intTypePromotion=1

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:72

0
34
lượt xem
2
download

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với các mục tiêu sau: Xác định tỷ lệ xuất hiện các trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng vi khuẩn lao; so sánh tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng lao ở ba miền Bắc - Trung - Nam tại Việt Nam.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam

  1.                                                     ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội loài người ngày càng phát triển, cùng với nó là sự  bùng nổ  của các đại dịch mà nổi bật nhất là lao, HIV và sốt rét. Theo thống kê của  tổ  chức Y tế  Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số  thế  giới. Mỗi năm theo  ước tính có khoảng 9 triệu người mắc lao mới và  có khoảng 3 triệu người chết vì lao, tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện bệnh chỉ đạt  37%. Như vậy còn rất nhiều bệnh nhân mắc lao không được phát hiện và   chữa trị  kịp thời, đây sẽ  là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm soát. Việt Nam  hiện đứng thứ  12 trong tổng số  22 nước có tỉ  lệ  nhiễm lao lớn nhất trên   Thế giới, trong khu vực Tây Thái Bình Dương đứng thứ 3 sau Trung Quốc   và Philippin [2, 10, 54]. Ngày nay bệnh lao càng trở nên nguy hiểm hơn do tính kháng thuốc,   đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử  vong rất lớn, do vậy, việc phát hiện  để điều trị sớm càng trở  nên cần thiết. Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp   rất nhiều khó khăn. Ở Việt Nam, phương pháp nhuộm Ziehl ­ Neelsen hiện   nay vẫn được coi là phổ biến nhất. Hạn chế của phương pháp này là chỉ có   khả năng phát hiện trong trường hợp số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml  bệnh phẩm, do vậy nếu chỉ  áp dụng phương pháp này sẽ  để  sót nhiều  bệnh   nhân.   Phương   pháp   nuôi   cấy   vi   khuẩn   lao   trên   môi   trường  Lowenstein­Jensen được coi là tiêu chuẩn vàng để  chẩn đoán, tuy nhiên  phải mất 4 đến 8 tuần nuôi cấy mới cho kết quả. Ngay cả trên môi trường  nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC cũng mất đến 2 tuần, điều này khó đáp  ứng được mục tiêu phát hiện nhanh để kiểm soát bệnh lao [4, 18]. Trước yêu cầu bức thiết đó đòi hỏi phải có một phương pháp chẩn   đoán đáp ứng được hai yêu cầu nhanh và chính xác. Ngày nay sự phát triển   1
  2. mạnh mẽ của sinh học phân tử đã tạo ra một bước đột phá trong việc chẩn  đoán lao. Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán lao đã  rút ngắn thời gian chẩn đoán từ  vài tuần xuống còn hai ngày với độ  nhạy  và độ đặc hiệu cao, ngoài ra phương pháp này còn cho phép phân biệt chính  xác các loài có khả năng gây bệnh lao cũng như  phát hiện khả năng kháng  thuốc thông qua các gen đặc trưng. Hiện nay, trên thế giới và một số cơ sở  trong nước đang ứng dụng phản  ứng PCR nhằm khuếch đại các đoạn gen   IS6110, đây là trình tự đặc trưng ở vi khuẩn lao.  Tuy nhiên một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có những chủng   lao ở Đông Nam Á trong đó có Việt Nam có một tỉ lệ nhất định khuyết các  gen đích này, cụ  thể  là IS6110 có tỷ  lệ  khuyết từ  5% đến 8% [25, 30, 32.   40]. Một số  nghiên cứu đề  xuất chọn các gen đích khác là IS1081 và 23S  rDNA thay cho gen đích IS6110 nhưng chúng ta chưa có một nghiên cứu  rộng khắp các chủng lao  ở  Việt Nam để  khẳng định rằng có hay không   hiện tượng khuyết gen đích, và nếu có thì tỷ  lệ  đó là bao nhiêu. Điều này   rất quan trọng vì khi khuyết gen đích thì phản  ứng PCR nhằm vào gen đó  không có giá trị chẩn đoán. Nghiên cứu về các gen đích này đồng thời cũng  góp phần xây dựng nên sự hoàn thiện trong việc xác định đặc điểm phân tử  của vi khuẩn lao ở Việt Nam [13, 30]. Nhận thấy vấn đề  này có vai trò quan trọng trong hướng phát triển  sinh học phân tử  trong việc chẩn đoán lao để  có thể  thiết kế  các bộ  kit   PCR phù hợp với đặc điểm riêng của các chủng lao trong cả nước để tránh   trường hợp bỏ sót bệnh nhân.  Từ những vấn đề trên chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác   định một số   đặc  điểm phân tử  của các chủng vi khuẩn lao  ở  Việt   Nam”. Đề tài tiến hành khảo sát trên số lượng lớn các chủng vi khuẩn lao  2
  3. được thu thập  ở  ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam với hai mục tiêu   sau: 1. Xác định tỷ lệ xuất hiện các trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S   rDNA trên các chủng vi khuẩn lao. 2. So sánh tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên   các chủng lao ở ba miền Bắc – Trung – Nam tại Việt Nam.                                     3
  4. Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO  1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới Lao là một bệnh truyền nhiễm và đã từng được Tổ  chức Y tế  Thế  giới (WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu của căn bệnh này.  Hiện nay, bệnh lao đang được khuyến cáo là một trong ba bệnh truyền  nhiễm nguy hiểm nhất trên thế  giới cùng với hội chứng suy giảm miễn   dịch AIDS và sốt rét. Hiện có tới hơn 2 tỷ người nhiễm lao chiếm gần 1/3   dân số thế giới, mỗi năm có khoảng 9 triệu bệnh nhân mới được phát hiện  và trên 3 triệu người chết vì lao [2]. Tình hình cũng diễn biến xấu hơn  ở  những nước đang phát triển, nơi chiếm 95% số  người mắc lao. Bệnh lao   chiếm 25% nguyên nhân tử vong ở những nước này. Khoảng 80% số bệnh   nhân lao toàn cầu thuộc 22 quốc gia có gánh nặng bênh tật cao. Đặc biệt  trong những năm gần đây tình hình lao đồng nhiễm với HIV – AIDS và lao  kháng thuốc đang nổi lên như  một vấn đề  nhức nhối, đặc biệt là  ở  các  nước kém và đang phát triển, điều này đòi hỏi sự vào cuộc của toàn xã hội.  Theo thống kê năm 2005 toàn thế giới có gần 8,8 triệu người mắc bệnh lao  4
  5. và đã dẫn tới 1,6 triệu người bị  chết. Khoảng 95% số  bệnh nhân lao và   98% số  người chết do lao  ở  các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số  bệnh nhân lao cả nam và nữ  ở  độ  tuổi lao động. Trong đó có khoảng 80%  số  bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao [54, 69].  Vào năm 2007, WHO ước tính khu vực Đông Nam Á có số người nhiễm lao  chiếm 34% trên toàn thế giới.  Thông báo gần đây nhất năm 2007 của WHO cho biết bệnh lao bước   đầu đã  ổn định và giảm đi  ở  cả  6 vùng trên thế  giới. Tuy nhiên số  lượng   các ca mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng lên và tập trung  ở  các khu vực  châu Phi, Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á. Tình hình trên cho thấy là   bệnh lao vẫn là mối nguy hại hàng đầu đối với loài người [54].  1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Theo đánh giá của WHO, Việt Nam đứng hàng thứ 12 trong 22 n ước có  số  bệnh nhân lao cao nhất thế  giới. T ại khu v ực Tây Thái Bình Dương,  Việt Nam đứng hàng thứ 3 sau Trung Qu ốc và Phillipin. Tỷ lệ mắc bệnh   lao tại Việt Nam cao h ơn 1,6 l ần so v ới  ước tính của WHO, nghĩa là có   khoảng 150.000 bệnh nhân lao các thể. Theo WHO thì Việt Nam là nước  có gánh nặng bệnh lao cao với khoảng 44% dân số nhiễm lao. Trong đó tỷ  lệ  lao mới  mắc các thể  là 173/100.000 dân, tỷ  lệ  hiện mắc các thể  là  225/100.000   dân,   tỷ   lệ   tử   vong   là   26/100.000   dân,   tỷ   lệ   đồng   nhiễm  lao/HIV trong các bệnh nhân lao mới là 5% [2].  Theo báo cáo của Chương trình Phòng chống lao quốc gia, hàng năm  Việt Nam phát hiện và điều trị  khoảng 100.000 bệnh nhân lao, trong đó  65% là lao phổi và tập trung  ở  các vùng đông dân cư  và thành phố  lớn.   Bệnh lao  ở  Việt Nam đang có xu hướng trẻ  hóa, rất nhiều thanh niên và  5
  6. người trong độ  tuổi lao động mắc lao. Trong giai đoạn 1997 đến 2000,  chương trình chống lao Quốc Gia đã phát hiện hơn 532.703 bệnh nhân lao  các thể, tỷ lệ phát hiện ước tính đạt 82% số bệnh nhân. Đã điều trị 260.698   bệnh nhân lao phổi với tỷ  lệ  khỏi 92% [2, 9, 42]. Đáng ngại là tỷ  lệ  lao  kháng thuốc ở Việt Nam, tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới  là 2,7% và tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong số bệnh nhân điều trị lại là 19%.  Nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% [2].  Những năm gần đây việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử  như  PCR   vào chẩn đoán lao đã mang lại nhiều kết quả  khả  quan, với các kĩ thuật  trên đã rút ngắn thời gian chẩn đoán và cho độ chính xác cao. Tuy vậy cần   có các nghiên cứu nhằm hiểu rõ hơn về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao  nhằm hoàn thiện hơn kĩ thuật chẩn đoán lao bằng phương pháp phân tử. 1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LAO 1.2.1. Đặc điểm phân loại Vi   khuẩn   lao   thuộc   giới  Bacteria,   ngành  Actinobacteria,   bộ  Actinomycetales, phân bộ  Corynebacterineae, họ  Mycobacteriaceae, giống  Mycobacterium.   Vi   khuẩn   lao   có   tên   khoa   học   là:  Mycobacterium   tuberculosis [15]. Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium được chia làm 2 nhóm Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm: M.   tuberculosis,  M.   bovis,  M.   africanum,  M.   microti.   Trong   đó  M.  tuberculosis và M. bovis gây bệnh lao điển hình. Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm:  6
  7. M. avium, M. ortuitum, M. govdovac, M. kansasii...  Nhóm này không  gây bệnh lao. 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc 1.2.2.1. Cấu trúc hình thái Vi khuẩn lao được phát hiện bởi Robert Koch khoảng 100 năm trước   đây.   Trực   khuẩn   lao   có   hình   que,   kích   thước   2­3   µm,   dày   0,3   µm.   Khi   nhuộm Ziel­Nellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ  thẫm, không bị  cồn và axit   làm  mất  màu  fucsin,  do vậy chúng  được  gọi là trực  khuẩn kháng cồn,  kháng   toan   (acid   fast   bacilli­AFB).   Đây   là   đặc   điểm   nổi   bật   của  Mycobacteria có thể giúp phát hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm.   Trực khuẩn lao trong dịch huyền phù duy trì tính kháng axit trong khoảng   thời gian rất dài kể cả khi chịu tác dụng của nhiệt. Trực khuẩn lao có khả  năng thực hiện tất cả  các cơ  chế  cần thiết để  tổng hợp các vitamin, axit   amin và các enzyme co­factor thiết yếu cho tế bào [3, 4, 5, 10] Hình 1.1. Trực khuẩn M. tuberculosis  Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis  [55] sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [55] 1.2.2.2. Cấu trúc thành tế bào 7
  8. Cấu trúc thành tế  bào của  M. tuberculosis  chia thành 4 lớp, nhờ  đó  giúp bảo vệ  tế  bào khỏi áp suất thẩm thấu, kiểm soát con đường hoà tan  giữa tế bào chất và môi trường. Lớp trong cùng là cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu là  các phospholipid. Các phân tử  phospholipid bao gồm hai nhóm, nhóm  ưa  nước hướng về  bên trong và nhóm kị  nước hướng về  bên ngoài, quay ra  phía vỏ [1]. Màng sinh chất của mycobacteria điều hoà sự  thẩm thấu giữa  nguyên sinh chất và môi trường, màng chứa các protein có chức năng khác  nhau như phân tử nhạy với nồng độ của các phân tử trong môi trường, các  protein truyền tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên  sinh chất, các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng  lượng, các chất mang làm trung gian cho vận chuyển các chất dinh dưỡng   và các ion. Các enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn  trong phân chia tế  bào, tập hợp và tiết một số  protein ngoại bào, sao chép   DNA [3, 4, 11]. Lớp tiếp theo là peptidoglican liên kết với đường arabinose và các  phân tử  axit mycolic   tạo nên một bộ  khung định hình cho vi khuẩn đảm   bảo   cho   vỏ   vi   khuẩn   có   độ   cứng   nhất   định   [1].   Thành   tế   bào   của  Mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất được biết ở prokaryote, có một số  thành phần hoá học và nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ  liên kết   giữa peptidoglycan  ở thành tế bào M. tuberculosis là 70­80% trong khi  ở  E.   coli là 20­30% [45]. Lớp ngoài là lớp được tạo nên bởi sự  liên kết giữa các axit mycolic  và các lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có  cấu trúc làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn giúp trực  8
  9. khuẩn tồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả  năng bị  huỷ  diệt  bởi đại thực bào và các tế bào miễn dịch [1]. Bám với peptidoglycan là một  polysaccharide phân nhánh, arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử  này  được ester hoá với axit béo có khối lượng phân tử  cao là axit mycolic. Sự  sắp xếp của các axit mycolic có tính đặc hiệu loài cho phép xác định loài  mycobacteria bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí­ lỏng.   Các   axit   mycolic   đặc   hiệu  M.   tuberculosis  là   alpha­keto   và  mythoxymycolate chứa 76 đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon. Lớp  ngoài   của   thành   tế   bào   có   các   phân   tử   lipid   tự   do   như   phthiocerol  dimycoserosates   (PDIM),   phenolic   glycolipids   (PGL),   trehalose­containing  glycolipids và sulfolipids (SL). Nằm ngang qua toàn bộ lớp màng là một số  glycolipid như  phosphatidyl­myoinositol mannosides, lipomannan (LM) và  lipoarabinomannan (LAM), được đính vào màng sinh chất và mở  rộng ra  bên ngoài thành tế  bào trong đó LAM có tính đặc hiệu loài. Thành tế  bào  mycobacteria chứa các protein nằm rải rác, một vài protein này có tác dụng   cấu trúc thành tế bào, một số protein porin hình thành các kênh ưa nước cho   phép   vận   chuyển   tích   cực   các   chất   tan   trong   nước   thông   qua   lớp   axit   mycolic. Porin ở mycobacteria khác so với các vi khuẩn Gram âm [44, 51]. Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở  vi  khuẩn lao phát triển bên trong tế bào, nó có tác dụng tăng cường như một lớp   áo giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống được các enzyme phân giải   từ các lysozyme của tế bào [1]. Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng  hoặc trong đại thực bào, M. tuberculosis tích luỹ một capsule giả không bám.  Thành phần của capsule chứa protein, polysaccharide và lượng nhỏ lipid. Cấu  thành của capsule có thể  bung ra trong   in vivo  bên trong các đại thực bào.  Màng tế  bào của vi khuẩn lao gây bệnh đa phần giống với màng của các   9
  10. mycobacteria trong cùng một giống bao gồm cả mycobacteria không gây bệnh. Màng tế  bào của vi khuẩn lao là một cấu trúc linh động có thể  thay   đổi khi phát triển hoặc tồn tại trong các môi trường khác nhau. Trong điều  kiện thiếu oxy thành tế  bào sẽ  dày lên, sự  biểu hiện của các gen mã hoá  cho các porin dường như  được điều hoà ngược trong các điều kiện môi   trường nhất định như  trong môi trường nuôi cấy axit nhẹ  cũng như  trong  khoang đại thực bào. Ngoài ra sự  hình thành cấu trúc cord liên quan đến  Trehalose 6, 6’­dimycolate là một glycolipid chứa hai phân tử  axit mycolic   bám lỏng lẻo  ở  lớp ngoài của thành tế  bào. Rất nhiều các hoạt tính sinh  học liên quan đến khả năng gây bệnh, tính sinh độc tố và bảo vệ chống lại   đáp ứng của tế bào chủ [3, 4, 11]. Ở điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao có thể tồn tại trong 3 đến 4 tháng.   Trong điều kiện phòng thí nghiệm vi khuẩn lao có thể  được bảo quản  trong nhiều năm. Tuy nhiên dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp thì sau 5 phút  vi khuẩn lao sẽ bị tiêu diệt. Dưới ánh sáng của tia cực tím, vi khuẩn lao chỉ  tồn tại được 2 đến 3 phút. Ở nhiệt độ 42o C vi khuẩn lao ngừng phát triển,  ở nhiệt độ 80o C vi khuẩn lao chết sau 10 phút [1, 8]. 1­ Lipid ngoài 2­ Axit mycolic 3­ polysaccharides  (arabinogalactan) 4­ peptidoglycan 5­ màng sinh chất 6­ lipoarabinomannan (LAM) 7­ phosphatidylinositol  mannoside 8­ Khung thành tế bào 10
  11. Hình 1.3. Thành tế bào Mycobacteria   [http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Mycobacterial_cell_wall_diagram.pn] 1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy  Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều   kiện kị  khí. Nhiệt độ  thích hợp để  mọc là 37oC. Hầu như  không mọc  ở  nhiệt độ dưới 37oC hoặc trên 42oC. Vi khuẩn lao phát triển trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh  dưỡng, chứa trứng, khoai tây, xitrat, glixerol, asparagin, xanh malachit. Môi  trường   thường   dùng   là  môi  trường   đặc  Loewenstein   được   cải   tiến  bởi   Jensen; (hoặc môi trường lỏng Sauton). Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, phải 4­6 tuần sau mới hình  thành khuẩn lạc điển hình, dạng R.               Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trường Lowenstein ­ Jensen  [www.stanford.edu/.../tb%20culture.jpg] Trực khuẩn M. tuberculosis gây bệnh phát triển thành các khuẩn lạc xù xì   bề  mặt ngoài dính và uốn khúc. Trong khi đó các   Mycobacteria  không gây  11
  12. bệnh và các trực khuẩn lao bị làm yếu đi trong nuôi cấy kéo dài thường mọc  khuẩn lạc nhẵn, tạo thành đám trong môi trường nuôi cấy [3, 4, 11, 45]. Thời gian phân chia: Ở điều kiện phòng thí nghiệm, M. tuberculosis cứ  12 đến 24 giờ phân chia một lần. Tốc độ phân chia chậm này có thể do tính  thẩm thấu của thành tế  bào hạn chế  trong việc hấp thụ  các chất dinh   dưỡng   và   liên   quan   đến   tốc   độ   tổng   hợp   ribosome.   Harshey   và  Ramakrishnan đã xác định rằng sự tổng hợp RNA là một tác nhân chính liên  quan đến thời gian sống dài của trực khuẩn. Tỷ lệ RNA/DNA, tốc độ  kéo  dài chuỗi RNA chậm hơn 10 lần so với  E. coli. Hơn nữa, khi trực khuẩn  chuyển từ trạng thái  ổn định sang pha phân chia thì RNA tổng số  chỉ  tăng  lên hai lần. Kết quả là tổng hợp protein bị chậm lại [45]. 1.2.4. Hệ gen vi khuẩn lao 1.2.4.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis                                        Hình 1.5. Hệ gen vi khuẩn lao 12
  13. M. tuberculosis H37Rv (Cole 1998a) chứa một trình tự gồm 4.411.529  bp, có đặc tính chứa nhiều Guanine và Cytosine (G+C 65,61%) không thay  đổi ở các vị trí khác nhau trong toàn bộ hệ gen, kiểm chứng cho giả thuyết   là không có các nhân tố  chuyển gen theo phương ngang trong hệ  gen   M.  tuberculosis [22, 29, 45].  Ở Mycobacteria có một nhóm gen với tỷ lệ G+C cao (>80%) mã hoá  cho họ protein PE (Pro­Glu) hoặc PPE (Pro­Pro­Glu). Trình tự PE và PPE có  ở  vùng đầu N và bảo thủ  trong từng họ  protein, chiều dài lần lượt xấp xỉ  110 và 180 amino axit. Trong 172 gen thì có 104 gen mã hoá PE và 68 mã  hoá PPE chiếm hơn 4% các gen của M. tuberculosis. Các protein PE và PPE  đóng   một   vai   trò   quan   trọng   trong   quá   trình   nhân   lên   và   sống   sót   của  mycobacteria trong các môi trường khác nhau. Họ  PE được chia thành 3   phân họ, họ quan trọng nhất chứa các trình tự đa hình giàu G­C (PGRS) và  có 61 thành viên. Các protein được mã hoá bởi các gen 104 PE được chia   nhỏ hơn thành 3 lớp, lớp thứ nhất chứa 29 protein chỉ với vùng PE, lớp thứ  hai gồm 8 protein trong đó vùng PE đi kèm với các trình tự  đầu C độc lập,   và   lớp   thứ   ba   gồm   67   protein   tạo   thành   dưới   họ   PE­PGRS.   PGRS  (polymorphic GC­rich repetitive sequences) là nhóm các protein có vùng PE  bảo thủ và đầu C mở rộng với sự lặp lại nhiều lần Gly­Gly­Ala hoặc Gly­ Gly­Asn. Chức năng của các họ này vẫn chưa biết rõ nhưng có một số giả  thuyết cho rằng một số  protein này có liên quan đến tính đa dạng kháng  nguyên   của  M.   tuberculosis  trong   quá   trình   lây   nhiễm   [29,   45,   49].   Các  protein PE­PGRS đặc trưng cho M. tuberculosis có chức năng  ức chế  trình  diện kháng nguyên thông qua phức hệ  hoà hợp tổ  chức (MHC) lớp I [45].   Một số gen PE mã hoá cho các protein chỉ chứa vùng 110 axit amin được đi  kèm gần với một gen mã hoá một protein PPE. Trong một số trường hợp,   13
  14. cặp PE­PPE (Rv2431c­Rv2430c) biểu hiện cùng nhau và có thể  tạo thành  một phức hệ [45, 46, 50]. Trong hệ  gen của H37Rv có ít gene với tỷ  lệ  G+C thấp (
  15. hấp kỵ  khí . Tính mềm dẻo này rất có lợi cho sự  sống sót trong các môi   trường khác nhau bên trong cơ thể người cả trong trạng thái áp lực oxy cao  trong phế  nang và các điều kiện kỵ  khí, vi kỵ  khí trong các nang lao. Một   đặc tính nữa của hệ gen M. tuberculosis là có các gen tổng hợp và phân huỷ  hầu như tất cả các loại lipid như các axit béo và các phân tử phức như axit  mycolic. M. tuberculosis có các gen mã hoá cho 250 enzyme khác nhau liên  quan đến trao đổi axit béo, so với 50 loại trong hệ  gen của   E. coli  [35].  Trong   số   các   protein   điều   khiển,  M.   tuberculosis  có   13   yếu   tố   sigma  (protein liên quan đến tính đặc hiệu sao mã trên RNA polymerase) tương   ứng 0,3% tổng số  gen và 22 protein điều khiển khác bao gồm 13 nhân tố  điều khiển đáp  ứng hai thành phần, tương  ứng 0,6% tổng số. Số  lượng   tương  ứng trong M. tuberculosis là 125 gen được nghiên cứu cho các chức  năng vận chuyển, tương ứng 3% tổng số [50]. Trong hệ  thống trao đổi chất DNA của  M. tuberculosis  có một hệ  thống sửa chữa DNA rất hiệu quả, bộ máy sao chép có độ  chính xác cao.  Hệ  gen của  M. tuberculosis  không có hệ  thống sửa chữa bắt cặp sai dựa   trên mutS nhưng được khắc phục bởi sự có mặt của gần 45 gene liên quan  đến các cơ chế sửa chữa DNA, bao gồm 3 bản copy của gen  mutT. Gen này  mã hoá cho enzyme chịu trách nhiệm loại bỏ các Guanine đã bị oxy hoá gây  ra sự bắt cặp sai giữa các cặp base trong quá trình sao chép [22, 29, 45].  1.2.4.2. Các trình tự chèn  Cấu tạo: Một   trong  những   đặc  tính  được   nghiên   cứu   kỹ  lưỡng   nhất  của  M.  tuberculosis là sự  có mặt và phân bố  của trình tự  chèn (IS), trong đó đặc   biệt là trình tự IS6110 là một trình tự thuộc họ IS3 được sử dụng rộng rãi   15
  16. trong nghiên cứu dịch tễ  học phân tử  vì sự  thay đổi  ở  vị  trí chèn và số  lượng bản copy trong bộ  gen.   Các trình tự  chèn không có chức năng mã  hoá mà chỉ  liên quan đến đặc tính biến đổi và di chuyển. Chúng gồm các  yếu   tố  cis,   các   trình   tự   DNA   hoạt   động   ở   hai   đầu   và   enzyme   Tpase,  enzyme này được mã hoá bởi một hoặc hai khung đọc mở và sử dụng hầu   như toàn bộ độ dài của trình tự chèn.                                             Hình 1.6. Cấu trúc của IS  ­ IRL ­ left inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên trái ­ IRR ­ right inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên phải ­ Khung đọc mở  mã hoá transposase bao gồm toàn bộ  độ  dài của IS và   trình tự IRR. ­ XYZ chứa các trình tự  lặp lại trực tiếp ngắn được sinh ra do quá trình   chèn của IS vào vị trí đích ­ p: Promotor định vị  trong IRL có hai vùng. Vùng I chứa các cặp base  ở   tận đầu của IS cần thiết cho sự  nhận biết các trình tự  chèn thông qua   Tpase. Vùng II chứa các cặp base cần thiết cho quá trình nhận ra các trình   tự đặc hiệu và gắn của Tpase  Các trình tự lặp lại đảo ngược ở hai đầu:  Trừ một vài trường hợp đáng chú ý (IS91, IS110 và họ IS200/605) đa số  các trình tự chèn có các trình tự lặp lại ngược chiều  ở hai đầu (IR­Inverted  Repeat) khoảng 10 đến 40 bp. IR được phân thành hai vùng chức năng, một  16
  17. định vị trong IR và liên quan đến chức năng gắn Tpase, vùng chức năng kia  gồm 2 hoặc 3bp ở cuối liên quan đến sự phân cắt và các phản ứng chuyển  chuỗi dẫn đến chuyển vị  trí của các trình tự  chèn. Các promoter của IS  thường định vị  một phần bên trong trình tự  IR về  phía đầu gen Tpase, sự  sắp xếp này có thể  cung cấp một cơ  chế  tự  điều hoà sự  tổng hợp Tpase   bằng cách gắn Tpase. Các vị  trí gắn các protein đặc hiệu cũng được tìm  thấy bên trong hoặc ở gần đầu IR, và đóng vai trò kích hoạt tính di chuyển   hoặc biểu hiện Tpase. Cấu trúc vùng Tpase:  Hoạt tính gắn vào các trình tự  DNA đặc hiệu của các protein được quy   định ở vùng đầu N trong khi vùng xúc tác thường được quy định ở vùng C.  Cấu trúc này tạo nên sự  tương tác của phân tử  protein mới sinh với các   trình tự đích trên IS.           Các đoạn lặp lại trực tiếp:  Đặc điểm khác của IS là có khả  năng chèn, đa số  tạo nên các trình tự  DNA ngắn lặp lại trực tiếp (DR­Direct Repeat), độ dài của DR vào khoảng  từ 2 đến 14bp, chèn vào chuỗi DNA tại các vị trí nhất định. Chức năng của IS:  Một số trình tự chèn có tác dụng hoạt hoá sự biểu hiện của các gen lân  cận, trong trường hợp di chuyển tạo nên vị  trí thích hợp thì các promoter   mới có khả năng điều khiển sự biểu hiện của các gen bên cạnh.  Thông qua biểu hiện và hoạt động của Tpase như  cô  lập các tín hiệu  khởi đầu dịch mã, thay đổi khung dịch mã, kết thúc dịch mã, tác động đến  sao mã và độ bền của Tpase [45]. Trình tự IS6110  17
  18. Trình tự IS6110 (IS – Insertion Sequence) được mô tả lần đầu tiên vào  năm 1989. IS6110 có nhiều bản copy (4 đến 25 bản copy), số lượng bản   copy IS6110 có trong hệ  gen thay đổi và phụ  thuộc vào loài và chủng.   Genome   của   M.   tuberculosis  gồm   44.411.529   cặp   base   v ới   4000   gen,   trong đó trình tự IS6110 tồn t ại r ải rác nhiều nơi, nó không có chức năng  mã hóa mà chỉ  liên quan tới tính biến đổi và di truyền. IS6110 là một  trình tự  chèn chứa 1355 bp và thuộc về  họ  IS3 của các trình tự  chèn.  IS6110 đã được xác định là có mặt trong các chủng  M. tuberculosis, và  chỉ khác nhau  ở một vài nucleotid giữa các bản copy với nhau. IS6110 có  trình tự  rất bảo thủ  do đó nó được chọn làm gen đích trong phản  ứng   multiplex PCR nhằm phát hiện   M. tuberculosis  [13]. Từ  lâu IS6110  đã  được nghiên cứu và sử  dụng rộng rãi mặc dù trong trình tự  genome của   M. tuberculosis hơn 30 yếu tố lặp lại có giá trị nhận diện [52]. Tuy nhiên  một  số  nghiên  cứu cũng  chỉ  ra rằng  ở  một số  vùng trên thế  giới các   chủng lao có rất ít hoặc thậm chí không có các trình tự IS6110 [24, 32].                                        Hình 1.7. 6 bản copy của IS6110 trong hệ gen M. tuberculosis      Sự thay đổi về số lượng bản copy này là nền tảng của tính đa hình và  thường được sử  dụng trong fingerprinting  M. tuberculosis. Những chủng  18
  19. chứa   ít   bản   copy  IS6110  hơn   thì   giống   nhau   hơn   trong   các   mô   hình  fingerprint   so   với   các   chủng   chứa   nhiều   bản   copy.   Oligonucleotide   có  nguồn gốc từ trình tự này được sử dụng cho phát hiện M. tuberculosis trong  các bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ  thuật PCR [36, 52]. Nhiều tác giả  đã  chứng minh giá trị  quan trọng trong dịch tễ  của trình tự  IS6110 khi nghiên  cứu về  sự   ổn định, tính đa hình và số  lượng bản sao của nó.  Ở  một số  vùng số lượng bản copy IS6110 thấp (
  20. tễ học. Nó cũng không được sử dụng thường xuyên để phân biệt B. bovis ­  BCG với các thành viên khác thuộc M. tuberculosis complex [19]. Tuy nhiên,  IS1081 cũng rất hữu ích cho các thao tác di truyền và phát triển các xét  nghiệm chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao dựa trên phản ứng PCR [21, 31].   Một nghiên cứu cho thấy khi sử dụng trình tự  IS1081 trong PCR để  chẩn  đoán lao đã cho kết quả về độ nhạy đạt 84,6% [16] 1.2.4.3. Gen 23S rDNA Các trình tự  rRNA được sử  dụng như  một dụng cụ  để  xác định sự  phân kỳ trong tiến hoá, phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn so với các  phương pháp phân loại cổ  điển. Trong DNA vi khuẩn thì locus di truyền  rRNA bao gồm các vùng 16S, 23S và 5S rRNA, giữa các vùng này là vùng  đệm (internally transcribed spacer ­ ITS). DNA trong vùng 16S­23S có sự  thay đổi lớn về độ dài và trình tự, sự thay đổi này rất có ích cho việc phân  biệt loài  ở  prokaryotes. Gần đây phương pháp PCR­RFLP được sử  dụng  rất có hiệu quả trong việc phân biệt các chủng ở prokaryotes [21, 36]. Gen  23S rDNA là một trình tự  có kích thước lớn, tính đa hình cao và thường   xuyên hơn so với các vùng 16S rDNA và 5S rDNA. Trong nghiên cứu gần   đây chỉ  có đoạn trong vùng 5V của 23S rDNA được giải trình tự  để  phân   tích so sánh. Trình tự 23S rDNA  ở M. tuberculosis khác với các loài đã phát  hiện  ở  7 vị  trí, đây là các vị  trí thích hợp cho việc thiết kế  các primer và  probe. Vùng 5V của 23S rDNA có thể  dùng làm gen đích cho phát hiện  nhanh và xác định mycobacteria ít nhất  ở  mức độ  loài. Sự  khác nhau đáng   kể giữa các loài không phải mycobacteria và mycobacteria có ý nghĩa trong   lâm sàng cho thấy giá trị tiềm năng của vùng này trong chẩn đoán. Theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự (2004) gen đích 23S  rDNA có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh do đó sử dụng cặp mồi đặc   20
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2