Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của zerumbone

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:115

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm tổng hợp một số dẫn xuất mới có chứa các nhóm thế khác nhau dựa trên bộ khung của zerumbone; lựa chọn, sàng lọc thử hoạt tính gây độc tế bào đối với một số dòng tế bào ung thư người, làm cơ sở định hướng cho việc khai thác một số các hợp chất mới có hoạt tính tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh cũng như hỗ trợ nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe con người.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của zerumbone

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TRẦN VĂN KẾT --------------------------- TRẦN VĂN KẾT CHUYÊN NGÀNH KỸ THUẬT HÓA HỌC TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ZERUMBONE LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH KỸ THUẬT HÓA HỌC KHOÁ 2015B HÀ NỘI - NĂM 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --------------------------- TRẦN VĂN KẾT TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ZERUMBONE Chuyên ngành: Kỹ thuật hóa học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH KỸ THUẬT HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. LƯU VĂN CHÍNH 2. PGS. TS. VŨ ĐÌNH HOÀNG HÀ NỘI - NĂM 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nghiên cứu nêu trong Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật “Tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của Zerumbone” được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Lưu Văn Chính thuộc Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong các công trình nghiên cứu trước đây. Toàn bộ các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc xuất xứ. Luận văn thuộc chuyên ngành Kỹ thuật hóa học - Viện Kỹ thuật Hóa học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội./. Học viên Trần Văn Kết
LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn Thầy hướng dẫn khoa học TS. Lưu Văn Chính, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS. TS. Vũ Đình Hoàng, Bộ môn Công nghệ Hóa dược & Bảo vệ thực vật, Viện Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện Luận văn. Xin chân thành cảm ơn tập thể các cán bộ nhóm Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ quá trình thực hiện Luận văn. Xin chân thành cảm ơn đơn vị, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã kịp thời động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình làm Luận văn./. Hà Nội, ngày tháng 9 năm 2017 Tác giả Luận văn Trần Văn Kết
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các phương pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography: Sắc ký cột Các phương pháp phổ HRMS High resolution Mass Spectroscopy: Phổ khối lượng phân giải cao FT-ICRMS Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectroscopy: Phổ khối ion hóa phun điện IR Infrared Spectroscopy: Phổ hồng ngoại UV Ultraviolet spectroscopy 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation: Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation: Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt nhân s: singlet d: doublet t: triplet q: quartet qui: quintet m: multiplet dd: double doublet br: broad Các chữ viết tắt khác The half maximal inhibitory concentration: Nồng độ tác dụng ức chế 50% IC50 sự tăng sinh dòng tế bào thử nghiệm LD50 Lethal dose 50%: liều gây chết 50% cá thể nghiên cứu MIC Minimum inhibitory concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu Tnc Nhiệt độ nóng chảy Hep-G2 Human Hepatocellular carcinoma: Dòng tế bào ung thư gan RD Human Rhabdomyosarcoma: Dòng tế bào ung thư mô liên kết (màng tim) Lu Lung cancer: Dòng tế bào ung thư phổi FL Human Uterine: Dòng tế bào ung thư màng tử cung SW480 Dòng tế bào ung thư đại tràng MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú P338 Dòng tế bào ung thư bạch cầu chuột
HIV-1 Human immunodeficiency virus type 1 FPP fanesyl diphosphate ZSS1 enzyme a-humulene synthase NF-KB Nuclear factor-kappaB DMSO Dimethyl sulfoxide TMS Tetramethyl silan DMF Dimethylformamide THF Tetrahydrofuran EtOAc Ethylacetate TCA Trichloroacetic acid m-CPBA meta-Chloroperbenzoic acid PTSA p-Toluenesulfonic acid (pTsOH) , tosylic acid (TsOH) THP Tetrahydropyranyl IDO Indoleamine-2,3-dioxygenase TDO Tryptophan 2,3-dioxygenase NCI National Cancer Institute DIPEA diisopropylethylamine xtcp xúc tác chuyển pha
MỤC LỤC MỞ ĐẦU.................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Zerumbone và các dẫn xuất…………………………………………………… 2 1.1. Nguồn gốc, tính chất vật lý và cấu trúc của zerumbone…………………. 2 1.2. Phương pháp phân lập Zerumbone từ tự nhiên…………………………... 5 1.3. Hoạt tính sinh học của zerumbone………………………………………... 6 1.4. Khả năng chuyển hóa tạo các dẫn xuất của zerumbone………………….. 11 2. Giới thiệu một số hợp chất ức chế được sử dụng trong tổng hợp thuốc………. 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………….. 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………. 20 2.3. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu………………………………………………... 21 2.4. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity)…………………… 22 2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự hình thành và phát triển khối u ba chiều trên thạch mềm in vitro………………………………………………... 23 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Tổng hợp các dẫn xuất của azazerumbone………………………………….. 26 3.1.1. Tổng hợp zerumbone oxime……………………………………………. 26 3.1.2. Chuyển vị Beckman zerumbone oxime………………………………… 26 3.1.3. Phản ứng N-Axyl hóa tạo hợp phần trung gian 53……………………... 27 3.1.4. Phản ứng N-alkyl giữa hợp chất trung gian 53 với các dẫn xuất piperrazin (55a-c) và 1,2,3-benzotriazole……………………………… 28 3.2. Tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone……………………………………… 31 3.2.1. Phản ứng brom hóa với tác nhân NBS tạo hợp phần trung gian 54……. 31 3.2.2. Quy trình cho phản ứng giữa chất trung gian 54 với các amine 58a-f và 31 1,2,3-benzotriazole.......................................................................................... CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tổng hợp các dẫn xuất của azazerumbone………………………………….. 36 4.1.1. Tổng hợp các azazerumbone…………………………………………… 36 4.1.2. Tổng hợp, hợp phần trung gian 53……………………………………… 37 4.1.3. Phản ứng N-ankyl hóa tạo các dẫn xuất 56a-c và 57…………………... 40 4.2. Tổng hợp các dẫn xuất mới của zerumbone qua nối đôi biệt lập ở vị trí số 6. 43 4.2.1.Tổng hợp chất trung gian 54…………………………………………….. 43
4.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất mới bằng phản ứng N-alkyl hóa với hợp chất trung gian 54…………………………………………………………………... 44 4.2.3. Xác định cấu trúc các dẫn xuất mới của zerumbone (59a-f, 60a-b).… 45 4.3. Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất mới tổng hợp………………………….. 48 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitrocủa các dẫn xuất……………………… 48 4.3.2. Kết quả thử nghiệm hoạt tính trên thạch mềm…………………………. 50 KẾT LUẬN………………………………………………………………………… 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 53 PHỤ LỤC…………………………………………………………………………... 60
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU Hình 1.1: Dạng phổ proton mái nhà của ketone vòng α,β-không no………………… 5 Hình 1.2. Hoạt tính gây độc tế bào của một số dẫn xuất có chứa 1,2,3-triazole...… 18 Hình 4.1. Phổ 13H-NMR của hợp phần trung gian 53…………………………………. 38 Hình 4.2. Phổ 13C-NMR của hợp phần trung gian 53…………………………………. 39 Hình 4.3. Phổ MS của hợp phần trung gian 53………………………………………… 39 Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 57………………………..………………………. 41 Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất 57……………..………………..…….………… 42 Hình 4.6. Phổ MS của hợp chất 57…………………………………….………………… 42 Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất trung gian 59…………………………………… 44 Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất 59a………………………………………………. 46 Hình 4.9. Phổ 13C-NMR của họp chất 59a………………………………………………. 46 Hình 4.10. Phổ HSQC của hợp chất 59a……………….………………………………. 47 Hình 4.11. Phổ HMBC của hợp chất 59a………………………………………………. 47 Hình 4.12. Phổ HRMS của hợp chất 59a……………………………………………….. 48 Hình 4.13. Cấu trúc của hợp chất 59a và tương tác trong phổ HMBC…………….. 48 Sơ đồ 1.1: Sinh tổng hợp của zerumbone ở thực vật…………………………………… 2 Sơ đồ 1.2. Các chuyển hóa xảy ra ở nhóm C=O của zerumbone…………………….. 12 Sơ đồ 1.3. Sơ đồ chuyển vị Beckmann…………………………………………………… 12 Sơ đồ 1.4. Cơ chế chuyển vị Beckmann………………………………………………….. 13 Sơ đồ 1.5. Các chuyển hóa xảy ở hệ liên hợp ketone vòng α,β-không no…………. 14 Sơ đồ 1.6. Sơ đồ chuyển hóa mở rộng vòng của zerumbone………………………….. 14 Sơ đồ 1.7. Cơ chế chuyển vị tạo vòng polycyclic……………………………………….. 15 Sơ đồ 1.8. Cơ chế chuyển vị tạo vòng polycyclic theo Kitayama………………………. 16 Sơ đồ 1.9. Cơ chế mở vòng epoxy của zerumbone oxide………………………….. 16 Sơ đồ 1.10. Sự phân cắt vòng ở vị trí 1-2 của zerumbone…………………………….. 17 Sơ đồ 1.11. Sự phân cắt vòng ở vị trí 2-3 của zerumbone…………………………….. 17 Sơ đồ 3.1: Các chuyển hóa thực hiện trong luận văn………………………………….. 24 Sơ đồ 4.1. Chuyển vị Beckmann tạo các azazerumbone………………………………. 36 Sơ đồ 4.2. Phản ứng N-axyl hóa tạo hợp chất trung gian 53……………………… 37 Sơ đồ 4.3. Phản ứng N-ankyl hóa tạo các hợp chất 56 a-c, 57.…………………… 40 Sơ đồ 4.4. Phản ứng brom hóa tạo các hợp chất trung gian 54…………………… 43
Sơ đồ 4.5. Các dẫn xuất mới được tạo thành qua nối đôi ở vị trí số 6………………. 45 Bảng 1: Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất mới tổng hợp…………………... 50 Bảng 2. Hình ảnh hiển vi của các khối u dưới tác dụng của chất thử....................... 51
PHỤ LỤC
MỞ ĐẦU Ngày nay việc nghiên cứu, tìm kiếm các chất mới nguồn gốc từ thiên nhiên mà có hoạt tính sinh học để sử dụng làm chất dẫn đường nhằm thiết kế, tổng hợp các chất có thể sử dụng làm thuốc hay trong thiết kế thuốc luôn là một mục tiêu quan trọng của các nhà khoa học trên thế giới. Zerumbone là thành phần chính trong tinh dầu cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Smith) phân bố phổ biến ở Việt Nam và Đông Nam Á. Các kết quả nghiên cứu cả in vitro và in vivo đều khẳng định zerumbone là chất chống ung thư mạnh, sesquiterpen này ức chế có hiệu quả sự phát triển nhiều dòng tế bào ung thư người như ung thư gan, ung thư cổ tử cung, ung thư vú, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư máu, ung thư da, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tụy [6]. Trong đó nhóm ketone vòng α,β-không no được xác định là trung tâm của nhiều hoạt tính sinh học quý giá như hoạt tính kháng viêm [36], hoạt tính chống sốt rét, hoạt tính chống ký sinh trùng [16], hoạt tính chống huyết áp [38]… đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào và khả năng thúc đẩy quá trình tự chết của các tế bào ung thư [2]. Do vậy việc nghiên cứu, tổng hợp các dẫn xuất mới của zerumbone và thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng có ý nghĩa vô cùng quan đối với sự phát triển của ngành dược nói chung và các thuốc chống ung thư nói riêng. Nhằm đóng góp thêm những nghiên cứu mới về đối tượng này, chúng tôi lựa chọn đề tài “Tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của zerumbone". Luận văn có hai nhiệm vụ chính gồm: - Tổng hợp một số dẫn xuất mới có chứa các nhóm thế khác nhau dựa trên bộ khung của zerumbone. - Lựa chọn, sàng lọc thử hoạt tính gây độc tế bào đối với một số dòng tế bào ung thư người, làm cơ sở định hướng cho việc khai thác một số các hợp chất mới có hoạt tính tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh cũng như hỗ trợ nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe con người. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Zerumbone và các dẫn xuất 1.1. Nguồn gốc, tính chất vật lý và cấu trúc của zerumbone Zerumbone hay (2E,6E,10E)-2,6,9,9-tetramethylcycloundeca-2,6,10-trien-1- one là một sesquiterpen ketone vòng α,β - không no, là thành phần chính trong tinh dầu thân rễ cây gừng gió Zingiber zerumbet mọc hoang trên khắp cả nước. Zerumbone được Dev S. và cộng sự phân lập lần đầu tiên từ tinh dầu củ cây gừng gió vào năm 1960 [9], xác định cấu trúc vào năm 1965 [8] sau đó cấu trúc này được được khẳng định lại bằng phổ NMR [10] và tia X [14]. Trong thực vật, zerumbone được sinh tổng hợp từ farnesyl diphosphate (FPP) nhờ enzyme đóng vòng terpene (terpencyclase), cụ thể trong sinh tổng hợp zerumbone vòng humulene được hình thành từ farnesyl diphosphate nhờ enzyme alpha-humulene synthase (ZSS1), một enzyme P450 khác là CYP71BA1 xúc tác cho phản ứng hydroxyl hóa ở vị trí C-8 của vòng humulene để tạo thành zerumbol với đặc thù lập thể riêng biệt. Cuối cùng enzyme dehydrogenase xúc tác cho quá trình oxi hóa nhóm OH mới sinh để tạo thành zerumbone [57]. Sơ đồ 1.1: Sinh tổng hợp của zerumbone ở thực vật Zerumbone có công thức phân tử C15H22O, khối lượng phân tử 218,3 là tinh thể hình kim màu trắng có nhiệt độ nóng chảy 65,30C, nhiệt độ sôi 321-3220C ở 760mmHg. Zerumbone tan tốt trong các dung môi như ethanol, DMSO, trong nước ở 250C nó có độ tan 1,296 mg/L. Zerumbone có độ ổn định tối thiểu 2 năm khi được bảo quản dưới -200C [42] Zerumbone là một sesquiterpen đơn vòng 11 cạnh [22], trong cấu trúc có chứa 3 liên kết đôi và một liên kết C=O, trong đó 1 liên kết đôi độc lập ở C-6, 2 liên 2
kết đôi ở C-2 và C-10; liên kết đôi ở C-2 là ít bị cản trở nhất do nó cách xa nhóm thế gem-dimethyl ở vị trí C-9. Bức xạ tia X cho thấy zerumbone nằm trong một mặt phẳng hơi méo và vuông góc với mặt phẳng chứa liên kết đôi độc lập ở vị trí C6 [25] và cấu trúc của zerumbone có dạng: O 12 11 2 1 15 10 3 4 9 5 14 7 6 8 13 Zerumbone có cấu trúc đặc trưng của hợp chất ketone vòng α,β - không no bao gồm một hệ liên hợp giữa C=C và C=O, có công thức dạng tổng quát như sau: Hệ liên hợp C=C và C=O được thể hiện rất rõ trên các phổ như hồng ngoại, tử ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Trên phổ hồng ngoại (IR) Sự có mặt của một liên kết đôi C=C liền kề nhóm ketone dẫn đến sự không định vị của các electron π ở các liên kết C=C và C=O. Sự liên hợp này làm ảnh hưởng đến các liên kết đơn của cả liên kết C=O và C=C và làm giảm các hằng số lực của chúng, điều này dẫn đến tần số hấp thụ của nhóm C=O và C=C bị giảm và hiệu ứng này còn thấy ở các hệ liên hợp có các liên kết ba. Nói chung, sự có mặt của hệ liên hợp dẫn đến sự giảm số sóng hấp thụ của nhóm C=O khoảng 25-45 cm-1 so với nhóm C=O không liên hợp, hiện tượng này cũng được quan sát thấy khi nhóm C=O gắn với vòng thơm, trong trường hợp nhóm ketone vòng α,β - không no gắn với các vòng thơm thì tần số hấp thụ cực đại còn giảm hơn nữa nhưng cũng 3
không quá 15cm-1 [39], [43]. Cụ thể, phổ hồng ngoại của ketone vòng α,β - không no được đặc trưng bởi 3 dải hấp thụ sau: Dải hấp thụ nằm trong vùng 960 - 965 cm-1 đặc trưng cho dao động biến dạng không phẳng của liên kết C-H trong nhóm vinyl, ngoài minh chứng cho dao động biến dạng không phẳng của liên kết C-H thì dải này còn cho thấy cấu hình trans của 2 proton của nhóm này (H-α và H-β). Dải hấp thụ trong vùng 1550-1615 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết đôi C=C liên hợp, tuy vậy dải này thường bị xen phủ với dao động hóa trị của nhóm C=O và dao động hóa trị C=C của nhân thơm. Dải hấp thụ trong vùng 1635-1695 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm C=O liên hợp. Đối với phổ tử ngoại (UV) Phổ tử ngoại của hệ liên hợp ketone vòng α,β - không no thường xuất hiện hai cực đại hấp thụ: + λmax1 nằm ở vùng từ 300 nm trở lên với hệ số tắt phân tử ɛ = 102 đặc trưng cho bước chuyển n π* trong đó đôi electron trên orbital của nhóm C=O. +λmax2 nằm ở khoảng 250 nm với hệ số tắt phân tử ɛ = 104 đặc trưng cho bước chuyển π π* (đôi electron π của liên kết trans vinyl). Ngoài ra còn có các cực đại hấp thụ nhỏ hơn đặc trưng của các nhân thơm hoặc dị vòng nối với nhóm này. Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) Phổ cộng hưởng từ proton của nhóm ketone vòng α,β - không no có những đặc trưng rất dễ nhận ra do sự tổ hợp của cả 2 hiệu ứng gồm hiệu ứng cảm ứng và hiệu ứng liên hợp (các electron π không cư trú đồng đều trên hệ liên hợp mà có xu hướng lệch về phía nguyên tử oxi) và hiệu ứng không đẳng hướng thường thấy trong nhóm này. Mặt khác, do cấu hình trans bền nên trong phần lớn các hợp chất 2 proton của nhóm này thường có cấu hình trans thể hiện rất đặc trưng, dễ nhận thấy trên phổ proton nhờ hiệu ứng mái nhà với hằng số tương tác J lớn trong khoảng từ 14-17 Hz. 4
14 -17Hz Hình 1.1: Dạng phổ proton mái nhà của các hợp chất ketone vòng α,β-không no Phổ proton của các hợp chất ketone vòng α,β-không no thường xuất hiện một số trường hợp sau [43]: - Các proton H-β trong nhóm ketone vòng α,β-không no không bị che phủ bởi sự cộng hưởng thường dẫn tới độ chuyển dịch hóa học của H-β lớn hơn H-α. - Trong rất nhiều trường hợp vinyl thế, nguyên tử oxy không che phủ các proton H-α bởi hiệu ứng cảm ứng nhưng lại che phủ H-β bởi sự cộng hưởng dẫn đến độ chuyển dịch hóa học của H-α lớn hơn H-β trường hợp này chính là hiệu ứng không đẳng hướng do nhóm C=O tạo ra. Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (13C-NMR) Không giống như phổ proton, do hiệu ứng cảm ứng và hiệu ứng liên hợp trong nhóm ketone vòng α,β-không no nên C-β thường có độ chuyển dịch lớn hơn C-α và tín hiệu cộng hưởng của các nguyên tử cacbon này thường xuất hiện trong vùng có 100 ppm
Nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Văn Ngọc Hướng và cộng sự đã xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất zerumbone có độ tinh khiết 99,5% với hiệu suất 0,38% từ củ gừng gió tươi vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc. Qui trình được thực hiện như sau: nghiền nhỏ củ gừng gió tươi, rồi cất cuốn hơi nước trong thiết bị đặc biệt có hiệu ứng muối (NaCl) có bẫy tinh dầu bằng dung môi, sau đó chiết dịch cất với dung môi, loại dung môi thu tinh dầu và để kết tinh phân đoạn tinh dầu thu được zerumbone. Rõ ràng so sánh với các phương pháp khác, phương pháp này là phương pháp đơn giản, có hiệu suất tốt và kinh tế và có khả năng ứng dụng vào thực tế để sản xuất zerumbone [31]. 1.2.2. Phân lập zerumbone bằng phương pháp chiết - Đi từ nguyên liệu củ gừng gió tươi: nghiền củ gừng gió tươi rồi chiết bằng MeOH hay EtOAc, loại dung môi thu cặn chiết, sử dụng sắc ký cột cặn chiết để thu được zerumbone [3]. Hiệu suất toàn bộ quá trình này không vượt quá 0,1% tính theo nguyên liệu tươi. Cũng theo phương pháp này, tác giả Abdul và cộng sự chỉ thu được zerumbone với hiệu suất 0,062% tính theo nguyên liệu tươi [4]. - Đi từ nguyên liệu củ Gừng gió khô Vì nước trong củ gừng gió tươi ngăn cản việc chiết tinh dầu bằng dung môi không phân cực. Vì vậy người ta thái mỏng củ gừng gió, phơi khô, nghiền nhỏ và chiết bằng dung môi sau đó loại bỏ dung môi thu cặn chiết và dùng sắc ký cột để thu được zerumbone. Theo cách này Uraiwan Songsiang và cộng sự thu được zerumbone với hiệu suất 0,37% tính theo nguyên liệu khô, nếu tính theo nguyên liệu tươi là 0,03% [4]. 1.3. Hoạt tính sinh học của zerumbone 1.3.1. Hoạt tính chống ung thư Khoảng 20 năm trở lại đây, các hoạt tính sinh học của zerumbone bao gồm: hoạt tính kháng viêm, chống oxi hóa và chống ung thư được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Tuy nhiên, hoạt tính chống ung thư được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất, rất nhiều báo cáo được đăng tải chỉ ra rằng zerumbone có khả năng kháng nhiều dòng tế bào ung thư. Các kết quả nghiên cứu cả in vitro và in 6
vivo đều khẳng định zerumbone là chất chống ung thư mạnh, sesquiterpen này ức chế có hiệu quả sự phát triển nhiều dòng tế bào ung thư người như ung thư gan, ung thư cổ tử cung, ung thư vú, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư máu, ung thư da, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tụy [6]. Trong phân tử zerumbone, nhóm ketone vòng α,β-không no đóng vai trò rất quan trọng về hoạt tính chống ung thư và đã được khẳng định là trung tâm hoạt tính của hợp chất này [36], [38], [3], [12],nhóm này chính là một trung tâm tiếp nhận các tác nhân của phản ứng Michael chẳng hạn như nhóm -SH trong một số protein nhất định [56]. Năm 2009, Giang và các cộng sự [12] đã nghiên cứu hoạt tính ức chế yếu tố NF-κB của zerumbone và chỉ ra rằng nhóm ketone vòng α,β-không no chính là chìa khóa cho hoạt tính của hợp chất này. Kết luận này cũng được đưa ra khi so sánh khả năng ức chế virus EBV trong tế bào Raji (virus này là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh ung thư) của zerumbone và các hợp chất có cùng bộ khung là zerumbol và humulene cho thấy rằng khả năng ức chế của zerumbol yếu hơn rất nhiều so với zerumbone còn humulene hầu như không thể hiện hoạt tính [37]. Sử dụng mô hình đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư ruột kết dùng ACFs (aberrant crypt foci) như là chất đánh dấu trong thực nghiệm so sánh hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư HT-29, CaCo-2, MCF-7 Kirana và các cộng sự [19], nhận thấy zerumbone thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với các dòng tế bào ung thư này với giá trị IC50 khoảng 10 µM trong khi đó giá trị IC50 của curcumin vào khoảng 25 µM [19]. Đối với dòng tế bào ung thư tử cung 7
người Hela, Abdul A.B.H và cộng sự [3], nhận thấy zerumbone có khả năng gây độc dòng tế bào này với IC50 = 2,5 µM trong khi IC50 của cis-platin là 1,6 µM. Tuy nhiên, zerumbone gây độc chọn lọc tế bào ung thư, chống sự phát triển đột biến, còn cis-platin không có tính chất chọn lọc, gây độc với cả tế bào ung thư (cancerous cells) lẫn tế bào thường (non- cancerous cells). Điều này là do nhóm ketone vòng α,β-không no trong zerumbone loại bỏ hiệu quả glutathione (GSH) nội bào thông qua sự hình thành sản phẩm cộng Michael, nhờ đó cải thiện thế oxi hóa-khử nội bào (E), mà trong cơ thể, thế oxi hóa-khử nội bào trung bình của tế bào bình thường khác với tế bào ung thư. Kết quả là zerumbone ức chế sự phát triển của tế bào ung thư mà không ức chế tăng trưởng của tế bào bình thường. Các số liệu của họ cũng khẳng định cis-platin gây độc tế bào ung thư gan Hep-G2 (IC50 = 7,08 µM) yếu hơn so với độ độc của zerumbone đối với Hep-G2 (IC50 = 3,15 µM). Điều này cho thấy zerumbone cũng rất có triển vọng trong việc nghiên cứu thuốc điều trị ung thư gan [47]. 1.3.2. Cơ chế chống ung thư Các nghiên cứu sâu về cơ chế chống ung thư của zerumbone cho thấy zerumbone chống ung thư theo các cơ chế khác nhau như kìm hãm hay loại trừ yếu tố NF-κB hoạt động là tác nhân dẫn đến ung thư [51]; cơ chế oxi hóa khử [15]; cơ chế thúc đẩy quá trình chết theo lập trình (apoptosis) các tế bào ung thư [2]. 1.3.2.1. Cơ chế sinh học phân tử Cơ sở khoa học của cơ chế này đã được nhà khoa học Mỹ Takada nêu ra năm 2005. Cơ chế này dựa vào yếu tố nhân (NF-κB) (Nuclear factor kappa B) trong quá trình phát triển sinh học. Cho đến nay, người ta đã khẳng định mọi tế bào đều có NF-κB và I-κB (inhibit-kappa B). Ở trạng thái bình thường NF-κB và I-κB liên kết không đồng hóa trị với nhau. Nhưng vì một lý do nào đó như tác động độc hại của tia phóng xạ, của hóa chất, suy thoái môi trường hay sự xâm nhập của các vi khuẩn, ..., làm cho I-κB bị mất tác dụng điều khiển sự sinh sản tế bào theo lập trình của NF-κB, nên NF-κB được giải phóng và trở nên hoạt động bất thường. 8
Chính sự hoạt động bất thường của NF-κB là nguyên nhân gây ra rất nhiều bệnh tật cho con người, đặc biệt là bệnh ung thư, viêm nhiễm, thần kinh, Alzheimer. Theo Takada và cộng sự, zerumbone đóng vai trò như một I-κB, nó liên kết với NF- κB hoạt động nhờ nhóm chức sinh học của mình, gây ức chế sự hoạt động bất thường của NF-κB nên ngăn chặn được các bệnh tật do NF-κB hoạt hóa gây ra như bệnh ung thư, các bệnh viêm nhiễm [51]. 1.3.2.2. Cơ chế oxi hóa khử Cơ chế này được Hoffman A. và cộng sự đưa ra năm 2002. Trong chu trình phát triển của tế bào luôn tồn tại cặp Glutathione (GSH) và Glutathyl sunphua (GS- SG). Cặp oxi hóa khử này có điện thế oxi hóa khử E = log(GS-SG)/(GSH)2. Tốc độ phát triển tế bào khác nhau thì nồng độ các tác nhân của cặp điện thế này thay đổi, do đó điện thế E thay đổi. Trong quá trình điều trị ung thư bằng zerumbone, do có sự cộng hợp ái nhân của GSH vào nhóm ketone vòng α,β-không no của zerumbone tạo ra sản phẩm cộng hợp Michael làm cho nồng độ GSH thay đổi và dẫn đến thay đổi điện thế E. Như thế theo dõi điện thế E của tế bào ung thư (khối u) trong quá trình điều trị bằng zerumbone không những cho biết tác dụng của zerumbone đến sự phát triển của tế bào ung thư mà còn cho phép xác định được liều điều trị (dose treatment) của zerumbone cho đến lúc điện thế E của tế bào ung thư (khối u) bằng điện thế E của tế bào bình thường [15]. 1.3.2.3. Cơ chế thúc đẩy quá trình chết theo lập trình (apoptosis mechanism) Trong công bố đưa ra năm 2009 về nghiên cứu điều trị tế bào ung thư Hela bằng zerumbone, Abdul A.B.H. đã khẳng định cơ chế này. Apoptosis là cách để tế bào tách ra khỏi mô già như là một phần trong cơ chế duy trì quá trình phát triển bình thường của cơ thể. Apoptosis cũng là cách hối thúc các tế bào già tự nguyện chết, không phải bắt buộc chết (cái chết này cũng là chết sinh lý chủ động, nó khác với chết bệnh lý thụ động (neucrosis)). Nó được gọi là cái chết “sạch sẽ” của sinh học bởi tất cả các xác chết đều được chủ động dọn dẹp nhờ thực bào phân giải nên không có bất kỳ dấu tích nào để lại. Nếu quá trình Apoptosis bị tổn thương hay bị khóa không thực hiện được thì các tế bào già, tế bào hư hỏng không bị chết mà vẫn 9