intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Tạo giống lúa Kitaake tăng cường biểu hiện hoặc bất hoạt gen ANK1, ANK2 liên quan đến cấu trúc bông lúa

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:78

Thêm vào BST
Báo xấu
21
lượt xem 4
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là thiết kế được cấu trúc vector làm tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 và chuyển thành công vào giống lúa Kitaake; thiết kế được cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) để bất hoạt gen ANK1, ANK2 bằng công nghệ CRISPR/Cas9 và chuyển thành công vào giống lúa Kitaake; chọn lọc được các dòng lúa chuyển gen đơn bản, đồng hợp tử và đánh giá mức độ biểu hiện gen và đột biến gen trong cây chuyển gen

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Tạo giống lúa Kitaake tăng cường biểu hiện hoặc bất hoạt gen ANK1, ANK2 liên quan đến cấu trúc bông lúa

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---  --- LÊ THỊ NHƯ TẠO GIỐNG LÚA KITAAKE TĂNG CƯỜNG BIỂU HIỆN HOẶC BẤT HOẠT GEN ANK1, ANK2 LIÊN QUAN ĐẾN CẤU TRÚC BÔNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, tháng 11/2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---  --- Lê Thị Như TẠO GIỐNG LÚA KITAAKE TĂNG CƯỜNG BIỂU HIỆN HOẶC BẤT HOẠT GEN ANK1, ANK2 LIÊN QUAN ĐẾN CẤU TRÚC BÔNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 8420101.21 Cán bộ hướng dẫn: TS. Khổng Ngân Giang TS. Trần Đức Long Hà Nội, tháng 11/2019
  3. Lê Thị Như – K26CH LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài này là do chính tôi thực hiện, số liệu và kết quả nghiên cứu là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho luận văn này đều được cảm ơn và các thông tin trích dẫn đều được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 15 tháng 01 năm 2020 Lê Thị Như i
  4. Lê Thị Như – K26CH LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành của tôi tới TS. Khổng Ngân Giang. Với sự kiên nhẫn và hiểu biết của mình, cô là người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện khóa luận tại Phòng thí nghiệm « Nghiên cứu di truyền chức năng hệ gen cây lúa, cà phê và tương tác với vi sinh vật » (LMI-RICE2), Viện Di truyền Nông nghiệp. Tôi xin cảm ơn TS. Tạ Kim Nhung vì những kiến thức chuyên môn và sự động viên, khuyến khích với tôi từ những ngày đầu tôi đến thực tập tại LMI. Tôi cảm thấy rất may mắn và biết ơn khi được làm việc dưới sự hỗ trợ của hai cô. Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của tất cả anh chị, bạn bè đang làm việc tại phòng thí nghiệm LMI-RICE2. Xin cảm ơn thầy Stephane Jouannic, chị Phạm Thị Mai, chị Nguyễn Thị Mỹ Lệ nhóm « Cấu trúc bông lúa », tôi đã học được rất nhiều điều về kiến thức chuyên môn và các vấn đề trong cuộc sống. Tôi xin cảm ơn chân thành tới TS. Trần Đức Long, bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN. Thầy là người đã giúp đỡ cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Tôi xin cảm ơn thầy cô tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã cho tôi những kiến thức cơ bản đầu tiên để tôi có thể thực hiện khóa luận này. Tôi xin cảm ơn Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), Trung tâm Nghiên cứu phát triển (IRD) Pháp, Quỹ học bổng NAGAO đã hỗ trợ kinh phí cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này. Nghiên cứu này nằm trong khuôn khổ đề tài « Nghiên cứu liên kết trên toàn hệ gen các tính trạng ảnh hưởng đến năng suất của tập đoàn lúa Việt Nam, phục vụ chương trình chọn tạo giống lúa bản địa » mã số 106-NN.02-2016.60 do Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ. Cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lời cảm ơn tới sự động viên, thấu hiểu và ủng hộ từ gia đình, bạn bè tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm Học viên cao học (ký tên) ii
  5. Lê Thị Như – K26CH MỤC LỤC MỞ ĐẦU....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 3 1.1. Cấu trúc bông lúa ........................................................................................... 3 1.1.1 Cấu trúc bông và sự hình thành bông từ các mô phân sinh .........................................3 1.1.2 Các nghiên cứu về cơ sở di truyền kiểm soát cấu trúc bông lúa .................................4 1.2 Phương pháp phân tích liên kết trên toàn hệ gen (GWAS), công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cơ sở di truyền của các tính trạng nông học ...................................... 6 1.3 Tổng quan về motif ankyrin (ANK), cấu trúc gen ANK1, ANK2 ở lúa ............ 7 1.3.1 Motif ankyrin ..................................................................................................................7 1.3.2 Phân tích tin sinh gen ANK1, ANK2..............................................................................9 1.4 Nghiên cứu chức năng gen ở thực vật bằng phương pháp chuyển gen .......... 10 1.5 Bất hoạt gen bằng công cụ CRISPR/Cas9 .................................................... 14 1.5.1. Hệ thống CRISPR/Cas9.............................................................................................. 14 1.5.2. Chỉnh sửa đa điểm bằng các cấu trúc polycistronic tRNA-gRNA .......................... 17 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 19 2.1. Vật liệu………………………………………………………………………19 2.1.1. Vật liệu thực vật ........................................................................................................... 19 2.1.2. Plasmid ........................................................................................................................ 19 2.1.3. Các chủng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy ............................................................. 20 2.2. Phương pháp ................................................................................................ 20 2.2.1. Phương pháp khử trùng hạt......................................................................................... 20 2.2.2. Thiết kế mồi ................................................................................................................. 20 2.2.3. Tách chiết DNA, RNA, tổng hợp cDNA................................................................... 23 2.2.4. Phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 ..................................................... 24 2.2.5. Đưa đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector pGEM-T Easy ................ 25 2.2.6. Ghép nối đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector PC5300.OE ............ 26 2.2.7. Thiết kế cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) bất hoạt gen ANK1, ANK2... 27 2.2.8. Chuyển gen vào giống lúa Kitaake sử dụng Agrobacterium.................................... 31 iii
  6. Lê Thị Như – K26CH 2.2.9. Phân tích cây chuyển gen mang cấu trúc tăng cường biểu hiện ANK1, ANK2 ....... 33 2.2.10. Chọc lọc các dòng chuyển gen đột biến bằng công nghệ CRISPR/Cas9 .............. 34 2.2.11. Các kỹ thuật khác....................................................................................................... 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 39 3.1. Tạo vector chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 ................... 39 3.1.1. Phân lập trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 .............................................................. 39 3.1.2. Nhân dòng trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector nhân dòng pGEM-T Easy.............................................................................................................................................40 3.1.3. Ghép nối trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector PC5300.OE..................... 42 3.2. Thiết kế cấu trúc PTG nhằm gây đột biến gen ANK1, ANK2 bằng công nghệ CRISPR/Cas9………………………………………………………………………44 3.2.1. Tạo các mảnh thành phần mang cấu trúc gRNA gây bất hoạt ANK1, ANK2 ........ 44 3.2.2. Sàng lọc các cấu trúc PTG ......................................................................................... 45 3.3. Chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .......................... 46 3.4. Chọn lọc các dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 ....... 47 3.4.1. Sàng lọc các dòng T0 chuyển gen, đánh giá hiệu quả chuyển gen ........................ 47 3.4.2. Chọn lọc các dòng T1 đồng hợp tử mang một bản sao T-DNA ............................ 48 3.4.3. Đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK1, ANK2 trong các dòng chuyển gen ... 50 3.5. Chọn lọc các dòng chuyển gen đột biến gen ANK1, ANK2 bằng công nghệ CRISPR/Cas9………………………………………………………………………52 3.5.1. Sàng lọc các dòng chuyển gen T0 mang cấu trúc chuyển gen ............................... 52 3.5.2. Sàng lọc các dòng chuyển gen T0 đột biến gen ANK1, ANK2............................... 53 3.5.3. Chọn lọc các dòng T1 đột biến đồng hợp ................................................................ 55 KẾT LUẬN...............................................................................................................59 KIẾN NGHỊ..............................................................................................................60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 61 PHỤ LỤC. DANH SÁCH CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG ................................ 68 iv
  7. Lê Thị Như – K26CH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ANK Ankyrin cDNA complementary DNA (DNA bổ sung) CRISPR Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (Các đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên) DNA Deoxyribonucleic acid (AND) GBS Genotyping by sequencing (Giải trình tự) gDNA Genomic DNA (AND hệ gen) gRNA guide RNA (ARN dò) GWAS Genome wide association study (Nghiên cứu liên kết trên toàn hệ gen) NST Nhiễm sắc thể PAM Protospacer adjacent motif (vùng AND nằm cạnh trình tự đích) PCR Polymerase chain reaction (Chuỗi phản ứng khuếch đại) PTG Polycistronic tRNA-gRNA (Đoạn xen kẽ tARN và ARN dò) qRT-PCR quantitative real-time PCR (Phản ứng PCR định lượng) QTL Quantitive trait loci (lô-cút tính trạng số lượng) RNA Ribonucleic acid (ARN) SBN Secondary branch number (Số nhánh thứ cấp) SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide) SpN Spikelet number (Số hoa) v
  8. Lê Thị Như – K26CH DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc bông lúa (A) và sự thay đổi qua quá trình thuần hóa (B) [46]....... 3 Hình 2. Các giai đoạn hình thành bông lúa non [40] ............................................... 4 Hình 3. Tương tác di truyền kiểm soát sự phát triển bông lúa [17] ......................... 5 Hình 4. Biểu hiện của ANK1, ANK2 ở hai nhóm lúa có cấu trúc bông tương phản .. 7 Hình 5. Sơ đồ mô phỏng cấu trúc các kiểu protein ANK1 (A), ANK2 (B) tạo ra từ các mRNA khác nhau ............................................................................................ 10 Hình 6. Chỉnh sửa gen với hệ thống CRISPR/Cas9 [43] ....................................... 16 Hình 7. Cấu trúc PTG cho phép sản xuất nhiều gRNA [42] .................................. 18 Hình 8. Cấu trúc các vector pGEM-T Easy (A), PC5300.OE (B), pGTR (C) và vector pRGEB32 (C). ............................................................................................ 20 Hình 9. Sơ đồ vị trí gắn mồi dùng phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1 (A), ANK2 (B) .............................................................................................................. 25 Hình 10. Phản ứng tái tổ hợp giữa vector pGEM-T_CDS_ANK và vector PC5300.OE ........................................................................................................... 26 Hình 11. Vị trí các cặp mồi sử dụng giải trình tự vector PC5300.OE .................... 26 Hình 12. Nguyên tắc tạo cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) bằng Golden Gate [42] ............................................................................................................... 29 Hình 13. Các bước cơ bản trong quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium ở lúa ... 32 Hình 14. Vị trí cặp mồi nhằm xác định đột biến xảy ra ở các dòng chuyển gen Cas9-ANK1, Cas9-ANK2 ..................................................................................... 35 Hình 15. Sản phẩm PCR phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1 và ANK2 từ mẫu bông non của giống Nipponbarre ........................................................................... 40 Hình 16. Kiểm tra vector pGEM-T tái tổ hợp bằng PCR và cắt enzyme giới hạn. . 41 Hình 17. Kết quả phân tích trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 trong vector pGEM- T Easy tái tổ hợp. .................................................................................................. 42
  9. Lê Thị Như – K26CH Hình 18. Kiểm tra vector PC5300.OE tái tổ hợp bằng PCR (A, C) và cắt enzyme giới hạn EcoRI (B,D). ............................................................................................ 43 Hình 19. Kết quả PCR khuếch đại các mảnh thành phần tạo cấu trúc bất hoạt ANK1, ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2. ............................................. 44 Hình 20. Kết quả sàng lọc các dòng E.coli mang cấu trúc PTG bất hoạt ANK1, ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2. ........................................................ 45 Hình 21. Hình ảnh chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào giống lúa Kitaake. ................................................................................................................. 47 Hình 22. Kết quả sàng lọc cây chuyển gen T0 mang cấu trúc tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2................................................................................................... 48 Hình 23. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK1 trong các dòng chuyển gen T1 ................................................................................................................... 51 Hình 24. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK2 trong các dòng chuyển gen T1 ................................................................................................................... 52 Hình 25. Sàng lọc các dòng chuyển gen T0 bằng PCR.......................................... 53 Hình 26. Sàng lọc đột biến bằng PCR ................................................................... 54 Hình 27. Sự thay đổi trong trình tự DNA (A), trình tự protein (B) và cấu trúc protein (C) của các dòng đột biến của gen ANK1 ................................................... 56 Hình 28. Sự thay đổi trong trình tự DNA(A), trình tự protein (B) và cấu trúc protein của các dòng đột biến của gen ANK2 ......................................................... 57 Hình 29. Sự thay đổi trong trình tự DNA, trình tự protein và cấu trúc protein của dòng đột biến Cas9-ANK(1+2) .............................................................................. 58
  10. Lê Thị Như – K26CH DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Danh sách các mồi được sử dụng trong đề tài ........................................... 21 Bảng 2. Trình tự gRNA-spacer .............................................................................. 27 Bảng 3. Các mồi sử dụng để tạo cấu trúc PTG ....................................................... 28 Bảng 4. Các mảnh PCR thành phần cần tổng hợp với cặp mồi tương ứng .............. 30 Bảng 5. Kết quả giải trình tự các dòng plasmid mang cấu trúc bất hoạt ANK1, ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2 .................................................................... 46 Bảng 6. Kết quả đánh giá số bản sao T-DNA ở các dòng lúa chuyển gen T1 PC5300.OE-ANK1 ................................................................................................ 49 Bảng 7. Kết quả đánh giá số bản sao T-DNA ở các dòng lúa chuyển gen T1 PC5300.OE-ANK2 ................................................................................................ 50 Bảng 8. Kết quả phân tích đột biến các gen ANK1, ANK2 ở các cây chuyển gen thế hệ T0 ..................................................................................................................... 55
  11. Lê Thị Như – K26CH MỞ ĐẦU Lúa (Oryza sativa. L) là một trong những cây trồng quan trọng hàng đầu cung cấp lương thực cho hơn 50% dân số thế giới. Là quốc gia xuất khẩu gạo lớn thứ ba thế giới, sản lượng lúa gạo của Việt Nam đóng vai trò quan trọng đối với an ninh lương thực ở khu vực Châu Á (FAO, 2018). Để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ do bùng nổ dân số, đô thị hoá và những ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, dự đoán đến năm 2040 sản lượng gạo cần tăng thêm 20% (IRRI, 2018). Do đó, việc nâng cao năng suất lúa gạo trở thành mục tiêu quan trọng đối với các quốc gia trồng lúa. Cấu trúc bông lúa là một tính trạng nông học quan trọng trực tiếp ảnh hưởng đến năng suất. Việc nghiên cứu xác định các yếu tố di truyền liên quan đến cấu trúc bông luôn được quan tâm hàng đầu trong các chương trình chọn lọc và lai tạo giống lúa năng suất cao [7] . Nghiên cứu liên kết trên toàn hệ gen (Genome wide association study-GWAS) thực hiện trên một quần thể lúa bản địa Việt Nam đã xác định được QTL9 (quantitative trait loci) nằm trên NST số 2, có liên quan đến số gié thứ cấp/bông và số hoa/bông, là những tính trạng ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất lúa gạo [41]. Hai gen mã hóa protein chứa miền ankyrin (gọi là ANK1, ANK2) có biểu hiện trái ngược nhau trong hai nhóm có cấu trúc bông tương phản (bông to và bông nhỏ). Trong khi gen ANK1 biểu hiện mạnh ở nhóm lúa bông to thì gen ANK2 lại biểu hiện tăng cao ở nhóm lúa bông nhỏ. Thêm vào đó, một số đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphisms-SNPs) cũng được tìm thấy trong trình tự hai gen. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ANK1, ANK2 có thể có liên quan đến cấu trúc bông lúa. Để nghiên cứu chức năng của 2 gen này, chúng tôi đã thực hiện đề tài : ”Tạo giống lúa Kitaake tăng cường biểu hiện hoặc bất hoạt gen ANK1, ANK2 liên quan đến cấu trúc bông lúa”. Mục tiêu của đề tài : - Thiết kế được cấu trúc vector làm tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 và chuyển thành công vào giống lúa Kitaake 1
  12. Lê Thị Như – K26CH - Thiết kế được cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) để bất hoạt gen ANK1, ANK2 bằng công nghệ CRISPR/Cas9 và chuyển thành công vào giống lúa Kitaake - Chọn lọc được các dòng lúa chuyển gen đơn bản, đồng hợp tử và đánh giá mức độ biểu hiện gen và đột biến gen trong cây chuyển gen. 2
  13. Lê Thị Như – K26CH CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Cấu trúc bông lúa 1.1.1 Cấu trúc bông và sự hình thành bông từ các mô phân sinh Cấu trúc bông lúa là một trong những tính trạng hình thái quan trọng quyết định tiềm năng năng suất, được chọn lọc qua quá trình thuần hóa. Bông lúa là một cấu trúc dạng nhánh, bao gồm một trục chính, các gié sơ cấp mọc ra từ trục chính, sau đó là các gié bậc cao hơn (gié thứ cấp, tam cấp, tứ cấp) và cuối cùng là hoa, mọc trực tiếp trên các gié (Hình 1A). Số lượng hoa quyết định số lượng hạt trên bông, trực tiếp ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Quá trình phân nhánh bông phụ thuộc vào hoạt động của các tế bào gốc chồi nách trong suốt giai đoạn hình thành và phát triển sớm của bông. Cấu trúc bông lúa rất đa dạng, không chỉ trong cùng loài (giữa giống thuần và giống hoang dại) mà còn giữa các loài khác nhau (lúa châu á và lúa châu phi). Cấu trúc bông lúa ở các loài thuần chủng thay đổi từ dạng bông nhỏ, chỉ có một vài gié sơ cấp và gié thứ cấp, mang ít hạt đến dạng bông to, phân nhánh nhiều và mang nhiều hạt hơn so với các loài tổ tiên (Hình 1B) [46]. Hình 1. Cấu trúc bông lúa (A) và sự thay đổi qua quá trình thuần hóa (B) [46] n: Số hạt trên bông Bông lúa là kết quả quá trình hoạt động của các mô phân sinh, chúng được hình thành và biệt hóa liên tục trong quá trình phát triển của cây [24]. Sự hình thành bông lúa non được chia thành hai giai đoạn: Giai đoạn sớm là sự hình thành và kéo 3
  14. Lê Thị Như – K26CH dài của mô phân sinh trục (Hình 2A), hình thành các mô phân sinh gié sơ cấp (Hình 2B), kéo dài các mô phân sinh gié sơ cấp, hình thành các mô phân sinh gié cấp cao hơn (Hình 2C). Giai đoạn muộn là sự hình thành mô phân sinh hoa (Hình 2D), sự biệt hóa tạo thành các bộ phận của hoa và sự phát triển của chúng cũng được quan sát ở giai đoạn này (Hình 2E). Hình 2. Các giai đoạn hình thành bông lúa non [40] A : Giai đoạn phát sinh mô phân sinh trục bông, B : Hình thành và kéo dài mô phân sinh gié sơ cấp, C : Kéo dài gié sơ cấp và hình thành gié thứ cấp, D : Hình thành hoa, E : Sự biệt hóa các cơ quan sinh sản của hoa. RM : mô phân sinh trục ; PBm : mô phân sinh gié sơ cấp ; AM : mô phân sinh gié thứ cấp ; PB : Gié sơ cấp ; Sp : spikelet (cụm hoa) ; Fl : hoa. 1.1.2 Các nghiên cứu về cơ sở di truyền kiểm soát cấu trúc bông lúa Sự phát triển của bông lúa phụ thuộc vào hoạt động của cả mô phân sinh trục (rachis meristem) và mô phân sinh gié (branch meristem), chúng được kiểm soát bởi mạng lưới nhiều gen khác nhau. Ngày nay, một số gen đã được mô tả tham gia vào việc kiểm soát quá trình phát triển của bông lúa (Hình 3). 4
  15. Lê Thị Như – K26CH Hình 3. Tương tác di truyền kiểm soát sự phát triển bông lúa [17] Theo đó, các gen kiểm soát hoạt động của các mô phân sinh trong thời gian biệt hóa hình thành cơ quan sinh sản ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc bông. Một số yếu tố tham gia vào quá trình chuyển đổi và hình thành các mô phân sinh của cụm hoa đã được nghiên cứu ở Arabidopsis, chức năng của một số gen tương đồng cũng được phát hiện khi tiến hành nghiên cứu so sánh trình tự ở lúa. Các nhà khoa học đã mô tả hai trong số bốn gen RICE CENTRORADIALIS ở lúa (RCN1, RCN2) liên quan đến sự biệt hóa từ mô phân sinh ghé sơ cấp thành mô phân sinh gié thứ cấp (Hình 3). Trong đó, khi tăng cường biểu hiện RCN1, RCN2 sẽ thúc đẩy sự hình thành các mô phân sinh gié thứ cấp, kéo theo sự tăng cường số lượng gié thứ cấp ở bông [33]. Thông qua phân tích các đột biến, gen LAX PANICLE 1( LAX1) đã được chứng minh là cần thiết cho sự hình thành và duy trì các mô phân sinh gié, việc giảm biểu hiện LAX1 sẽ làm giảm số lượng gié sơ cấp của bông. Đồng thời, gen LAX1 cũng hoạt động như một gen nhận dạng mô phân sinh hoa [21]. TAWAWA1 (TAW1) được mô tả tham gia vào quá trình điều chỉnh cấu trúc bông bằng cách ức chế sự chuyển đổi từ mô phân sinh gié sang mô phân sinh hoa. TAW1 được đánh giá có thể hoạt động như một yếu tố phiên mã trong việc thúc đẩy các hoạt động của mô phân sinh gié và hạn chế sự chuyển đổi sang mô phân sinh hoa từ đó làm tăng số lượng hoa trên bông [45]. APO1 và APO2 (ABERRANT PANICLE ORGANIZATION) là các yếu tố điều hòa chính ở bông lúa, các cây đột biến mất chức năng các gen này có cụm hoa nhỏ, ít nhánh do mô phân sinh gié sớm chuyển thành mô phân sinh hoa [18]. LONELY GUY (LOG) mã hóa một loại enzyme liên 5
  16. Lê Thị Như – K26CH quan đến cân bằng cytokinin nội sinh, đóng vai trò quan trọng quyết định số lượng gié trên bông, tăng cường biểu hiện LOG có thể làm tăng số lượng gié sơ cấp [23]. Gen LEAFY HULL STERILE1 (LHS1) mã hóa một yếu tố phiên mã họ MADS liên quan đến sự phát triển của các bộ phận của hoa cũng như kiểm soát thời kỳ ra hoa, ức chế biểu hiện của gen này có thể làm tăng số lượng hoa trên bông [20]. Các nhà khoa học cũng chứng minh được rằng số lượng gié sơ cấp và thứ cấp của bông được kiểm soát tích cực bởi một alen của DEP1 (DENSE AND ERECT PANICLE 1) [16]. 1.2 Phương pháp phân tích liên kết trên toàn hệ gen (GWAS), công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cơ sở di truyền của các tính trạng nông học Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, sự ra đời của các thế hệ giải trình tự mới đã tạo điều kiện cho hàng loạt dự án giải trình tự các giống lúa khác nhau trên thế giới (như dự án giải trình tự 3000 giống lúa (3K RGP, 2014), dự án đánh giá di truyền của tập đoàn 1568 giống lúa bản địa với 700000 SNPs (HDRA SNP) [29], cung cấp cơ hội tuyệt vời cho các phân tích liên kết trên toàn hệ gen (GWAS). GWAS trở thành công cụ mạnh mẽ trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền, đặc biệt là ở những tính trạng nông học phức tạp như cấu trúc bông, do nó so sánh đồng thời ảnh hưởng của nhiều alen lên tính trạng quan tâm trên một số lượng lớn các giống trong tập đoàn. Nguyên tắc cơ bản của GWAS liên quan đến việc xác định alen liên kết với nhiều SNP khác nhau trong mỗi một nghiên cứu, và thống kê so sánh để xác định SNP hoặc gen liên kết với một đặc điểm cụ thể. Các phân tích GWAS trên tính trạng cấu trúc bông được tiến hành hàng loạt trong một vài năm gần đây. Nhiều QTL liên quan đến các tính trạng năng suất như số gié sơ cấp trên bông, số gié thứ cấp trên bông, chiều dài trục bông, số hạt/bông đã được tìm thấy, trong đó một số locus chứa các gen đã được biết ảnh hưởng tới cấu trúc bông [1, 7, 27, 39, 44]. Năm 2018, Tạ Kim Nhung và cộng sự xác định được một QTL (quantitative trait locus) hoàn toàn mới (QTL9) thông qua phân tích GWAS các tính trạng năng suất của một tập đoàn 159 giống lúa bản địa Việt Nam [41]. QTL9 liên kết với 2 tính trạng quan trọng quyết định trực tiếp đến năng suất: số gié thứ cấp/bông và số hoa/bông. Vùng QTL9 có kích thước 780 kb, 137 gen được tìm thấy nhưng chưa có 6
  17. Lê Thị Như – K26CH gen nào được nghiên cứu chức năng. Bằng phân tích tin sinh các cơ sử dữ liệu sẵn có trên internet, 11 gen ứng cử viên đã được sàng lọc để đánh giá biểu hiện ở 2 nhóm lúa (haplotype) có cấu trúc bông tương phản (bông to: 47 gié thứ cấp, 240 hoa/ bông và bông nhỏ: 30 gié thứ cấp, 150 hoa/ bông). Trong đó, 2 gen mã hóa protein chứa miền ankyrin (đặt tên là ANK1 và ANK2) có biểu hiện trái ngược nhau ở 2 haplotype. Gen ANK1 biểu hiện mạnh hơn ở nhóm lúa bông to trong khi biểu hiện của gen ANK2 cao hơn ở nhóm lúa bông nhỏ (dữ liệu chưa công bố) (Hình 4). Bên cạnh đó, phân tích trình tự các gen này đã tìm thấy các SNPs, InDels ở 2 haplotype. Những kết quả thu được cho thấy tiềm năng của 2 gen ANK1 và ANK2 liên quan đến cấu trúc bông lúa, trong đó gen ANK1 đóng vai trò như một yếu tố làm tăng cường khả năng phân nhánh của bông, còn gen ANK2 có tác động ngược lại gây ức chế quá trình này. Phân tích chức năng của gen ANK1, ANK2 sẽ giúp làm sáng tỏ vai trò của chúng liên quan đến cấu trúc bông lúa (Hình 4). Hình 4. Biểu hiện của ANK1, ANK2 ở hai nhóm lúa có cấu trúc bông tương phản Màu xám: Biểu hiện gen giai đoạn sớm, Màu đỏ: Biểu hiện gen giai đoạn muộn. a, b, c, d thể hiệ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. 1.3 Tổng quan về motif ankyrin (ANK), cấu trúc gen ANK1, ANK2 ở lúa 1.3.1 Motif ankyrin Motif ankyrin (ANK) là một trong những motif protein được bảo tồn và phân bố đa dạng nhất trong các loài sinh vật, từ virus đến người [37]. Mỗi motif ANK bao gồm từ 30-33 axit amin tạo thành hai vòng xoắn alpha song song và được nối 7
  18. Lê Thị Như – K26CH với nhau bởi các vòng cầu hoặc cấu trúc kẹp tóc. Hầu hết protein ANK chứa hai đến sáu motif ANK lặp lại, số lần lặp lại lớn nhất được biết đến là 34 được dự đoán cho một protein từ Giardia lamblia [10]. Các protein tín hiệu Swi6/Cdc10 và Notch là các protein ANK đầu tiên được phát hiện từ nấm men và Drosophila [2]. ANK giữ vai trò trung gian trong tương tác protein-protein của tế bào nhưng chúng thường không nhận ra bất kỳ chuỗi axit amin hoặc cấu trúc cụ thể nào, thay vào đó, chúng tạo thành một bề mặt dài, kích thước khác nhau tùy thuộc vào số lần lặp lại, do đó tính đặc hiệu phụ thuộc vào số lượng motif ankyrin trong protein [31]. Ở người và động vật, protein ANK có ý nghĩa quan trọng và vai trò sinh học đa dạng. Chúng tham gia vào kiểm soát con đường sống sót của tế bào [30], điều hòa phiên mã [5]. Quan trọng hơn cả là các khiếm khuyết trong protein ANK đã được mô tả cho một số người bệnh. Một số protein ANK trực tiếp tham gia vào ngăn ngừa sự phát triển của ung thư. Hơn nữa, protein ANK là các thành phần quan trọng của kênh ion và vận chuyển phức hợp tín hiệu trong hệ thống tim mạch [12]. Ở thực vật, chỉ có một số lượng nhỏ protein ANK đã được nghiên cứu chức năng, tuy nhiên cơ chế hoạt động của motif ANK vẫn chưa được làm rõ. Protein ANK có nguồn gốc thực vật đầu tiên được báo cáo là AKR từ Arabidopsis, đóng vai trò điều hòa trong quá trình biệt hóa tế bào và phát triển của cây [48]. Các protein ANK cũng được báo cáo giữ vai trò quan trọng trong việc đáp ứng các stress sinh học và phi sinh học ở thực vật. Motif ANK tham gia trong tương tác protein-protein được nghiên cứu có liên quan đến một số phản ứng sinh lý trong tế bào và chu kỳ tế bào, phân biệt tế bào [11], sự nảy mầm và tăng trưởng của hạt phấn [14], phát triển và hình thành rễ bên [34], tham gia vào quy trình chết tự nhiên của tế bào [8], điều chỉnh kênh ion Kali màng tế bào [25], duy trì việc cộng sinh với vi khuẩn cố định nito trong nốt sần ở rễ [22]. Cho đến nay mới chỉ có 3 protein ANK được nghiên cứu chức năng ở lúa. XB25 là một protein liên kết có khả năng tương tác với miền xuyên màng của protein XA21, cần thiết để duy trì khả năng kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae, tác nhân gây ra bệnh bạc lá ở lúa [19]. Protein thứ hai là CBT hoạt động như một 8
  19. Lê Thị Như – K26CH yếu tố điều hòa tăng cường phiên mã [6] và gen PIANK1 liên quan đến việc điều chỉnh đáp ứng kháng bệnh đạo ôn [32]. Năm 2009, bằng cách phân tích các bộ dữ liệu ở lúa, Huang và cộng sự đã xác định được 175 gen ANK dựa vào thành phần “miền protein” và được chia thành 10 phân lớp. Đánh giá biểu hiện của các gen này trong suốt vòng đời của lúa, cho thấy biểu hiện của một số gen thay đổi đáng kể khi được đáp ứng với phytohormone hay các yếu tố sáng/tối, trong khi đó một số gen ANK có thể giữ vai trò quan trọng trong quá trình ra hoa và thụ phấn ở lúa [15]. Đáng chú ý, gen ANK1 và ANK2 cũng có mặt trong nghiên cứu này và ANK1 có biểu hiện tăng cao trong giai đoạn phân hóa gié của bông non. 1.3.2 Phân tích tin sinh gen ANK1, ANK2 Các nghiên cứu tin sinh đã được thực hiện trên cấu trúc protein được mã hóa bởi các gen ANK1, ANK2 và một số phối tử tiềm năng của chúng, nhằm xác định các dạng mRNA trưởng thành. ANK1 và ANK2 đều có thể tạo ra các dạng mRNA khác nhau. Gen ANK1 có hai dạng mRNA trưởng thành. Dạng đầu tiên có 9 exon, mã hóa 6 motif ANK, và tạo ra hai vị trí liên kết với các phân tử sinh học khác (Molecular Binding Site). Protein ANK1 được dự đoán có thể tạo liên kết với một số protein bám màng và cytoskeleton hay nó cũng có thể là một kênh vận chuyển ion calcium. Dạng mRNA thứ hai chỉ có 5 motif ANK, tạo ra 1 vị trí tương tác protein nhưng vẫn bảo tồn các chức năng sinh hóa như dạng mRNA1 (Hình 5A). Gen ANK2 có bốn dạng mRNA. Dạng thứ nhất có 10 exon, mã hóa 5 motif ANK và 3 motif TPR (Tetratricopeptide repeat), có hai vị trí tương tác với các protein khác. Protein của dạng mRNA này có tiềm năng tham gia vào một cơ chế truyền tín hiệu với thụ thể màng ty thể. Dạng thứ hai và dạng thứ tư tương tự nhau, chỉ có 5 motif ANK và 1 vị trí tương tác protein. Trong khi đó dạng thứ ba không mã hóa motif ANK nào (Hình 5B) (Dữ liệu chưa công bố). 9
  20. Lê Thị Như – K26CH Hình 5. Sơ đồ mô phỏng cấu trúc các kiểu protein ANK1 (A), ANK2 (B) tạo ra từ các mRNA khác nhau Đường màu đỏ: các motif ANK; đường màu cam: motif Tetratricopeptide repeats; đường màu đen: liên kết màng- cytoskeleton; đường màu vàng: liên kết thụ thể màng của ty thể; đường màu xanh: liên kết với các protein khác. a, b, c, d là các dạng mRNA phiên mã khác nhau của gen. 1.4 Nghiên cứu chức năng gen ở thực vật bằng phương pháp chuyển gen Một trong những phương pháp hiệu quả nhất để nghiên cứu chức năng gen là phương pháp chuyển gen. Năm 1972, công nghệ ADN tái tổ hợp lần đầu tiên được sử dụng để chuyển gen vào virus SV40, từ đó cho đến nay hàng loạt nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này ra đời, một trong những ứng dụng quan trọng của công nghệ này là tạo ra được những sinh vật biến đổi gen mang những đặc tính mong muốn. Nhiều giống lúa biến đổi gen cũng được tạo ra nhờ việc áp dụng kết hợp công nghệ ADN tái tổ hợp và các kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật. Có nhiều phương pháp chuyển gen đã được áp dụng ở lúa như sử dụng súng bắn gen, chuyển gen qua tế bào trần hay chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Phương pháp sử dụng súng bắ n gen: Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp ADN ngoại lai vào tế bào thực vật, phát triển vào đầu thập niên 1980 bởi các nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell. Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại 10
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.01: Bộ Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Kinh Doanh MBA
165 tài liệu
2070 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2