Chi Rosmarinus Rosmarinus là một chi trong họ hoa môi Lamiaceae, nhóm thực vật có hoa. Là loại cây bụi sống lâu năm có bộ lá thơm và hoa màu xanh tím. 2
Chi Rosmarinus được tìm thấy ở vùng Địa Trung Hải, một phần ở phía nam bờ biển Châu Âu, Bắc Mĩ và phía đông Ai Cập, cũng như Cilicia. Chúng được biết đến với mục đích dùng làm thuốc, nấu nướng, mỹ phẩm và trang trí. Chúng được sử dụng t rất sớm bởi người La Mã, Hy Lạp và Ai Cập. Rosmarinus được xem là một trong những loài thực vật có ích nhất vùng Địa Trung Hải. Có khoảng 40 loài trong chi Rosmarinus, tuy nhiên chỉ có 6 loài được chấp nhận tên: R. officinalis L., R. eriocalyx Jord. & Fourr., R. eriocalyx var. pallescens (Maire) Upson & Jury, R. x lavandulaceus Noë, R. x mendizaballii Sagredo ex Rosua, R. tomentosus Hub. -Mor. & Maire. Mỗi loài có đặc điểm khác nhau nhưng quan trọng nhất, nhiều lợi ích nhất là R. officinalis L. [16, 31]. 1.3. Loài Hƣơng thảo (R. officinalis L.) 1.3.1. Đặc điểm thực vật a) Cây Hương thảo b) Lá Hương thảo khô c) Thân Hương thảo khô Hình 1. 3. Loài Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) Họ: Lamiaceae Chi: Rosmarinus Tên khoa học: Rosmarinus officinalis L. Tên thƣờng gọi: Cây Hương thảo, cây Dương chổi Mô tả về thực vật: Cây nhỏ cao 1- 2 m, phân nhánh và mọc thành bụi. Lá R. officinalis nhiều, hẹp, hình dải, dai, có mép gập xuống, không cuống, màu xanh sẫm và nhẵn ở trên, phủ lông rải rác màu trắng ở mặt dưới. Hoa xếp 2 - 10 ở các vòng lá, dài cỡ 1 cm, màu lam nhạt hơi có màu hoa cà với những chấm tím ở phía trong các 3
thùy. Toàn cây có mùi rất thơm. Mùa nở hoa vào khoảng t tháng 3 đến tháng 5 [10]. 1.3.2. Nguồn gốc phân bố R. officinalis là loài cỏ thơm ở vùng Địa Trung Hải, được trồng nhiều ở Nam Âu, Tây Á và Bắc Phi trước đây. Nó mọc hoang dại dọc theo phía bắc và phía nam bờ biển Địa Trung Hải và cũng trong khu vực tiểu vùng Himalaya. Nó được trồng t những ngày xa xưa ở nước Anh, Đức, Pháp, Trung Mỹ, Venezuela . Tại Việt Nam, cây được nhập trồng ở một số tỉnh miền núi trung du phía Bắc, miền Trung và miền Nam.Thường trồng bằng cách giâm cành hay gieo hạt. Cây thích hợp với khí hậu khô ráo, nhiều nắng nhưng không quá nóng. Đất trồng phải thoát nước tốt. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng trong loài R. officinalis chứa chủ yếu các thành phần là terpene, flavonoid, tinh dầu và các phenolic acid. Ngoài ra cây còn chứa các acid hữu cơ (citric, glyconic,...) Các hợp chất terpene là nhóm hợp chất tự nhiên mà phân tử của nó được cấu tạo bởi một hoặc nhiều đơn vị isoprene (C5H8) và có chung 1 gốc sinh tổng hợp. Có thể chia thành terpenoid mạch vòng và terpenoid mạch th ng. Ngoài ra dựa vào số đơn vị isoprene, người ta chia thành monoterpene (C10), sesquiterpene (C15), diterpene (C20), triterpene (C30), tetraterpene (C40). Cấu trúc của một số loại terpene như diterpene, triterpene, phenolic diterpene,… trong loài R. officinalis đã được xác định như: 7-methoxyrosmanol (1), betulin (2) [9]; oleanolic acid (3), ursolic acid (4) [27]; carnosic acid (5), carnosol (6), 12-O-methylcarnosic acid (7) [21]; 12-methoxy-trans-carnosic acid (8), 12- methoxy-cis-carnosic acid (9) [45]; seco-hinokiol (10) [17]; 7β-methoxy-abieta- 8,13-diene-11,12-dione-(20,6β)-olide (11), 7α-methoxyabieta-8,13-diene-11, 12- dione-(20,6β)-olide (12), royleanolic acid (13), rosmanol (14), betulinic acid (15), 23-hydroxybetulinic acid (16), rofficerone (17) [39]; epirosmanol (18), methyl carnosate (19) [59]; rosmariquinone (20) [29]; rosmadial (21) [43]; isorosmanol (22), 11,12-di-O-methoxy isorosmanol (23) [42]. Cấu trúc của các chất này xem trong hình 1.4. 4
5
Hình 1. 4. Cấu trúc của một số terpene phân lập t loài R. officinalis Các hợp chất flavonoid Flavonoid có mặt trong hầu hết các bộ phân của các loài thực vật bậc cao, đặc biệt là hoa, tạo cho hoa những màu sắc rực rỡ thu hút các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây. Flavonoid là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon, là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong dược liệu có nguồn gốc thực vật. Phần lớn chúng có màu vàng, ngoài ra còn có những chất màu xanh, tím, đỏ hoặc không màu. Các flavonoid đã được phân lập t loài R. officinalis như: genkwanin (24), isocutellarein 7-O-glucoside (25), 6''-O-(E)-feruloylhomoplantaginin (26), 6''-O- (E)-feruloylnepitrin (27), 6''-O-(E)-p-coumaroylnepitrin (28), 6-methoxyluteolin-7- 6
glucopyranoside (29), luteolin 3'-O-β-D-glucuronide (30), luteolin 3'-O-(3''-O- acetyl)-β-D-glucuronide (31), kaempferol (32), luteolin (33), ladanein (34), hispiduline (35), diosmethine (36), diosmine (37), sinensetine (38), homoplantaginin (39), eriocitrin (40), gallocatechin (41), hesperidin (42), acacetin (43), cirsimaritin (44) [11, 13, 15, 21, 22, 36, 44]. Cấu trúc của các chất này xem trong hình 1.5. 7
Hình 1. 5. Cấu trúc của một số flavonoid phân lập t loài R. officinalis Các hợp chất phenolic Bên cạnh các hợp chất terpene và flavonoid đã được phân lập, các phenolic cũng được tìm thấy trong loài R. officinalis như: rosmanic acid (45), rosmarinic acid (46), caffeic acid (47), 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-β-D-glucopyranose (48), 1-O- feruloyl-β-D- glucopyranose (49) [11, 21, 28]. Hình 1. 6. Cấu trúc của một số phenolic phân lập t loài R. officinalis 8
Nhƣ vậy: Tổng hợp các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy, thành phần hoá học trong loài R. officinalis rất đa dạng và phong phú, góp phần tạo cơ sở khoa học lý giải cho việc sử dụng cây này để chữa bệnh trong y học cổ truyền. 1.3.4. Công dụng và hoạt tính sinh học loài R. officinalis Loài R. officinalis có vị chát, mùi thơm nồng, tính ấm nóng. Người ta thường dùng R. officinalis trong các trường hợp như: cơ thể suy nhược, choáng do huyết áp thấp, người mệt yếu do tuần hoàn kém, mau quên, ăn uống không tiêu, đau nhức cơ, thấp khớp, viêm họng, nhức đầu, căng th ng thần kinh, chống rụng tóc, mau mọc tóc. Được dùng dưới các dạng: ngâm rượu (cồn thuốc), nước hãm hoặc chiết tinh dầu để xoa bóp ngoài da. Qua nghiên cứu, các nhà khoa học đã cho thấy rằng các hợp chất trong loài R. officinalis có nhiều hoạt tính sinh học như:  Hoạt tính chống oxi hóa Năm 2013, Xiaoqiang Chen cùng các cộng sự tiến hành thử nghiệm song song hoạt tính chống oxi hóa của tinh dầu R. officinalis trong dầu hướng dương được lưu giữ ở 60°C và việc sử dụng chất chống oxi hóa tổng hợp là butylat hydroxyanisol (BHA), butylat hydroxytoluene (BHT) và tert-butylhroquinon (TBHQ). Kết quả thu được là tinh dầu R. officinalis có tính oxi hóa rất mạnh, gần bằng chất chống oxi hóa tổng hợp (BHA và BHT) [18]. Các hợp chất phenolic diterpene như carnosol (6), rosmanol (14), carnosic acid (5),.....và phenolic acid như rosmarinic (46), caffeic acid (47) được phân lập t R. officinalis, trong đó carnosic acid (5) và carnosol (6) được công nhận là có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, chống lại các gốc tự do [54, 55].  Hoạt tính chống viêm Năm 2013, các nghiên cứu của Salvan da Rosa đã sử dụng các mô hình thí nghiệm và các thử nghiệm in vitro trên chuột. Kết quả cho thấy trong thành phần hóa học phân lập của R. officinalis thì carnosol (6) và axit rosmarinic (46) có hoạt tính kháng viêm rất mạnh trong mô mỡ do carrageenan gây ra. Bằng cách ức chế bạch cầu, bạch cầu trung tính và giảm tiết dịch dẫn đến giảm giải phóng nitricoxide (chất trung gian gây viêm tiền liệt). Hai hợp chất này có khả năng chống viêm bằng cách ức chế phản ứng miễn dịch bẩm sinh, ngăn ng a các bệnh lý viêm và tự miễn dịch [20]. 9
 Khả năng kháng khuẩn Pinene, verbenone, bornyl acetate là thành phần tinh dầu trong R. officinalis cho thấy hoạt động kháng khuẩn, chống lại cả vi khuẩn Gram (+) (Staphylococcus aureus, S. epidermidis) và Gram (-) (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) [8]. Theo nghiên cứu của S. Tavassoli, trong dịch chiết MeOH t lá R. officinalis chứa các thành phần chống vi khuẩn. Chống lại các chủng vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus delbruekii, Saccharomyces cerevisia và Candida krusei (Issatchenikia orientalis) [51]. Rosmarinic acid (46) và carnosic acid (5) theo nghiên cứu của Zampini chống lại 37 chủng vi khuẩn. Carnosic acid (5) ngăn cản Staphylococcus aureus methicillin-resistant và Enterococcus faecalis gentamicin cũng như các dòng vi khuẩn Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morganii and Providencia stuartii [58].  Khả năng chống ung thư Năm 2014, Margarita Gonzalez và các cộng sự nghiên cứu hoạt tính chống lại ưng thư vú ở người của các hợp chất được phân lập t dịch chiết của R. officinalis. Kết quả cho thấy sau khi sử dụng dịch chiết R. officinalis (SFRE), thể hiện sự chống lại các tế bào ung thư vú t các phân nhóm khối u khác nhau và sự điều hòa của các thụ thể ER- và HER2. Hơn nữa, SFRE làm tăng đáng kể hiệu quả của hóa trị liệu ung thư vú (tamoxifen, trastuzumab và aclitaxed) [25]. Chiết xuất t lá R. officinalis đã được chứng minh có tác dụng chống lại các tế bào ung thư biểu mô, hạn chế sự tăng sinh tế bào ung thư gan ở người. Một số chất có tác dụng như: carnosol (6), carnosic acid (5) và rosemanic acid (45) đã được phân lập t loài R. officinalis [54]. Jóseph Tai nghiên cứu, đánh giá hoạt tính chống sự phân bào của tế bào ung thư buồng trứng. Kết quả cho thấy carnosic acid (5) và rosmarinic acid (46) có trong R. officinalis có hoạt tính chống tăng sinh trên 2 dòng tế bào ung thư buồng trứng người A2780 và ARL80CP70 vớ IC50 ước tính lần lượt là 1/1000 và 1/400 [50]. Ngoài ra carnosic acid (5) còn có khả năng ức chế 3 dòng tế bào Caco-2, HT29 và LoVo của ung thư trực tràng với giá trị IC50 nằm trong khoảng t 24- 96 [12].  Cải thiện chức năng thận, giải độc gan, hạ đường huyết 10
Theo Zheng Tu và các cộng sự, sự rối loạn chuyển hóa như béo phì và tiểu đường đang gia tăng. Chiết xuất R. officinalis giúp giảm lượng đường và cholesterol trong máu bằng cách tăng cường tiêu thụ glucose trong tế bào HepG2 đồng thời phosphoryl hóa của AMP được hoạt hóa nhờ enzym AMP-activated protein kinase (AMPK) và chất nền acetyl-coA carboxylase (ACC) làm tăng glycolysis gan và oxy hóa acid béo [53]. Nghiên cứu cho thấy các hợp chất phenolic trong R. officinalis giúp cải thiện khả năng phòng, chống oxy hóa ở các mô khác nhau và giảm lượng cholesterol trong máu [4].  Ảnh hưởng lên hệ thần kinh trung ương, hệ hô hấp Theo nghiên cứu của Machado, ursolic acid (4), carnosol (6) và betulinic acid (15) thông qua sự kích hoạt các thụ thể dopamin D1 và D2 tương tác với hệ thống dopaminegic có tác dụng chống trầm cảm [37, 38]. Luteolin (33), carnosic acid (5) và rosmarinic acid (46) phân lập t R. officinalis có tác dụng giảm đau, điều tiết monoaminergic và cholinergic. Chúng tác động đến thần kinh và cải thiện cholinergic ở tế bào PC12, các chất dẫn truyền thần kinh: dopamine, norepinephrine, serotonin và acetylcholine được thử nghiệm ở chuột [46]. Nhƣ vậy: Với nhiều công dụng và hoạt tính sinh học, nhu cầu sử dụng loài R. officinalis của người tiêu dùng ngày càng lớn và các sản phẩm t R. officinalis ngày càng xuất hiện nhiều. Nhằm kiểm soát chất lượng của loài R. officinalis, các sản phẩm t loài R. officinalis để đảm bảo sức khỏe, lợi ích cho người tiêu dùng thì việc kiểm tra chất lượng là vô cùng quan trọng. 1.4. Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học của loài R. officinalis 1.4.1. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu Dược liệu là đối tượng phân tích có thành phần nền phức tạp. Trong dược liệu có một hỗn hợp các chất có tính chất giống nhau (terpene, flavonoid, anthraquinon...). Các chất trong cùng một nhóm chất thì giống nhau khung cơ bản, khác nhau ở một vài nhóm thế hoặc các thành phần khác, tức là khác nhau không nhiều về tính chất vật lý, tính chất hóa học. Vì vậy, việc sử dụng các phương pháp quang phổ (UV-VIS, IR, huỳnh quang) để phân tích định lượng các hoạt chất trong dược liệu sẽ gặp nhiều khó khăn và hầu như là không thể thực hiện được. 11
Hiện nay, trong phân tích hiện đại thì sắc ký là một trong những phương pháp xác định hàm lượng các chất thông dụng nhất. Người ta có thể định lượng một chất hay định lượng đồng thời nhiều chất trong một lần định lượng nếu chọn được điều kiện thích hợp. Các phương pháp sắc ký thường dùng là: sắc ký khí (GC), sắc ký điện di, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Trong đó HPLC là phương pháp có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là có thể phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với sắc ký khí (thường dùng với các đối tượng dễ bay hơi). Có thể dùng HPLC để phân tích các chất t phân cực tới không phân cực, t các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, t các chất trung tính tới các chất điện ly,… Với pha tĩnh ngày càng được hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, HPLC ngày nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt [2]. Với mục tiêu đặt ra là xây dựng một phương pháp phân tích định lượng nhanh, chính xác các hoạt chất chính trong loài R. officinalis L. chúng tôi lựa chọn phương pháp nghiên cứu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 1.4.2. Các nghiên cứu về xác định thành phần hóa học trong loài R. officinalis Trên thế giới đã có các nghiên cứu về phân lập, định lượng các chất trong loài R. officinalis sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau: 1.4.2.1. HPLC-UV Rất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã áp dụng kỹ thuật HPLC-UV trong xây dựng phương pháp định tính, định lượng và đánh giá chất lượng loài R. officinalis. Năm 2013, Hcini và các cộng sự đã tiến hành định tính và định lượng rosmarinic acid (46), carnosol (6), carnosic acid (5), là các hoạt chất chính trong R. officinalis bằng HPLC. Các điều kiện phân tích: sử dụng cột pha đảo ZORBAX SB- C18 (4,6 mm 125 mm; 5 μm), pha động được dùng là acetonitril (A) và nước đã được acid hóa chứa 5% acid formic (B). Hệ gradient là 0 phút: 5%A; 10 phút: 15%A; 30 phút: 25%A; 35 phút: 30%A; 50 phút: 55%A; 55 phút: 90%A; 57 phút: 100%A; tốc độ dòng chảy: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μl, detector tử ngoại khả kiến UV-Vis loại DAD, bước sóng được phát hiện tại 280 và 330 nm [28]. Năm 2018, Tawfeeq cùng với các cộng sự đã phân tích định tính và định lượng rosmarinic acid (46) trong lá R. officinalis bằng HPLC. Với điều kiện: cột pha đảo ODS-C18 (250 mm 4,6 mm), pha động: 80% methanol và 20% nước (chứa 12