Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:72

Thêm vào BST

Báo xấu

62
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với các mục tiêu sau: Xác định tỷ lệ xuất hiện các trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng vi khuẩn lao; so sánh tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng lao ở ba miền Bắc - Trung - Nam tại Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam

ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội loài người ngày càng phát triển, cùng với nó là sự bùng nổ của các đại dịch mà nổi bật nhất là lao, HIV và sốt rét. Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Mỗi năm theo ước tính có khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao, tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện bệnh chỉ đạt 37%. Như vậy còn rất nhiều bệnh nhân mắc lao không được phát hiện và chữa trị kịp thời, đây sẽ là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm soát. Việt Nam hiện đứng thứ 12 trong tổng số 22 nước có tỉ lệ nhiễm lao lớn nhất trên Thế giới, trong khu vực Tây Thái Bình Dương đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippin [2, 10, 54]. Ngày nay bệnh lao càng trở nên nguy hiểm hơn do tính kháng thuốc, đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, do vậy, việc phát hiện để điều trị sớm càng trở nên cần thiết. Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất nhiều khó khăn. Ở Việt Nam, phương pháp nhuộm Ziehl Neelsen hiện nay vẫn được coi là phổ biến nhất. Hạn chế của phương pháp này là chỉ có khả năng phát hiện trong trường hợp số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh phẩm, do vậy nếu chỉ áp dụng phương pháp này sẽ để sót nhiều bệnh nhân. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường LowensteinJensen được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, tuy nhiên phải mất 4 đến 8 tuần nuôi cấy mới cho kết quả. Ngay cả trên môi trường nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC cũng mất đến 2 tuần, điều này khó đáp ứng được mục tiêu phát hiện nhanh để kiểm soát bệnh lao [4, 18]. Trước yêu cầu bức thiết đó đòi hỏi phải có một phương pháp chẩn đoán đáp ứng được hai yêu cầu nhanh và chính xác. Ngày nay sự phát triển 1
mạnh mẽ của sinh học phân tử đã tạo ra một bước đột phá trong việc chẩn đoán lao. Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán lao đã rút ngắn thời gian chẩn đoán từ vài tuần xuống còn hai ngày với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, ngoài ra phương pháp này còn cho phép phân biệt chính xác các loài có khả năng gây bệnh lao cũng như phát hiện khả năng kháng thuốc thông qua các gen đặc trưng. Hiện nay, trên thế giới và một số cơ sở trong nước đang ứng dụng phản ứng PCR nhằm khuếch đại các đoạn gen IS6110, đây là trình tự đặc trưng ở vi khuẩn lao. Tuy nhiên một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có những chủng lao ở Đông Nam Á trong đó có Việt Nam có một tỉ lệ nhất định khuyết các gen đích này, cụ thể là IS6110 có tỷ lệ khuyết từ 5% đến 8% [25, 30, 32. 40]. Một số nghiên cứu đề xuất chọn các gen đích khác là IS1081 và 23S rDNA thay cho gen đích IS6110 nhưng chúng ta chưa có một nghiên cứu rộng khắp các chủng lao ở Việt Nam để khẳng định rằng có hay không hiện tượng khuyết gen đích, và nếu có thì tỷ lệ đó là bao nhiêu. Điều này rất quan trọng vì khi khuyết gen đích thì phản ứng PCR nhằm vào gen đó không có giá trị chẩn đoán. Nghiên cứu về các gen đích này đồng thời cũng góp phần xây dựng nên sự hoàn thiện trong việc xác định đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao ở Việt Nam [13, 30]. Nhận thấy vấn đề này có vai trò quan trọng trong hướng phát triển sinh học phân tử trong việc chẩn đoán lao để có thể thiết kế các bộ kit PCR phù hợp với đặc điểm riêng của các chủng lao trong cả nước để tránh trường hợp bỏ sót bệnh nhân. Từ những vấn đề trên chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam”. Đề tài tiến hành khảo sát trên số lượng lớn các chủng vi khuẩn lao 2
được thu thập ở ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam với hai mục tiêu sau: 1. Xác định tỷ lệ xuất hiện các trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng vi khuẩn lao. 2. So sánh tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng lao ở ba miền Bắc – Trung – Nam tại Việt Nam. 3
Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO 1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới Lao là một bệnh truyền nhiễm và đã từng được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu của căn bệnh này. Hiện nay, bệnh lao đang được khuyến cáo là một trong ba bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch AIDS và sốt rét. Hiện có tới hơn 2 tỷ người nhiễm lao chiếm gần 1/3 dân số thế giới, mỗi năm có khoảng 9 triệu bệnh nhân mới được phát hiện và trên 3 triệu người chết vì lao [2]. Tình hình cũng diễn biến xấu hơn ở những nước đang phát triển, nơi chiếm 95% số người mắc lao. Bệnh lao chiếm 25% nguyên nhân tử vong ở những nước này. Khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 quốc gia có gánh nặng bênh tật cao. Đặc biệt trong những năm gần đây tình hình lao đồng nhiễm với HIV – AIDS và lao kháng thuốc đang nổi lên như một vấn đề nhức nhối, đặc biệt là ở các nước kém và đang phát triển, điều này đòi hỏi sự vào cuộc của toàn xã hội. Theo thống kê năm 2005 toàn thế giới có gần 8,8 triệu người mắc bệnh lao 4
và đã dẫn tới 1,6 triệu người bị chết. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động. Trong đó có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao [54, 69]. Vào năm 2007, WHO ước tính khu vực Đông Nam Á có số người nhiễm lao chiếm 34% trên toàn thế giới. Thông báo gần đây nhất năm 2007 của WHO cho biết bệnh lao bước đầu đã ổn định và giảm đi ở cả 6 vùng trên thế giới. Tuy nhiên số lượng các ca mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng lên và tập trung ở các khu vực châu Phi, Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á. Tình hình trên cho thấy là bệnh lao vẫn là mối nguy hại hàng đầu đối với loài người [54]. 1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Theo đánh giá của WHO, Việt Nam đứng hàng thứ 12 trong 22 n ước có số bệnh nhân lao cao nhất thế giới. T ại khu v ực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng hàng thứ 3 sau Trung Qu ốc và Phillipin. Tỷ lệ mắc bệnh lao tại Việt Nam cao h ơn 1,6 l ần so v ới ước tính của WHO, nghĩa là có khoảng 150.000 bệnh nhân lao các thể. Theo WHO thì Việt Nam là nước có gánh nặng bệnh lao cao với khoảng 44% dân số nhiễm lao. Trong đó tỷ lệ lao mới mắc các thể là 173/100.000 dân, tỷ lệ hiện mắc các thể là 225/100.000 dân, tỷ lệ tử vong là 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV trong các bệnh nhân lao mới là 5% [2]. Theo báo cáo của Chương trình Phòng chống lao quốc gia, hàng năm Việt Nam phát hiện và điều trị khoảng 100.000 bệnh nhân lao, trong đó 65% là lao phổi và tập trung ở các vùng đông dân cư và thành phố lớn. Bệnh lao ở Việt Nam đang có xu hướng trẻ hóa, rất nhiều thanh niên và 5
người trong độ tuổi lao động mắc lao. Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chương trình chống lao Quốc Gia đã phát hiện hơn 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện ước tính đạt 82% số bệnh nhân. Đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi 92% [2, 9, 42]. Đáng ngại là tỷ lệ lao kháng thuốc ở Việt Nam, tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới là 2,7% và tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong số bệnh nhân điều trị lại là 19%. Nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% [2]. Những năm gần đây việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử như PCR vào chẩn đoán lao đã mang lại nhiều kết quả khả quan, với các kĩ thuật trên đã rút ngắn thời gian chẩn đoán và cho độ chính xác cao. Tuy vậy cần có các nghiên cứu nhằm hiểu rõ hơn về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao nhằm hoàn thiện hơn kĩ thuật chẩn đoán lao bằng phương pháp phân tử. 1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LAO 1.2.1. Đặc điểm phân loại Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium. Vi khuẩn lao có tên khoa học là: Mycobacterium tuberculosis [15]. Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium được chia làm 2 nhóm Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti. Trong đó M. tuberculosis và M. bovis gây bệnh lao điển hình. Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm: 6
M. avium, M. ortuitum, M. govdovac, M. kansasii... Nhóm này không gây bệnh lao. 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc 1.2.2.1. Cấu trúc hình thái Vi khuẩn lao được phát hiện bởi Robert Koch khoảng 100 năm trước đây. Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 23 µm, dày 0,3 µm. Khi nhuộm ZielNellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn và axit làm mất màu fucsin, do vậy chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilliAFB). Đây là đặc điểm nổi bật của Mycobacteria có thể giúp phát hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm. Trực khuẩn lao trong dịch huyền phù duy trì tính kháng axit trong khoảng thời gian rất dài kể cả khi chịu tác dụng của nhiệt. Trực khuẩn lao có khả năng thực hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, axit amin và các enzyme cofactor thiết yếu cho tế bào [3, 4, 5, 10] Hình 1.1. Trực khuẩn M. tuberculosis Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis [55] sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [55] 1.2.2.2. Cấu trúc thành tế bào 7
Cấu trúc thành tế bào của M. tuberculosis chia thành 4 lớp, nhờ đó giúp bảo vệ tế bào khỏi áp suất thẩm thấu, kiểm soát con đường hoà tan giữa tế bào chất và môi trường. Lớp trong cùng là cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu là các phospholipid. Các phân tử phospholipid bao gồm hai nhóm, nhóm ưa nước hướng về bên trong và nhóm kị nước hướng về bên ngoài, quay ra phía vỏ [1]. Màng sinh chất của mycobacteria điều hoà sự thẩm thấu giữa nguyên sinh chất và môi trường, màng chứa các protein có chức năng khác nhau như phân tử nhạy với nồng độ của các phân tử trong môi trường, các protein truyền tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất mang làm trung gian cho vận chuyển các chất dinh dưỡng và các ion. Các enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia tế bào, tập hợp và tiết một số protein ngoại bào, sao chép DNA [3, 4, 11]. Lớp tiếp theo là peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân tử axit mycolic tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vỏ vi khuẩn có độ cứng nhất định [1]. Thành tế bào của Mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất được biết ở prokaryote, có một số thành phần hoá học và nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglycan ở thành tế bào M. tuberculosis là 7080% trong khi ở E. coli là 2030% [45]. Lớp ngoài là lớp được tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và các lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn giúp trực 8
khuẩn tồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị huỷ diệt bởi đại thực bào và các tế bào miễn dịch [1]. Bám với peptidoglycan là một polysaccharide phân nhánh, arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử này được ester hoá với axit béo có khối lượng phân tử cao là axit mycolic. Sự sắp xếp của các axit mycolic có tính đặc hiệu loài cho phép xác định loài mycobacteria bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí lỏng. Các axit mycolic đặc hiệu M. tuberculosis là alphaketo và mythoxymycolate chứa 76 đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon. Lớp ngoài của thành tế bào có các phân tử lipid tự do như phthiocerol dimycoserosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), trehalosecontaining glycolipids và sulfolipids (SL). Nằm ngang qua toàn bộ lớp màng là một số glycolipid như phosphatidylmyoinositol mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM), được đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào trong đó LAM có tính đặc hiệu loài. Thành tế bào mycobacteria chứa các protein nằm rải rác, một vài protein này có tác dụng cấu trúc thành tế bào, một số protein porin hình thành các kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực các chất tan trong nước thông qua lớp axit mycolic. Porin ở mycobacteria khác so với các vi khuẩn Gram âm [44, 51]. Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi khuẩn lao phát triển bên trong tế bào, nó có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống được các enzyme phân giải từ các lysozyme của tế bào [1]. Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc trong đại thực bào, M. tuberculosis tích luỹ một capsule giả không bám. Thành phần của capsule chứa protein, polysaccharide và lượng nhỏ lipid. Cấu thành của capsule có thể bung ra trong in vivo bên trong các đại thực bào. Màng tế bào của vi khuẩn lao gây bệnh đa phần giống với màng của các 9
mycobacteria trong cùng một giống bao gồm cả mycobacteria không gây bệnh. Màng tế bào của vi khuẩn lao là một cấu trúc linh động có thể thay đổi khi phát triển hoặc tồn tại trong các môi trường khác nhau. Trong điều kiện thiếu oxy thành tế bào sẽ dày lên, sự biểu hiện của các gen mã hoá cho các porin dường như được điều hoà ngược trong các điều kiện môi trường nhất định như trong môi trường nuôi cấy axit nhẹ cũng như trong khoang đại thực bào. Ngoài ra sự hình thành cấu trúc cord liên quan đến Trehalose 6, 6’dimycolate là một glycolipid chứa hai phân tử axit mycolic bám lỏng lẻo ở lớp ngoài của thành tế bào. Rất nhiều các hoạt tính sinh học liên quan đến khả năng gây bệnh, tính sinh độc tố và bảo vệ chống lại đáp ứng của tế bào chủ [3, 4, 11]. Ở điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao có thể tồn tại trong 3 đến 4 tháng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm vi khuẩn lao có thể được bảo quản trong nhiều năm. Tuy nhiên dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp thì sau 5 phút vi khuẩn lao sẽ bị tiêu diệt. Dưới ánh sáng của tia cực tím, vi khuẩn lao chỉ tồn tại được 2 đến 3 phút. Ở nhiệt độ 42o C vi khuẩn lao ngừng phát triển, ở nhiệt độ 80o C vi khuẩn lao chết sau 10 phút [1, 8]. 1 Lipid ngoài 2 Axit mycolic 3 polysaccharides (arabinogalactan) 4 peptidoglycan 5 màng sinh chất 6 lipoarabinomannan (LAM) 7 phosphatidylinositol mannoside 8 Khung thành tế bào 10
Hình 1.3. Thành tế bào Mycobacteria [http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Mycobacterial_cell_wall_diagram.pn] 1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị khí. Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37oC. Hầu như không mọc ở nhiệt độ dưới 37oC hoặc trên 42oC. Vi khuẩn lao phát triển trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng, chứa trứng, khoai tây, xitrat, glixerol, asparagin, xanh malachit. Môi trường thường dùng là môi trường đặc Loewenstein được cải tiến bởi Jensen; (hoặc môi trường lỏng Sauton). Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, phải 46 tuần sau mới hình thành khuẩn lạc điển hình, dạng R. Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trường Lowenstein Jensen [www.stanford.edu/.../tb%20culture.jpg] Trực khuẩn M. tuberculosis gây bệnh phát triển thành các khuẩn lạc xù xì bề mặt ngoài dính và uốn khúc. Trong khi đó các Mycobacteria không gây 11
bệnh và các trực khuẩn lao bị làm yếu đi trong nuôi cấy kéo dài thường mọc khuẩn lạc nhẵn, tạo thành đám trong môi trường nuôi cấy [3, 4, 11, 45]. Thời gian phân chia: Ở điều kiện phòng thí nghiệm, M. tuberculosis cứ 12 đến 24 giờ phân chia một lần. Tốc độ phân chia chậm này có thể do tính thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ các chất dinh dưỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome. Harshey và Ramakrishnan đã xác định rằng sự tổng hợp RNA là một tác nhân chính liên quan đến thời gian sống dài của trực khuẩn. Tỷ lệ RNA/DNA, tốc độ kéo dài chuỗi RNA chậm hơn 10 lần so với E. coli. Hơn nữa, khi trực khuẩn chuyển từ trạng thái ổn định sang pha phân chia thì RNA tổng số chỉ tăng lên hai lần. Kết quả là tổng hợp protein bị chậm lại [45]. 1.2.4. Hệ gen vi khuẩn lao 1.2.4.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis Hình 1.5. Hệ gen vi khuẩn lao 12
M. tuberculosis H37Rv (Cole 1998a) chứa một trình tự gồm 4.411.529 bp, có đặc tính chứa nhiều Guanine và Cytosine (G+C 65,61%) không thay đổi ở các vị trí khác nhau trong toàn bộ hệ gen, kiểm chứng cho giả thuyết là không có các nhân tố chuyển gen theo phương ngang trong hệ gen M. tuberculosis [22, 29, 45]. Ở Mycobacteria có một nhóm gen với tỷ lệ G+C cao (>80%) mã hoá cho họ protein PE (ProGlu) hoặc PPE (ProProGlu). Trình tự PE và PPE có ở vùng đầu N và bảo thủ trong từng họ protein, chiều dài lần lượt xấp xỉ 110 và 180 amino axit. Trong 172 gen thì có 104 gen mã hoá PE và 68 mã hoá PPE chiếm hơn 4% các gen của M. tuberculosis. Các protein PE và PPE đóng một vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và sống sót của mycobacteria trong các môi trường khác nhau. Họ PE được chia thành 3 phân họ, họ quan trọng nhất chứa các trình tự đa hình giàu GC (PGRS) và có 61 thành viên. Các protein được mã hoá bởi các gen 104 PE được chia nhỏ hơn thành 3 lớp, lớp thứ nhất chứa 29 protein chỉ với vùng PE, lớp thứ hai gồm 8 protein trong đó vùng PE đi kèm với các trình tự đầu C độc lập, và lớp thứ ba gồm 67 protein tạo thành dưới họ PEPGRS. PGRS (polymorphic GCrich repetitive sequences) là nhóm các protein có vùng PE bảo thủ và đầu C mở rộng với sự lặp lại nhiều lần GlyGlyAla hoặc Gly GlyAsn. Chức năng của các họ này vẫn chưa biết rõ nhưng có một số giả thuyết cho rằng một số protein này có liên quan đến tính đa dạng kháng nguyên của M. tuberculosis trong quá trình lây nhiễm [29, 45, 49]. Các protein PEPGRS đặc trưng cho M. tuberculosis có chức năng ức chế trình diện kháng nguyên thông qua phức hệ hoà hợp tổ chức (MHC) lớp I [45]. Một số gen PE mã hoá cho các protein chỉ chứa vùng 110 axit amin được đi kèm gần với một gen mã hoá một protein PPE. Trong một số trường hợp, 13
cặp PEPPE (Rv2431cRv2430c) biểu hiện cùng nhau và có thể tạo thành một phức hệ [45, 46, 50]. Trong hệ gen của H37Rv có ít gene với tỷ lệ G+C thấp (
hấp kỵ khí . Tính mềm dẻo này rất có lợi cho sự sống sót trong các môi trường khác nhau bên trong cơ thể người cả trong trạng thái áp lực oxy cao trong phế nang và các điều kiện kỵ khí, vi kỵ khí trong các nang lao. Một đặc tính nữa của hệ gen M. tuberculosis là có các gen tổng hợp và phân huỷ hầu như tất cả các loại lipid như các axit béo và các phân tử phức như axit mycolic. M. tuberculosis có các gen mã hoá cho 250 enzyme khác nhau liên quan đến trao đổi axit béo, so với 50 loại trong hệ gen của E. coli [35]. Trong số các protein điều khiển, M. tuberculosis có 13 yếu tố sigma (protein liên quan đến tính đặc hiệu sao mã trên RNA polymerase) tương ứng 0,3% tổng số gen và 22 protein điều khiển khác bao gồm 13 nhân tố điều khiển đáp ứng hai thành phần, tương ứng 0,6% tổng số. Số lượng tương ứng trong M. tuberculosis là 125 gen được nghiên cứu cho các chức năng vận chuyển, tương ứng 3% tổng số [50]. Trong hệ thống trao đổi chất DNA của M. tuberculosis có một hệ thống sửa chữa DNA rất hiệu quả, bộ máy sao chép có độ chính xác cao. Hệ gen của M. tuberculosis không có hệ thống sửa chữa bắt cặp sai dựa trên mutS nhưng được khắc phục bởi sự có mặt của gần 45 gene liên quan đến các cơ chế sửa chữa DNA, bao gồm 3 bản copy của gen mutT. Gen này mã hoá cho enzyme chịu trách nhiệm loại bỏ các Guanine đã bị oxy hoá gây ra sự bắt cặp sai giữa các cặp base trong quá trình sao chép [22, 29, 45]. 1.2.4.2. Các trình tự chèn Cấu tạo: Một trong những đặc tính được nghiên cứu kỹ lưỡng nhất của M. tuberculosis là sự có mặt và phân bố của trình tự chèn (IS), trong đó đặc biệt là trình tự IS6110 là một trình tự thuộc họ IS3 được sử dụng rộng rãi 15
trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử vì sự thay đổi ở vị trí chèn và số lượng bản copy trong bộ gen. Các trình tự chèn không có chức năng mã hoá mà chỉ liên quan đến đặc tính biến đổi và di chuyển. Chúng gồm các yếu tố cis, các trình tự DNA hoạt động ở hai đầu và enzyme Tpase, enzyme này được mã hoá bởi một hoặc hai khung đọc mở và sử dụng hầu như toàn bộ độ dài của trình tự chèn. Hình 1.6. Cấu trúc của IS IRL left inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên trái IRR right inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên phải Khung đọc mở mã hoá transposase bao gồm toàn bộ độ dài của IS và trình tự IRR. XYZ chứa các trình tự lặp lại trực tiếp ngắn được sinh ra do quá trình chèn của IS vào vị trí đích p: Promotor định vị trong IRL có hai vùng. Vùng I chứa các cặp base ở tận đầu của IS cần thiết cho sự nhận biết các trình tự chèn thông qua Tpase. Vùng II chứa các cặp base cần thiết cho quá trình nhận ra các trình tự đặc hiệu và gắn của Tpase Các trình tự lặp lại đảo ngược ở hai đầu: Trừ một vài trường hợp đáng chú ý (IS91, IS110 và họ IS200/605) đa số các trình tự chèn có các trình tự lặp lại ngược chiều ở hai đầu (IRInverted Repeat) khoảng 10 đến 40 bp. IR được phân thành hai vùng chức năng, một 16
định vị trong IR và liên quan đến chức năng gắn Tpase, vùng chức năng kia gồm 2 hoặc 3bp ở cuối liên quan đến sự phân cắt và các phản ứng chuyển chuỗi dẫn đến chuyển vị trí của các trình tự chèn. Các promoter của IS thường định vị một phần bên trong trình tự IR về phía đầu gen Tpase, sự sắp xếp này có thể cung cấp một cơ chế tự điều hoà sự tổng hợp Tpase bằng cách gắn Tpase. Các vị trí gắn các protein đặc hiệu cũng được tìm thấy bên trong hoặc ở gần đầu IR, và đóng vai trò kích hoạt tính di chuyển hoặc biểu hiện Tpase. Cấu trúc vùng Tpase: Hoạt tính gắn vào các trình tự DNA đặc hiệu của các protein được quy định ở vùng đầu N trong khi vùng xúc tác thường được quy định ở vùng C. Cấu trúc này tạo nên sự tương tác của phân tử protein mới sinh với các trình tự đích trên IS. Các đoạn lặp lại trực tiếp: Đặc điểm khác của IS là có khả năng chèn, đa số tạo nên các trình tự DNA ngắn lặp lại trực tiếp (DRDirect Repeat), độ dài của DR vào khoảng từ 2 đến 14bp, chèn vào chuỗi DNA tại các vị trí nhất định. Chức năng của IS: Một số trình tự chèn có tác dụng hoạt hoá sự biểu hiện của các gen lân cận, trong trường hợp di chuyển tạo nên vị trí thích hợp thì các promoter mới có khả năng điều khiển sự biểu hiện của các gen bên cạnh. Thông qua biểu hiện và hoạt động của Tpase như cô lập các tín hiệu khởi đầu dịch mã, thay đổi khung dịch mã, kết thúc dịch mã, tác động đến sao mã và độ bền của Tpase [45]. Trình tự IS6110 17
Trình tự IS6110 (IS – Insertion Sequence) được mô tả lần đầu tiên vào năm 1989. IS6110 có nhiều bản copy (4 đến 25 bản copy), số lượng bản copy IS6110 có trong hệ gen thay đổi và phụ thuộc vào loài và chủng. Genome của M. tuberculosis gồm 44.411.529 cặp base v ới 4000 gen, trong đó trình tự IS6110 tồn t ại r ải rác nhiều nơi, nó không có chức năng mã hóa mà chỉ liên quan tới tính biến đổi và di truyền. IS6110 là một trình tự chèn chứa 1355 bp và thuộc về họ IS3 của các trình tự chèn. IS6110 đã được xác định là có mặt trong các chủng M. tuberculosis, và chỉ khác nhau ở một vài nucleotid giữa các bản copy với nhau. IS6110 có trình tự rất bảo thủ do đó nó được chọn làm gen đích trong phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện M. tuberculosis [13]. Từ lâu IS6110 đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi mặc dù trong trình tự genome của M. tuberculosis hơn 30 yếu tố lặp lại có giá trị nhận diện [52]. Tuy nhiên một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ở một số vùng trên thế giới các chủng lao có rất ít hoặc thậm chí không có các trình tự IS6110 [24, 32]. Hình 1.7. 6 bản copy của IS6110 trong hệ gen M. tuberculosis Sự thay đổi về số lượng bản copy này là nền tảng của tính đa hình và thường được sử dụng trong fingerprinting M. tuberculosis. Những chủng 18
chứa ít bản copy IS6110 hơn thì giống nhau hơn trong các mô hình fingerprint so với các chủng chứa nhiều bản copy. Oligonucleotide có nguồn gốc từ trình tự này được sử dụng cho phát hiện M. tuberculosis trong các bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật PCR [36, 52]. Nhiều tác giả đã chứng minh giá trị quan trọng trong dịch tễ của trình tự IS6110 khi nghiên cứu về sự ổn định, tính đa hình và số lượng bản sao của nó. Ở một số vùng số lượng bản copy IS6110 thấp (
tễ học. Nó cũng không được sử dụng thường xuyên để phân biệt B. bovis BCG với các thành viên khác thuộc M. tuberculosis complex [19]. Tuy nhiên, IS1081 cũng rất hữu ích cho các thao tác di truyền và phát triển các xét nghiệm chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao dựa trên phản ứng PCR [21, 31]. Một nghiên cứu cho thấy khi sử dụng trình tự IS1081 trong PCR để chẩn đoán lao đã cho kết quả về độ nhạy đạt 84,6% [16] 1.2.4.3. Gen 23S rDNA Các trình tự rRNA được sử dụng như một dụng cụ để xác định sự phân kỳ trong tiến hoá, phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp phân loại cổ điển. Trong DNA vi khuẩn thì locus di truyền rRNA bao gồm các vùng 16S, 23S và 5S rRNA, giữa các vùng này là vùng đệm (internally transcribed spacer ITS). DNA trong vùng 16S23S có sự thay đổi lớn về độ dài và trình tự, sự thay đổi này rất có ích cho việc phân biệt loài ở prokaryotes. Gần đây phương pháp PCRRFLP được sử dụng rất có hiệu quả trong việc phân biệt các chủng ở prokaryotes [21, 36]. Gen 23S rDNA là một trình tự có kích thước lớn, tính đa hình cao và thường xuyên hơn so với các vùng 16S rDNA và 5S rDNA. Trong nghiên cứu gần đây chỉ có đoạn trong vùng 5V của 23S rDNA được giải trình tự để phân tích so sánh. Trình tự 23S rDNA ở M. tuberculosis khác với các loài đã phát hiện ở 7 vị trí, đây là các vị trí thích hợp cho việc thiết kế các primer và probe. Vùng 5V của 23S rDNA có thể dùng làm gen đích cho phát hiện nhanh và xác định mycobacteria ít nhất ở mức độ loài. Sự khác nhau đáng kể giữa các loài không phải mycobacteria và mycobacteria có ý nghĩa trong lâm sàng cho thấy giá trị tiềm năng của vùng này trong chẩn đoán. Theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự (2004) gen đích 23S rDNA có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh do đó sử dụng cặp mồi đặc 20