Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở Việt Nam

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:67

Thêm vào BST

Báo xấu

66
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn nhằm tiến tới ứng dụng mô hình này nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trên đích phân tử có nguồn gốc từ các cây thuốc, bài thuốc được sử dụng hiệu quả trong y học cổ truyền với các tác dụng chữa bệnh tương ứng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Anh Lƣơng XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO TƢƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHÔNG SỬ DỤNG PHÓNG XẠ PHỤC VỤ ĐỊNH HƢỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Anh Lƣơng XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO TƢƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHÔNG SỬ DỤNG PHÓNG XẠ PHỤC VỤ ĐỊNH HƢỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. ĐINH ĐOÀN LONG Hà Nội – 2011
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS. Đinh Đoàn Long, Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực tập và hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới TS. Trinh Tất Cƣờng, ThS. Trần Thị Thùy Anh, đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong công việc nghiên cứu và hỗ trợ giải quyết những khó khăn gặp phải trong thời gian tôi thực hiện đề tài này. Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các thầy cô Khoa Sinh học trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội và đặc biệt là các thầy cô và các cán bộ giảng dạy, công tác tại bộ môn Di truyền, những ngƣời đã luôn dạy bảo hƣớng dẫn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu tại trƣờng. Và tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn đến các thành viên trong phòng thí nghiệm Sinh học thụ thể và Phát triển thuốc, cảm ơn các bạn đã chia sẻ những niềm vui những khó khăn và cùng thực hiện những nghiên cứu khoa học. Chúc các bạn học tập, làm việc tốt, luôn vui vẻ và có nhiều thành công trên con đƣờng đã chọn. Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và các bạn bè đã luôn góp ý, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt những năm qua. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, tháng 12 năm 2011 Học viên Nguyễn Anh Lƣơng
KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AT I Angiotensin I AT II Angiotensin II BSA Bovine serum albumin ELISA Phản ứng miễn dịch hấp thụ liên kết enzym F-AT II Fluorescein – angiotensin II (angiotensin II đánh dấu fluorescein F-BSA Fluorescein – BSA (BSA đánh dấu fluorescein) GPCR G protein - coupled receptor IC50 Nồng độ ức chế 50% Kd Hằng số phân ly cân bằng Ki Nồng độ chất gắn cạnh tranh mà liên kết với một nửa số vị trí liên kết ở trạng thái cân bằng YHCT Y học cổ truyền
MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Khái quát về lƣợc lý phân tử 3 1.2. Các đích tác dụng của thuốc 3 1.3. Về thụ thể kết cặp G protein (GPCR) 8 1.4. Thụ thể angiotensin II 12 1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu xác định tƣơng tác thụ thể và phối tử 20 1.6. Y học cổ truyền và tài nguyên dƣợc liệu 26 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 36 2.1. Vật liệu 35 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 37 2.2.1. Quy trình chiết xuất dịch chiết methanol 37 2.2.2. Thu thụ thể màng 37 2.2.3. Xác định nồng độ protein sử dụng phƣơng pháp Bradford 38 2.2.4. Phƣơng pháp elisa để xác định lƣợng phối tử gắn fluorescein 39 2.2.5. Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay) 39 2.2.6. Phản ứng tƣơng tác giữa các phối tử đã biết và dịch chiết với thụ thể đích 40 2.2.7. Phƣơng pháp xử lý kết quả 40 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. Xác định nồng độ protein thu đƣợc từ gan chuột 41 3.2. Tối ƣu phản ứng ELISA 43 3.3. Tối ƣu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết 45 3.4. Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa) 46
3.5. Phả ứng cạnh tranh của F-AT II với các phối tử đã biết 47 3.6. Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật 48 Chƣơng 4. KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
MỞ ĐẦU Việt Nam là một trong những nƣớc có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú trên thế giới với hơn 13.200 loài thực vật và khoảng 10.000 loài động vật đã đƣợc xác định, với nhiều nhóm loài sinh vật có tính tính đặc hữu cao, có giá trị khoa học và thực tiễn lớn. Xuất phát từ nền văn hóa đa dạng bản sắc với rất nhiều dân tộc sống trải dài trên khắp lãnh thổ với các điều kiện tự nhiên và lịch sử riêng đã hình thành nên một nền Y học cổ truyền với lịch sử lâu đời hàng nghìn năm, với rất nhiều kinh nghiệm trong sử dụng thuốc trong đời sống. Việc dùng thuốc trong nhân dân đã có từ rất lâu đời, tích lũy dƣới dạng kinh nghiệm, thƣờng chỉ đƣợc truyền miệng qua nhiều thế hệ. Hơn 3800 bài thuốc đã đƣợc sƣu tầm lại, cùng với hàng nghìn bài thuốc lƣu truyền trong dân gian, đặc biệt là trong cộng đồng các dân tộc thiểu số. Tuy nhiên, rất nhiều các bài thuốc và các nguyên liệu làm thuốc nhƣ vậy vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu cơ chế tác động cũng nhƣ cơ sở khoa học vẫn chƣa đƣợc xác định. Có nhiều phƣơng pháp nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trong phát triển thuốc trên thế giới, trong đó phổ biến là phƣơng pháp sử dụng đồng vị phóng xạ (nhƣ 3H, 125I) để nghiên cứu trên các đích phân tử của thuốc. Tuy nhiên, những phƣơng pháp này chƣa đƣợc áp dụng trong điều kiện Việt Nam với nguyên nhân chính là hầu hết các phòng thí nghiệm sinh dƣợc học của ta thiếu trang thiết bị nghiên cứu, bảo quản và loại thải các chất phóng xạ. Vì vậy lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phƣơng pháp đo tƣơng tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hƣớng phát triển thuốc ở Việt Nam” nhằm tiến tới ứng dụng mô hình này nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trên đích phân tử có nguồn gốc từ các cây thuốc, bài thuốc đƣợc sử dụng hiệu quả trong y học cổ truyền với các tác dụng chữa bệnh tƣơng ứng.
Trong Luận văn này, chúng tôi tập trung vào đích phân tử là thụ thể angiotensin II, đây là đích tác dụng đã đƣợc biết của nhiều thuốc có tác dụng hạ huyết áp với cơ chế phân tử đã đƣợc nghiên cứu tƣơng đối rõ, đồng thời bƣớc đầu tiến hành thử nghiệm với một số dịch chiết từ một số cây thuốc Việt Nam đã đƣợc biết trong y học cổ truyền với tác dụng trong điều hòa huyết áp và điều trị các chứng bệnh liên quan đến tim, mạch và hệ tuần hoàn .
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về dƣợc lý phân tử Dƣợc lý phân tử (molecular pharmacology) là môn khoa học nghiên cứu về tƣơng tác của thuốc lên cơ thể sống ở cấp độ phân tử và tế bào, và gồm hai phân môn chính là dƣợc động học (pharmacokinetics) và dƣợc lực học (pharmacodynamics). Dƣợc lý phân tử bao gồm nhiều lĩnh vực nghiên cứu về tác dụng của phân tử thuốc đến toàn bộ cơ thể. Dựa vào những hiểu biết về hóa sinh, sinh lý, bệnh học, sinh học phân tử và hóa hữu cơ để thấy rõ tác dụng của thuốc ở mức độ phân tử đƣa đến áp dụng trong điều trị. Qua dƣợc lý phân tử, chúng ta có thể hiểu sâu sắc cơ chế phân tử tác dụng của thuốc, phát hiện thuốc mới, đề xuất những hƣớng dẫn sử dụng thuốc an toàn, hiệu quả trong điều trị hoặc ngăn chặn những phản ứng có hại của thuốc khi sử dụng. Nội dung chủ yếu của dƣợc lý phân tử là dƣợc lý học về tác dụng của thuốc ở mức dƣới tế bào [2]. Dƣợc lý phân tử thể hiện ở nhiều giai đoạn của phân tử thuốc trong cơ thể, hiện nay dƣợc lý phân tử đƣợc nghiên cứu với các hƣớng chính đó là: 1) Nghiên cứu tác dụng thuốc lên màng tế bào 2) Nghiên cứu hóa sinh dƣợc lý phân tử đối với thụ thể màng tế bào 3) Nghiên cứu hóa sinh dƣợc lý phân tử đối với enzym tế bào 4) Nghiên cứu hóa sinh dƣợc lý phân tử trên gen 1.2. Các đích tác dụng của thuốc Theo phân tích của Overington và cộng sự [38] hơn 21.000 sản phẩm thuốc lƣu hành trên thị trƣờng Mỹ, có nguồn gốc từ 1357 thuốc dƣới các dạng thành phần, các dạng muối, vitamin. Trong đó có 1204 các thuốc phân tử nhỏ, và 166 thuốc sinh học. Khoảng 27% các thuốc này liên quan tới thụ thể kết cặp G protein, 13% tới thụ thể nhân, 7,9% tới các thụ thể liên kết với kênh ion (hình 1.1) [38].
Các thụ thể GPCR Các thụ thể nhân Các kênh ion liên kết phối tử Các kênh ion điện thế Protein liên kết penicillin Enzyme giống nhƣ myeloperoxidase Protein vận chuyển chất dẫn truyền thần kinh DNA topoisomerase typ II Hình 1.1. Phân bố các họ gen với đích tác dụng của các thuốc Fibronectin hiện nay. ( Nguồn: typ III Overington, 2006). Cytochrome P450 Hầu hết các thuốc tác dụng lên cơ thể, tế bào thông qua một số cơ chế phân tử khác nhau. Mỗi cơ chế đƣợc thích ứng thông qua sự tiến hóa của các họ protein riêng, giúp truyền đƣợc nhiều loại tín hiệu. Các họ protein này bao gồm các thụ thể trên bề mặt và bên trong tế bào cùng với các enzym và thành phần khác giúp tạo ra, khuếch đại, phối hợp và kết thúc các tín hiệu từ phân tử tác động là thuốc và các chất nội sinh. Có 5 cơ chế truyền tín hiệu qua màng tế bào cơ bản (hình 1.2) [28]. Mỗi loại sử dụng một chiến lƣợc khác nhau để vƣợt qua các rào cản là lớp kép phospholipid của màng tế bào. Các chiến lƣợc đƣợc sử dụng là (1) phối tử (ligand) tan trong lipid vƣợt qua màng sinh chất và tác động lên một thụ thể nội bào; (2) protein thụ thể xuyên màng có hoạt tính enzym nội bào đƣợc điều khiển dị lập thể bởi một phối tử liên kết vào một vị trí trên miền ngoại bào của protein này; (3) thụ thể xuyên màng liên kết và kích thích một protein kinase; (4) kênh ion liên kết với tƣơng tác với phối tử ( điều khiển hoạt động của kênh bằng liên kết với phối tử); hoặc (5) protein
thụ thể xuyên màng kích thích G protein, từ đó điều khiển một chất truyền tin thứ 2 trong tế bào. Hình 1.2. Các cơ chế truyền tín hiệu cơ bản. Cơ chế thứ nhất (1) Một phân tử tín hiệu (phối tử) hóa học hòa tan trong lipid đi qua màng sinh chất và tác động lên các thụ thể nội bào (mà có thể là một enzym hoặc một yếu tố điều hòa sự phiên mã của gen). (2) Phân tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào của một protein xuyên màng, qua đó kích hoạt hoạt tính enzym của miền nội bào của protein này. (3) Phân tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào của một thụ thể liên kết xuyên màng với một protein kinase, làm kích hoạt protein kinase này. (4) Phân tử tín hiệu liên kết và trực tiếp điều khiển việc mở một kênh ion. (5) phân tử tín hiệu liên kết với một thụ thể bề mặt tế bào mà liên kết với một enzym tác động bởi một G protein. (A, C: cơ chất; B, D: sản phẩm; R: thụ thể; G: G protein; E: tác động (enzym hoặc kênh ion); Y: tyrosine; P: phosphate). (Nguồn: Katzung, 2007) Các đích phân tử chính của phần lớn các dƣợc phẩm hiện nay bao gồm các nhóm đƣợc nêu ở các mục dƣới đây [48]: 1.2.1. Thụ thể kết cặp G protein (GPCR) Hơn 26% các thuốc đƣợc bán trên thị trƣờng có liên quan tới nhóm thụ thể này; đây là nhóm thụ thể phổ biến đƣợc biểu hiện trên bề mặt của nhiều loại tế bào.
Protein liên kết vào màng tế bào thông qua 7 lần xuyên màng, do đó còn đƣợc gọi với tên khác là thụ thể 7 lần xuyên màng (hay 7TM). Các G protein là các phân tử kết cặp với loại thụ thể này để truyền tín hiệu đƣợc sinh ra sau khi phối tử (hay chất gắn đặc hiệu) liên kết vào thụ thể rồi truyền tín hiệu vào trong tế bào. Hệ gen ngƣời có hơn 1000 gen mã hóa cho các GPCR, trong đó ƣớc tính có khoảng 400 GPCR có tiềm năng là các đích tác dụng của các loại thuốc. Các nghiên cứu về vai trò, chức năng của các thụ thể GPCR vẫn đang tiếp tục đƣợc triển khai và phát triển. 1.2.2. Các thụ thể nhân (NR) Các thụ thể này liên kết với các phối tử bên trong tế bào và về số lƣợng có lẽ ít hơn nhiều so với các thụ thể trên màng tế bào. Sau khi phối tử liên kết, một phức hợp đƣợc hình thành giữa thụ thể và phối tử đi vào trong nhân tế bào để “đóng” hoặc “mở” các gen đặc trƣng. Các thụ thể nhân liên kết với các phân tử ƣa lipid nhƣ các dẫn xuất của steroid, retinoid (nhƣ các hoocmon giới tính và vitamin A) có ảnh hƣởng sâu sắc tới sinh lý con ngƣời. Hệ gen ngƣời mã hóa cho khoảng 50 thụ thể nhân, một nửa số đó là các thụ thể độc thân (orphan receptor), nghĩa là các thụ thể chƣa xác định đƣợc phối tử đặc hiệu. 1.2.3. Thụ thể cytokine Một họ các protein có nhiều hơn 1 chuỗi protein đƣợc nhúng vào màng tế bào. Các phối tử cytokine là các protein nhƣ interleukin, interferon và các yếu tố tăng trƣởng. Vì các phân tử nhỏ không thể phá vỡ liên kết của cytokine liên kết với thụ thể của nó, nên các thuốc đƣợc sử dụng thƣờng là các protein lớn hơn. Đó là các kháng thể hoặc các dạng tái tổ hợp của thụ thể mà hoạt động nhƣ những cái bẫy để ngăn cản sự liên kết của phối tử vào thụ thể. 1.2.4. Các protease Đó là những enzym cắt protein ở những điểm xác định bởi các trình tự axit amin đặc hiệu. Các protease có nhiều vai trò trong cơ thể, nhƣ tham gia phản ứng đông máu, sản xuất các hoocmon peptit và cần cho chu kỳ sống của các virut nhƣ HIV. Mặc dù các thuốc ức chế protease hiện vẫn là một thách thức lớn trong nghiên
cứu thuốc, nhƣng đã có một số thuốc đã đƣợc thƣơng mại hóa có đích tác dụng là lớp enzym này. 1.2.5. Các protein kinase Đây là một họ enzym lớn giúp gắn nhóm photphat (-PO3) vào một phân tử protein để họa hóa nó trong tế bào. Quá trình photphoryl hóa đƣợc dùng để chuyển tín hiệu từ ngoài tế bào qua các thụ thể trên màng để đi vào nhân tế bào, ở đó chúng khởi động sự biểu hiện của gen. Kinase có vai trò đặc biệt trong sự phát sinh ung thƣ bởi vì các tế bào sinh trƣởng phụ thuộc vào các yếu tố tăng trƣởng bên ngoài là một kết quả của các enzym kinase đặc hiệu trở nên hoạt hóa thƣờng xuyên. Việc ức chế protein kinase hiện nay là một hƣớng lớn trong tìm kiếm thuốc phân tử nhỏ. 1.2.6. Các protein phosphatase Đây là những enzym có vai trò xúc tác các phản ứng ngƣợc chiều so với các enzym kinase, chúng loại bỏ nhóm photphat của protein. Đây cũng là một cơ chế quan trọng để truyền tín hiệu tế bào, vì nó hoạt động nhƣ một “công tắc đóng” để điều khiển các quá trình quá mức trong tế bào. 1.2.7. Các enzym khác Các họ protein và enzym đƣợc liệt kê trên tạo nên phần lớn các đích tác dụng của thuốc hiện nay. Ngoài ra còn các enzym khác, có thể kể đến các chất ức chế HMG-CoA reductase (đƣợc biết nhƣ là các statin) làm giảm cholesterol và các chất ức chế phosphodiesterase (PDE), trong đó Viagra là một ví dụ đƣợc biết nhiều nhất. 1.2.8. Các kênh ion Các ion là những nguyên tử hay phân tử tích điện. Các ion kim loại, nhƣ Ca 2+, Na+ và K+ , đóng vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình sinh lý của cơ thể. Các ion đi qua các lỗ trên màng tế bào còn đƣợc gọi là các kênh ion. Hai loại kênh ion chính đƣợc biết là các kênh ion đƣợc đóng mở bởi phối tử và kênh ion đƣợc đóng mở bởi điện thế (ligand-gated and voltage-gated ion channels.). Mỗi kênh có tính chọn lọc cho một ion đặc trƣng và cho phép các ion qua màng từ ngoài vào trong hoặc ngƣợc
lại. Sự di chuyển của ion trong hoạt động của các tế bào thần kinh và liên quan tới các điều kiện nhƣ động kinh, đau và rối loạn nhịp tim. Đó là những điều đáng quan tâm nhất của các kênh ion là đích của thuốc, với một số các thuốc quan trọng đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng. 1.2.9. Các protein vận chuyển Các protein vận chuyển làm nhiệm vụ vận chuyển các phân tử bên trong cơ thể, đặc biệt là vận chuyển qua màng tế bào trong khi bình thƣờng các phân tử đó sẽ bị ngăn chặn bởi màng tế bào. Chẳng hạn nhƣ các phân tử chất dinh dƣỡng đƣợc vận chuyển qua dạ dày bởi các protein vận chuyển. Protein vận chuyển là mục tiêu phân tử của thuốc điều trị một số bệnh, chẳng hạn nhƣ một số chứng bệnh trầm cảm liên quan đến sự thiểu năng serotonin trong não. Các chất vận chuyển monoamine loại bỏ serotonin từ tế bào thần kinh, nhƣng chất dẫn truyền thần kinh này có thể đƣợc duy trì ở mức cao hơn bằng cách ức chế vận chuyển bởi các loại thuốc nhƣ fluoxetine (Prozac®), do đó làm giảm các triệu chứng trầm cảm. Các đích protein vận chuyển khác đƣợc quan tâm nhƣ các chất vận chuyển glucose, khi bị ức chế có thể có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh tiểu đƣờng. 1.3. Về thụ thể kết cặp G protein Thụ thể là các phân tử kích hoạt điều hòa một loạt các quá trình trao đổi chất và sinh lý trong tế bào cũng nhƣ ở các tổ chức phức tạp hơn. Trong dƣợc lý giác quan, thụ thể là các protein chuyển đổi một chiều và có chọn lọc của một phân tử truyền tín hiệu nội sinh hoặc các chất tổng hợp tƣơng tự của chúng, trải qua biến đổi thông tin, và sửa đổi một đáp ứng tế bào nhƣ một hệ quả. Nhóm thứ nhất là các thụ thể nội bào của các siêu họ thụ thể nhân và các thụ thể hoocmon steroid, retinoid và thyroid. Nhóm thứ hai là các thụ thể liên kết với màng tế bào, nhóm này rất đa dạng. Các thụ thể này giúp chuyển đổi tín hiệu từ bên ngoài vào trong tế bào đáp ứng. Siêu họ này gồm có các thụ thể kết cặp kênh ion, thụ thể kết cặp kinase và họ lớn các thụ thể kết cặp G protein. 1.3.1. Cấu trúc của các thụ thể kết cặp G protein
Các thụ thể kết cặp G protein (GPCR) là các protein xuyên màng với đặc điểm đặc trƣng chung là xoắn 7 lần xuyên màng (cấu trúc bậc 2 xoắn ). Các phối tử nội sinh của chúng có thể là các chất tín hiệu monoamine (epinephrine, acetylcholine, serotonin, histamine, dopamine), lipid (các prostaglandin, các lipid nội sinh) các peptid thần kinh (neuropeptide Y, cơ chất P, cholecystokinin, các opioid và các hoócmôn peptide (glucagon, angiotensin, bradykinin) cũng nhƣ các protein nhỏ (các chemokine) và các protein lớn (các hoocmon glycoprotein, thrombin). Tất cả các GPCR chuyển các tín hiệu của chúng vào bên trong tế bào thông qua sự tƣơng tác với các G protein dị hình. Thêm vào đó, các protein giác quan quan trọng nhƣ thụ thể rhodopsin và các thụ thể khứu giác cũng thuộc họ này. Kích thƣớc của các loại GPCR rất khác nhau, từ ít hơn 300 axit amin nhƣ thụ thể adrenocorticotropin, tới hơn 1100 axit amin đối với các thụ thể metabotropic glutamate. Các thụ thể với các biến đổi sau dịch mã khác nhau nhƣ glycosyl hóa, thƣờng dẫn đến khối lƣợng phân tử cao hơn so với các trình tự axit amin ban đầu. Các biến đổi khác bao gồm cầu disulfide và palmitoyl hóa ở các vị trí đặc biệt. Đa số các GPCR đƣợc phân loại bằng các trình tự tƣơng đồng ban đầu và các họ phụ đƣợc đặt tên bằng những đặc điểm đặc trƣng nhất của các thành viên. Trong khi mức độ tƣơng đồng thấp chỉ đƣợc tìm thấy ở các đoạn vòng, thì các đoạn xoắn xuyên màng 7 lần có 20 - 25 axit amin kỵ nƣớc ở mức độ bảo thủ cao [6]. Cơ chế kinh điển hoạt động chức năng của GPCR đƣợc xác định bởi sự kết cặp của chúng với các protein liên kết với nucleotide guanine (G protein) [9]. Thông thƣờng, một GPCR ở trạng thái nghỉ ngơi hay ái lực thấp khi thiếu các chất chủ vận (agonist). Sự liên kết của một chất chủ vận tới một thụ thể kích thích một sự biến đổi trong cấu trúc của thụ thể và hình thành một phức hệ với các G protein nội bào (hình 1.3). G protein dị hình có chứa một tiểu phần liên kết với màng là Gα và các tiểu phần di động là Gβ và Gγ. Phân tích di truyền học hiện đại có thể xác định đƣợc một số tiểu đơn vị G protein tạo thành 16 Gα, 5 Gβ và 12 Gγ nhƣ hiện nay đã đƣợc nhân dòng và xác định trình tự [39]. Tiểu phần Gα liên kết GTP và
GDP và nó gây ra thủy phân GTP. Các tiểu phần Gβ và Gγ hình thành một phức hệ theo tỉ lệ 1:1. Các đáp ứng tế bào Các chất truyền tin thứ 2 Angiogenesis, ung thƣ, phát triển, PLCβ, DAG, Ca2+, PKA, PKC biệt hóa Hình 1.3. GPCR tuyền tín hiện thông qua các G protein. Sự tƣơng tác với chất chủ vận dẫn đến thay đổi cấu hình của thụ thể và tới sự kết cặp với các G protein. Kết quả là sự hoạt hóa của chuỗi truyền tín hiệu thông qua tiểu đơn vị G α. Gβ và Gγ cũng có thể gây ra các đáp ứng tế bào. A: chất chủ vận (agonist) hoặc đối vận (antagonist). DAG: diacylglycerol. PI3Kγ: phosphoinositide 3-kinase-γ. PLCβ: phospholipase Cβ. PKA, PKC: protein kinase A và C. (Nguồn: Birnbaumer, 1990). Sau khi GPCR và G protein tƣơng tác (kết cặp), GDP đƣợc giải phóng và đƣợc thay thế bởi GTP, sau đó tiểu phần Gα đƣợc phân ly từ phức Gβγ. Cả hai tiểu phần Gα và phức kép Gβγ có thể hoạt hóa các phân tử gây ra đáp ứng nội bào. Ví dụ Gα có thể hoạt hóa enzym adenyl cyclase, dẫn đến làm tăng lƣợng cAMP; phân tử
này đến lƣợt nó làm giảm hoạt tính protein kinase A (PKA). PKA là một enzym serine-threonine kinase có chức năng photphoryl hóa, qua đó hoạt hóa nhiều yếu tố phiên mã, các kinase và các thụ thể GPCR khác. Bảng 1.1. Các G protein và chức năng trong sự truyền tin của tế bào G protein Chức năng trong truyền tin tế bào Gαq, Gα11 Hoạt hóa phospholipase C; điều hòa hoạt động của phospholipase C đặc hiệu phosphoinositide Gα14, Gα15, Gα16 Hoạt hóa Rho GEF Gαs Hoạt hóa adenylyl cyclase; RGS-PX1 hoạt động nhƣ một protein hoạt hóa GTPase cho Gαs Gαo1f Tƣơng tác kênh Ca2+; kích hoạt c-Src tyrosine kinase Gαi Ức chế adenylyl cyclase; kích hoạt c-Src tyrosine kinase Gαo Hoạt hóa kênh K+; tăng K+ dẫn đến phân cực quá mức Gαz Giao tiếp tế bào thông qua Rap1GAP1 Gα12 Hoạt hóa yếu tố Rho Gα13 E-Cadherin; giải phóng β-catenin GαT Tăng cGMP phosphodiesterase Gαgust G protein chuyên biệt tế bào vị giác Gβγ Hoạt hóa các kênh K+ GIRK GIRKs Hoạt hóa adenylyl cyclase; hoạt hóa phospholipase C (Nguồn: Lundstrom, 2006),
Các loại tiểu phần Gα khác nhau đóng vai trò quyết định đến truyền tín hiệu và có thể đƣợc chia thành bốn nhóm. Tiểu phần Gαs kích thích adenylyl cyclase, trong khi đó tiểu phần Gαi ức chế adenylyl cyclase và hoạt hóa kênh điều chỉnh ion K + liên kết G protein (GIRK). Gαq gây ra hoạt hóa phospholipase C và Ga12 hoạt hóa các yếu tố trao đổi guanidine nucleotide của Rho (Rho GEFs). Phức kép Gβγ có thể độc lập hoạt hoá các kênh GIRK, adenylyl cyclase và các phospholipase. Các chức năng khác của các tiểu phần G protein đƣợc nêu trên bảng 1.1 [32]. 1.3.2. Thụ thể kết cặp G protein là đích của tìm kiếm thuốc Khoảng 25% tổng số thuốc tân dƣợc đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị hiện nay có đích tác động là các GPCR; điều này làm cho GPCR trở thành các đích phổ biến nhất trong việc tìm thuốc trong công nghiệp dƣợc dẫn đến sự phát triển của các loại thuốc bán chạy trên thị trƣờng hiện nay bao gồm salmeterol, olanzapine, clopidrogel, losartan và risperidone. Chúng và các thuốc khác nhắm vào đích là các GPCR đƣợc dùng để điều trị nhiều trạng thái bệnh khác nhau tác động lên hệ tim mạch và hệ thần kinh trung ƣơng, hệ tiêu hóa và các chức năng tiêu hóa cũng nhƣ ung thƣ, đau, và dị ứng. Rất lâu trƣớc khi chúng ta hiểu về các hoạt tính hóa học và phân tử của các GPCR, con ngƣời đã sử dụng các sản phẩm tự nhiên của cà độc dƣợc, của lúa mạch và thuốc phiện từ các nguồn khác nhau của thực vật để tìm ra các tác động dƣợc lý ở các đích chƣa biết để điều trị một số bệnh tật. Cho đến đầu thế kỷ 20, ý tƣởng về thụ thể đƣợc đặt ra khi Paul Ehrlich chỉ ra rằng các cơ chất thuốc có thể tƣơng tác với thụ thể hóa học (chemoreceptor) đơn lẻ và tạo ra các tác động dƣợc lý. Các nhà dƣợc lý học hàng đầu khác bao gồm Henry Dale, Otto Loewi, R.P. Ahlquist, và James Black đã có công trong việc miêu tả hoạt động của các hợp chất ở các thụ thể về sau này đƣợc xác định là các GPCR, đặt nền móng cho việc thiết kế thuốc dựa trên sự tƣơng tác của chúng với các đích phân tử. 1.4. Thụ thể angiotensin
Angiotensin là một hoocmon peptide có vai trò quan trọng trọng cơ thể, gây co thắt mạch và tăng huyết áp. Angiotensin là một phần của hệ renin-angiotensin, đây là một đích chủ yếu của các thuốc điều hòa huyết áp. Angiotensin cũng kích thích sự giải phóng aldosterone - một hoocmon khác từ vỏ tuyến thƣợng thận. Aldosterone tăng cƣờng sự lƣu giữ natri trong ống sinh niệu ngoại biên ở thận, làm huyết áp tăng. Angiotensin có nguồn gốc từ phân tử angiotensinogen, một globulin huyết thanh dài 452 axit amin, đƣợc sản xuất trong gan và có vai trò quan trọng trong hệ renin - angiotensin. Angiotensin đƣợc phân lập một cách độc lập ở Indianapolis (thuộc tiểu bang Indiana – Hoa kỳ) và Argentina vào cuối những năm 1930 (với tên gọi tƣơng ứng là „Angiotonin‟ và „Hypertensin‟). Angiotensin I (AT I) đƣợc tạo thành bởi hoạt động của renin trên angiotensinogen. Renin cắt liên kết peptide giữa leucine (Leu) và valine (Val) trên angiotensinogen tạo ra chuỗi peptide gồm mƣời axit amin là angiotensin I. Angiotensin I dƣờng nhƣ không có hoạt tính sinh học và tồn tại chỉ nhƣ chất tiền thân của angiotensin II (AT II). Angiotensin I đƣợc chuyển thành angiotensin II qua việc loại bỏ 2 axit amin đầu C bởi enzym chuyển hóa angiotensin (ACE; đung cũng là một kinase) mà chủ yếu thông qua ACE trong thận. Angiotensin II hoạt động nhƣ một nội tiết tố hay hoocmon nội bào. Angiotensin II làm tăng huyết áp bằng cách kích thích các protein G q trong các tế bào cơ trơn mạch máu (lần lƣợt kích hoạt co bởi một cơ chế phụ thuộc vào IP3). Angiotensin II tác động trực tiếp trên tiểu cầu (zona glomerulosa) của vỏ thƣợng thận để kích thích sinh tổng hợp aldosterone. Ở nồng độ cao hơn, angiotensin II cũng kích thích sự sinh tổng hợp glucocorticoid. Angiotensin II hoạt động trên thận gây co mạch thận, tăng tái hấp thu natri ở ống lƣợn gần, và ức chế tiết renin. Angiotensin II còn là yếu tố phân chia tế bào cho các tế bào cơ tim mạch và tim và có thể đóng góp vào sự phát triển của phì đại tim mạch. Nó cũng tạo nên một loạt các hiệu ứng quan trọng về nội mô mạch máu [28].