intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:84

70
lượt xem
7
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV vẫn đang tiếp tục duy trì sự sống ngày càng được tăng cao là hệ quả của hai tác động chủ yếu. Một là số người nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn ở mức cao. Luận văn sau đây đi xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT  CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP  ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­
  2. LỜI CẢM ƠN         Tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Ri đã   tận tình hướng dẫn khoa học, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi  trong quá trình học tập và nghiên cứu.         Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau Đại học của   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học đã  tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập tại trường.          Tôi xin chân thành cảm  ơn các Thầy cô, anh chị  trong Bộ  môn  Hóa Phân tích­ Trường Đại học Khoa học Tự  nhiên và Bộ  môn Hóa  Phân tích & Độc chất­ Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giúp  đỡ tôi trong quá trình học tập và làm thực nghiệm.          Cuối cùng, xin cảm  ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn   động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi tận tình trong suốt thời gian qua.                                                           Hà Nội, ngày 12  tháng 12 năm   2012                                                                 Nguyễn Thị Thùy Linh
  3. MỤC LỤC MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1 ­  TỔNG QUAN................................................................................3 1.1.  Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV...............................................................3 1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay..............6 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV...........................................7        1.3.1.Các phương pháp sắc ký 7        1.3.2.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis­CE) 8 1.4. Giới thiệu chung về phương pháp điện di mao  quản...........................................9        1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao  quản.......................................9        1.4.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao  quản...........................................10        1.4.3. Các quá trình xảy ra trong mao  quản.......................................................11        1.4.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao  quản...12        1.4.5. Điện di mao quản vùng  (CZE).................................................................12        1.4.6. Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen  (MEKC)......13        1.4.7. Phân tích định lượng theo điện di mao  quản............................................23 CHƯƠNG 2  ­ ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............24 2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................24
  4. 2.1.1.  Điều kiện nghiên  cứu............................................................................. 24 2.1.2.  Đối tượng nghiên  cứu............................................................................25 2.2.  Nội dung và phương pháp nghiên cứu............................................................26 2.2.1. Nội dung nghiên  cứu............................................................................... 26 2.2.2. Phương pháp nghiên  cứu.........................................................................26 CHƯƠNG 3 ­ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................29 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách 3TC,NVP và AZT.......................29 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất  ..............................................................29 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản  ................................................................31 3.1.3. Chọn phương pháp bơm  mẫu..................................................................32 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng.........................................................33 3.1.5. Lựa chọn cơ chế  tách..............................................................................34 3.1.6. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện  di.............................................36 3.1.7. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch  đệm.............................................39 3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen  SDS...........................39 3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ  đệm....................................................41
  5. 3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm  mẫu...............................................43 3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng thế điện  di.............................................................45 3.1.12. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản  ........................................46 3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ưu  ......................................................................47 3.1.14. Định tính 3TC, AZT và NVP trong điều kiện điện di thiết lập.............47 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích......................................................................50 3.2.1. Khảo sát tính tương thích hệ  thống.........................................................50 3.2.2 Tính đặc  hiệu............................................................................................50 3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường  chuẩn....................................52           3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)................56 3.2.5. Độ lặp lại của phương  pháp....................................................................57           3.2.6. Độ đúng của phương pháp.................................................................58           3.2.7. Kết quả định lượng trong chế phẩm................................................. 61 3.3. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu  Mixen (MEKC).......................................................................................................63 3.4. Hướng phát triển của đề tài............................................................................64 KẾT LUẬN...............................................................................................................65
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG STT bảng Tên bảng Trang 1.1 Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC 19 3.1 Tổng kết các điều kiện điện di tối ưu 47 3.2 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống 49 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tương  52 3.3 ứng Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tương  54 3.4 ứng Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tương  55 3.5 ứng Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng  57 3.6 (LOQ) Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định  57 3.7 lượng 3TC Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định  58 3.8 lượng AZT Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định  58 3.9 lượng NVP Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm  59 3.10 chuẩn 3TC Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm  60 3.11 chuẩn AZT Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm  60 3.12 chuẩn NVP 3.13 Kết quả định lượng viên nén Avocomb­N 61 Kết quả định lượng viên nén Lamivudine 150mg &  62 3.14 Zidovudine 300mg
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 11 1.2 Quá trình tách các chất trong CZE 13 1.3 Cấu trúc của Mixen và dòng EOF trong MEKC 15 1.4 Cấu trúc không gian của β­ cyclodextrin 20 1.5 Cấu trúc không gian của phân tử  α­CD, β­ CD, γ­ CD 21 1.6 Cấu trúc phân tử  của phân tử  α­CD, β­ CD, γ­ CD 22 3.1 Phổ hấp thụ của 3TC, AZT và NVP 31 3.2 Khảo sát cơ chế tách CZE, MEKC  35 3.3 Điện di đồ ở pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17. 37 3.4 Điện di đồ tại nồng độ SDS 25mM; 50mM và 75mM 40 3.5 Điện di đồ tại nồng độ đệm  5mM; 10mM và 20mM 42 3.6 Điện di đồ tại thời gian bơm mẫu 3s, 5s và 7s 44 3.7 Điện di đồ tại thế điện di 15kV; 20kV và 22 kV 46 3.8 Điện di đồ của 3TC, AZT và NVP tại điều kiện tối ưu 48 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP tại  48 3.9 điều kiện tối ưu Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau  49 3.10 khi thêm 3TC  tại điều kiện tối ưu Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau  49 3.11 khi thêm AZT  tại điều kiện tối ưu Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau  49 3.12 khi thêm NVP  tại điều kiện tối ưu 3.13 Điện di đồ mẫu trắng 51 3.14 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP  51
  8. 3.15 Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP 51 Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP  52 3.16 thêm hỗn hợp chuẩn Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và  53 3.17 nồng độ 3TC Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và  54 3.18 nồng độ AZT Đường chuẩn biểu thị quan hệ  giữa Diện tích pic và  55 3.19 nồng độ NVP 3.20 Điện di đồ viên nén Avocomb­N 62 Điện di đồ viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine  63 3.21 300mg
  9.   DANH MỤC VIẾT TẮT
  10. Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human  HIV Immunodeficiency Virus) Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người  AIDS (Acquired immunodeficiency syndrome) ARV Thuốc kháng virut USP Dược điển Mỹ (United State Pharmacopiea) CE Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) CEC Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography) CGE Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis) CZE Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis) DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector) EOF Dòng điện thẩm (Electro­ osmotic Flow) Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid  HPLC Chromatography) Sắc ký điện động micell (Micellar Electrokinetic  MEKC chromatography) Spic Diện tích pic tm Thời gian di chuyển (Migration times)  SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) RSD % Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) STT Số thứ tự AZT Zidovudine LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantity) NVP Nevirapine D4T Stavudine 3TC Lamivudine MỞ ĐẦU       Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV vẫn đang   tiếp tục duy trì sự sống ngày càng được tăng cao là hệ  quả  của hai tác động  1
  11. chủ yếu. Một là số người nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn ở mức cao.   Chỉ tính riêng năm 2008, thế giới vẫn có khoảng 2,7 triệu người mới nhiễm  HIV. Hai là do kết quả tích cực của liệu pháp điều trị  kháng virut (ARV) làm   giảm số người tử vong, kéo dài sự sống cho người bệnh. Đến tháng 12/2008   ước tính khoảng 4 triệu người nhiễm HIV  ở  các nước có thu nhập thấp và  trung bình được điều trị  bằng thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần trong vòng 5  năm. Trong vòng 4 năm (2004­ 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số người chết  do AIDS đã giảm 10% [12].         HIV/AIDS đang là vấn đề  lớn hiện nay trên thế  giới cũng như   ở  Việt  Nam. Ở nước ta Thành Phố Hồ Chí Minh là nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS   nhất (Sau  đó là Hội An, An Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh,...). Chúng ta   không chỉ  ngăn chặn sự  lây lan của bệnh mà còn điều trị  hiệu quả  để  giảm   nguy   cơ   tử   vong   kéo   dài   và   cải   thiện   chất   lượng   cuộc   sống   cho   người   HIV/AIDS. Trong điều trị thì kháng Retrovirut đóng vai trò rất lớn. Trước đây  nước ta chưa đầy đủ các loại thuốc Retrovirut nên thường dùng đơn hóa hoặc   phối hợp hai loại thuốc trong điều trị HIV/AIDS. Giờ có thể kết hợp 3 hoặc 4  loại thuốc trong những trường hợp lâm sàng nặng hơn. Hiện nay, nước ta đã  sản   xuất   được   thuốc   chống   HIV   là   Lamididrir   (Lamivudine   150mg   +   Zidovudine 300mg). Tuy nhiên phần lớn vẫn đang sử  dụng thuốc kháng HIV  theo chương trình quốc gia được cấp [12]      Để đảm bảo trong điều trị, an toàn trong sử dụng, việc quản lý chất lượng  thuốc kháng HIV là rất cần thiết. Vì vậy cần có phương pháp phân tích có độ  tin cậy cao,   nhanh nhằm đáp  ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lượng thuốc  HIV. Cho tới nay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hóa   lý đa số  được sử  dụng để  định lượng các loại thuốc.  Ưu điểm của phương   pháp này là độ lặp lại, độ  chính xác và khả  năng tách tốt. Đồng thời thiết bị  2
  12. HPLC hiện đã được tích hợp với hầu hết các kỹ  thuật hóa lý hiện có (phổ  UV­VIS, phân tích điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ nhạy và hạ  thấp giới hạn phát hiện của phương pháp. Tuy vậy, phương pháp HPLC đòi  hỏi sử  dụng dung môi có độ  tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây  ảnh   hưởng xấu, gây ô nhiễm môi trường. Đó là xuất phát điểm của việc lựa chọn   và phát triển phương pháp định lượng thuốc dựa trên kỹ  thuật hóa lý khác   thay thế  cho HPLC mà chúng tôi thực hiện trong nghiên cứu này. Kỹ  thuật  tách mà chúng tôi lựa chọn làm cơ sở cho nghiên cứu này là điện di mao quản   (CE) [15].  CE là phương pháp mới được phát triển, tuy nhiên có nhiều  ưu điểm vượt  trội là hiệu lực tách rất cao, kinh tế và đặc biệt là thời gian phân tích nhanh có   thể đáp  ứng không những cho phân tích trong phòng thí nghiệm mà còn phục   vụ  cho phân tích lâm sàng và trong sản xuất. Vì thế  đây là kỹ  thuật rất hữu   hiệu để thay thế hay hỗ trợ HPLC trong nhiều lĩnh vực phân tích, trong đó có  nghiên cứu về Dược.              Hơn nữa, chuyên luận chung về  CE đã được quy định trong Dược điển  một số  nước như  Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên  ở  Việt Nam, CE   chưa được  ứng dụng nhiều và kinh nghiệm  ứng dụng trong phân tích dược   phẩm còn hạn chế. Do vậy chúng tôi nhận định hướng nghiên cứu của mình   sẽ rất có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lượng thuốc   ở nước ta.          Từ  những phân tích trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu  ứng dụng của  phương pháp điện di mao quản vào định lượng thuốc kháng HIV với đề tài:  “Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc  bằng phương pháp điện di mao quản”. 3
  13. CHƯƠNG 1 ­  TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV Nhóm 1: thuốc  ức chế  men sao chép ngược có gốc nucleosides (nucleoside   reverse   transcriptase   inhibitors   =   NRTIs):   Zidovudine   (AZT,   ZDV),   Didanosine  (DDI), Zalcitabine (DDC), Stavudine (D4T), Lamivudine (3TC), Abacavir (ABC),  Tenofovir disoproxil fumarate. Nhóm 2: thuốc  ức chế men sao chép ngược không có gốc nucleosides (non­ nucleoside   reverse   transcriptase   inhibitors   =   NNRTIs):   Nevirapine,   Delavirdine,  Effavirenz. Nhóm   3:   là   thuốc   ức   chế   proteases   (protease   inhibitors   =   PIs):   Indinavir,  Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir . Qua nghiên cứu, người ta thấy không nên đơn hóa trị  liệu mà nên phối hợp   các thuốc nhóm 1 với nhau và với một thuốc nhóm 2 hoặc với một thuốc nhóm 3   để đạt được hiệu quả điều trị cao.          Phác đồ phối hợp Lamivudin,  Zidovudin và Nevirapin trong điều trị Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự  nucleosid có tác dụng kháng  retrovirus bao gồm cả  HIV­1 và HIV­2 do  ức chế  enzym phiên mã ngược của  virus. Hai thuốc này được sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng retrovirus để  điều trị  HIV. Bệnh nhân uống 3TC, AZT kết hợp Nevirapine trong 6 tháng cho  kết quả  khá khả  quan. Các chỉ  số đánh giá tình trạng bệnh nhân được cải thiện  rõ   rệt   và   có   ý   nghĩa   thống   kê.   Người   bệnh   tăng   cân,   có   số   lượng   tế   bào  lymphocyte tăng rõ rệt (từ  1273/mm3  lên 1547/mm3), số  lượng tế  bào CD4 từ  70/mm3 lên 145/mm3 làm cho số lượng tế bào CD4 bị phá hủy giảm đi. Như vậy,   4
  14. phác đồ  D4T/3TC/NVP có thể  khống chế  sự  phát triển  của virus. Liệu pháp  kháng retrovirus làm tăng thời gian sống sót của người bệnh có số  lượng tế  bào   CD4 dưới 500 trong 1mm3. Liệu pháp này cũng có thể  dùng cho những người  bệnh có mật độ  virus HIV trên 30000/ml huyết tương, không phụ  thuộc vào số  lượng tế  bào CD4, vì mật độ  HIV là một yếu tố  tiên lượng sự  tiến triển của   bệnh [12]. Liều dùng dựa trên thể trọng và tuổi của người bệnh, bệnh lý mắc kèm.   150mg 3TC, 30mg d4T ngày hai lần và NVP 200mg ngày một lần trong hai tuần   đầu sau đó NVR 200mg ngày hai lần cho người cân nặng dưới 60kg với người   lớn và thiếu niên trên 16 tuổi kể  cả  phụ  nữ  có thai, trẻ  em, bệnh nhân lao và  bệnh nhân đồng nhiễm viêm gan B * Lamivudin:                                                                                                              (3TC)                        Công thức phân tử: C8H11N3O3S. Phân tử lượng 229,3. Tên   khoa   học:   4­amino­1[2­(hydroxymethyl)­1,3­   oxathiolan­5­   yl]­2(1H)   pyrimidinon  Tính chất: Là bột kết tinh màu trắng. Nhiệt độ  nóng chảy: 1600­1620C. Dễ  tan trong nước, ít tan trong cồn, khó tan  trong các dung môi hữu cơ. Năng suất quay cực: [α]21D = ­ 1350 ( C = 0,38 % trong methanol )    Hằng số pKa= 3,31.  5
  15. Lamivudin hấp thụ  UV  ở  bước sóng hấp thụ  cực đại là 278nm; A 1%1cm trong H+  1M ~ 600 abs     Sau khi uống Lamivudin khoảng 1giờ, sinh khả dụng 80%, không bị   ảnh hưởng   bởi thức ăn. Đạt Tmax  khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau khi uống  150mg là khoảng 1,5μg/ml.                     *Zidovudin:                                                               (AZT)  Công thức phân tử C10H13N5O4 . Phân tử lượng 267.242 g/mol. Tên khoa học:  1­[(2R,4S,5S)­4­azido­5­(hydroxymethyl)   oxolan­2­yl]­5­methylpyrimidine­2,4­ dione Tính chất : Tinh thể trắng hoặc hơi nâu. Nhiệt độ nóng chảy: ~ 1240C. Khó tan trong nước, ít tan trong cồn . Năng suất quay cực + 60,5 0  →  + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 99 0 (C = 0,5%  trong nước) Hằng số pKa= 9,36 Sau khi uống Zidovudin  khoảng 0,5­ 1giờ, sinh khả dụng 60­70%, bị  ảnh hưởng   khi ăn nhiều chất béo. Đạt Tmax  khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau  khi uống 250mg là khoảng 1,2 μg/ml.        *Nevirapin 6
  16.                                            (NVP) Công thức phân tử C15H14N4O. Phân tử lượng 266.888 g/mol. Tên khoa học:  11­cyclopropyl­4­methyl­5,11­dihydro­6H­   dipyrido[3,2­b:2′,3′­e][1,4]diazepin­6­ one Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Thực tế  không tan trong  nước, ít tan trong CH3Cl. Năng suất quay cực + 60,5 0  →  + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 99 0 (C = 0,5%  trong nước) Hằng số pKa= 2,42. Sau  khi  uống Nevirapin   khoảng 4 giờ,  sinh khả   dụng >  90%,  không bị   ảnh  hưởng bởi thức ăn hoặc thuốc kháng acid. Đạt T max  khoảng 4h sau khi dùng liều  duy nhất. 1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Tính  đến  31/5/2012,  trên  toàn  quốc  có  66.191 người nhiễm HIV trong  đó  có  62.654  người  lớn  và 3.537 trẻ em, đạt 94,6% kế hoạch năm 2012. Kết quả báo  cáo tại 10 tỉnh có số người được điều trị cao  nhất là  46.332 bệnh  nhân,  chiếm  70% số người nhiễm HIV đang được điều trị trên toàn quốc. Thành phố Hồ Chí  Minh  tiếp  tục  là  thành  phố  dẫn  đầu  cả  nước  về  số  lượng  người  nhiễm  HIV  đang  điều  trị.  Tính  đến  31/5/2012,  thành  phố  Hồ  Chí  Minh  có  20.435  người  nhiễm  HIV  đang  điều  trị,  chiếm  30,9%  số  lượng  bệnh  nhân  đang  điều  trị  trên  toàn quốc[10]. Tốc  độ  tăng  trưởng  bệnh  nhân  điều  trị  ARV  trung  bình  là  950  bệnh  7
  17. nhân/tháng. Phác đồ  bậc  1  chiếm  đa  số  với  tỷ lệ  là  96,76%,  phác  đồ  bậc  2  là  2,97% và có 0,27% thuộc phác đồ khác. ­ Thực  hiện  chỉ  đạo  của  Lãnh  đạo  Bộ  Y  tế tại Quyết  định  số  4139/QĐ­BYT  ngày 26/11/2011  về việc sửa đổi,  bổ sung  một  số nội  dung  “Hướng dẫn chẩn  đoán và điều trị HIV/AIDS” được ban  hành  kèm  theo Quyết  định  số 3003/QĐ­ BYT  ngày  19/8/2009  của Bộ trưởng Bộ Y tế, Cục Phòng, chống HIV/AIDS  đã  ban  hành  các  văn  bản hướng dẫn  về việc điều trị bằng thuốc ARV tại các địa  phương với các nội dung chính như sau: ­ Bệnh  nhân  bắt  đầu  điều  trị   ARV:  Phác  đồ   chỉ   định  là  TDF/3TC/EFV  hoặc TDF/3TC/NVP.  Không  sử  dụng  phác  đồ  có  Stavudin  (d4T)  cho  các  bệnh  nhân bắt đầu điều trị ARV. ­ Đối  với  bệnh  nhân  đang  điều  trị  ARV  với  phác  đồ  có  Stavudin  (d4T):  thay  thế  dần  tiến  đến  loại  trừ  việc  sử  dụng  thuốc  d4T  vào  tháng  6/2013.  Thuốc  d4T chủ yếu được chuyển đổi sang phác đồ có TDF hoặc AZT. Hiện  nay  Cục  Phòng,  chống  HIV/AIDS  đang  điều  phối  toàn  bộ  các  nguồn  thuốc ARV  do  các  chương  trình,  dự  án  hỗ  trợ  để  cung  cấp  thuốc  ARV  điều  trị cho  bệnh  nhân trên toàn quốc. Phối hợp chặt chẽ với các đối tác trong việc  nhập  khẩu  các  dạng  bào  chế  mới  của  thuốc  ARV  nhằm  tăng  cường  sự  tuân  thủ  điều  trị  ở  người  bệnh  đặc  biệt  việc  mua thuốc  viên kết hợp 3 loại thuốc  TDF/3TC/EFV ngày uống 1 lần.[10] Kể  từ  ca nhiễm HIV được phát hiện đầu tiên tại Mỹ  từ  năm 1981, cho đến   nay loài người đã trải qua 30 năm đối phó với một đại dịch quy mô lớn, phức tạp,  tính đến cuối năm 2009, có 33,3 triệu người đang bị  nhiễm HIV,   tỷ  lệ  người   nhiễm HIV trong nhóm tuổi 15­49 là 0,8%. Riêng năm 2009 ước tính có 2,6 triệu   người nhiễm mới HIV và 1,8 triệu người tử  vong do AIDS. So sánh với năm   1999, số  người nhiễm mới HIV đã giảm 21%. Báo cáo UNAIDS cũng ghi nhận  tính cuối năm 2009 đã có 33 nước có số  ca nhiễm mới giảm, trong đó 22 nước   8
  18. khu vực cận Saharan, Châu Phi. Tuy nhiên hiện vẫn còn 7 nước tỷ lệ nhiễm mới   tăng trên 25% khi so sánh giữa năm 1999 và 2009[11]. 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV 1.3.1. Các phương pháp sắc ký (HPLC & HPTLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng   quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau,   nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với   cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định thuốc HIV trong các loại  mẫu khác nhau do có nhiều  ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ  chính   xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng… Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau  khi rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này   đã mở  rộng khả  năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp  HPLC. Đối với phân tích dư  lượng, detector khối phổ  (MS) là một sự  lựa chọn  ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp.  Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP­HPLC) với pha động là  20mM đệm Natri photphats (8mM muối Natrioctanesulphonic acid) : axetolnitril   (04:01,v/v), pH= 3,5 điều chỉnh bằng acid photphoric. Pha tĩnh là Cột C18­ODS  Hypersil (5µm x 250mm x 4,6mm). Thời gian lưu của mỗi chất là Stavudine là  2,85 phút, Lamivudine là 4,33 phút và Nevirapine là 8,39 phút.[26] Xác định bằng   Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với dung môi  pha động là chloroform: methanol(9:1,v/v), pha tĩnh là bản mỏng Silicagen 60F254  và   định   lượng   các   chất   ở   bước   song   hấp   thụ   265nm.   Hệ   số   lưu   giữ   của   Stavudine,  Lamivudine   và  Nevirapine  lần lượt là  0.21­0.27,  0.62­0.72 và  0.82­ 0.93.[26] Xác định thuốc HIV trong huyết tương bằng phương pháp LC­MS/MS với  metaxalone là chất chuẩn nội với giai đoạn đầu tiên là Chiết pha rắn, sau đó sử  dụng cột C18 (5µm x 150mm x 3.9mm) pha động là 0.5% acetic băng trong nước :  9
  19. axetolnitril (20:80,v/v). Các ion được tách ra và theo dõi trên máy phổ khối tứ cực. [21] 1.3.2. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis ­ CE) Gần đây, phương pháp CE được sử  dụng rộng rãi do tính chất  ưu việt về  hiệu quả  tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã  được  ứng dụng để  tách và xác định thuốc HIV trong nhiều đối tượng mẫu khác  nhau. Xác định Lamivudin (3TC), Stavudine( d4T) và Nevirapin (NVP) bằng phương  pháp MEKC. Tác giả đã sử dụng Cột mao quản silica trần dài 73,5 cm (chiều dài  hiệu dụng 62cm), đường kính trong là 75µm. Dung dịch điện li nền bao gồm   10mM sodium tetraborat (pH= 9,8), 100mM sodiumdodecylsunphat (SDS) và 15% (v/v) 2­propanol. Áp thế  20kV.Bơm mẫu bằng áp suất 50mbar trong 9s. Tất cả  các chất được tách ra trong vòng 14 phút. Khoảng tuyến tính 20­200 µg/ml (r 2=  0,9996) cho 3TC; 5­50 µg/ml (r2= 0,9985) cho d4T và  25­250 µg/ml (r 2= 0,9987)  cho NVP[24] Nhóm nghiên cứu đã tách được lamivudin và tạp đồng phân hoàn toàn (độ  phân giải 1,95) với điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung  chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả  39,5 cm,  nhiệt độ cột 250C, điện thế 15 kV, bước sóng phát hiện 270 nm… Về định lượng   lamivudin trong chế phẩm, với dung dịch đệm natri tetraborat (pH khoảng 9,2) và  sự  hiện diện của chất hoạt động bề  mặt là SDS (sodium dodecyl sulfat) có thể  phân tích đồng thời lamivudin và chất phối hợp zidovudin…; điều kiện điện di   thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài   48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 25 0C, điện thế 15 kV, bước sóng  phát hiện 270 nm, dung dịch đệm natri tetraborat 50 Mm chứa 50 mM SDS [9] Micellar điện động sắc ký (MEKC) phương pháp để tách và định lượng đồng   thời lamivudine và zidovudine trong dược phẩm đã được phát triển. Các yếu tố  ảnh hưởng đến sự  tách, chẳng hạn như  pH, nồng độ  chất hoạt động bề  mặt   10
  20. (sodium dodecyl sulfate, SDS), dung môi hữu cơ và điện áp áp dụng đã được tối   ưu hóa. Dung dịch điện ly nền bao gồm 12,5 decahydrate tetraborat mM sodium   và   15   mM   axit   boric   điều   chỉnh   pH   10,8,   có   chứa   90   mM   SDS   5%   (v   /   v)   acetonitrile (ACN) đã được khảo sát là phù hợp cho việc tách các loại thuốc. p­ aminobenzoic acid (PABA) đã được sử  dụng như  là chất chuẩn nội (IS).  Phát  hiện chất phân tích và IS được thực hiện  ở  bước sóng 210 nm. Điện di đồ  đã  được quan sát thấy rằng cả hai loại thuốc và IS đã được di chuyển trong vòng 20  phút ở điện áp 10 kV. Đánh giá của phương pháp này đã được thực hiện về tính  chính  xác,   độ   tuyến  tính,   độ   đúng,   giới   hạn  phát  hiện  (LOD)   và   định  lượng   (LOQ). Khoảng tuyến tính từ  10­80 mg / ml cho Lamivudine và 10­100 mg / ml   cho Zidovudine. Các giới hạn phát hiện cho Lamivudine và Zidovudine được tìm  thấy là 2,5 và 2,0 mg / ml, tương ứng. Phương pháp đã được áp dụng để xác định  đồng thời Lamivudine và Zidovudine trong huyết tương. Độ  thu hồi của cả  hai  thuốc ở dạng bào chế viên thuốc và  trong huyết tương ≥ 99,72% (độ lệch chuẩn   tương đối (RSD) ≤ 1,84%) và ≥80,4% (RSD ≤ 5,4%), tương ứng.[25] 1.4.  Giơi thiêu chung vê ph ́ ̣ ̀ ương phap Điên di mao quan  ́ ̣ ̉ 1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản  Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển ­   Mobility) của các phần tử  chất tan (các ion chất  tan, chất phân tích) trong mao   quản (đường kính 25 ­ 100  m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có   chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được   cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 ­ 30 kV) đặt vào hai đầu mao   quản. Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ  trường điện E điều khiển sự  tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có  nhiều ưu việt, như  tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ  cho sự tách, nhưng   số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao.  11
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
11=>2