Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố bền nhiệt STb của E. coli trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện

Chia sẻ: Xedapbietbay Xedapbietbay | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:66

Thêm vào BST

Báo xấu

55
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu phân lập gene estB , tạo dòng, biểu hiện và khảo sát điều kiện thích hợp để sản xuất số lượng lớn kháng nguyên tái tổ hợp STb, làm cơ sở cho việc sản xuất và ứng dụng trong việc phòng trị bệnh do E. coli gây ra ở lợn con bị bệnh tiêu chảy.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố bền nhiệt STb của E. coli trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Thành Phố Huế, tháng 6 năm 2016 Tác giả luận văn Lê Minh Tuấn PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại Học Nông Lâm Huế, Phòng đào tạo sau đại học, Khoa Chăn nuôi thú y cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức khoa học kỹ thuật cho lớp cao học khóa 20A chuyên ngành thú y tại trường Đại học Nông Lâm Huế. Tôi xin chân thành cảm ơn đặc biệt đến PGS. TS. Đinh Thị Bích Lân đã tận tình hướng dẫn để tôi hoàn thành đề tài. Tôi xin cảm ơn Chi cục Chăn nuôi và Thú y Thừa Thiên Huế, các cán bộ Phòng thí nghiệm Miễn dịch học và vắc xin - Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế, Trạm Chẩn đoán xét nghiệm và điều trị bệnh động vật đã giúp đỡ tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Đề tài này hoàn thành được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ do PGS. TS Đinh Thị Bích Lân làm chủ nhiệm (Mã số: B2016- DHH-25) Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp gần xa đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực tập. Thành phố Huế, tháng 6 năm 2016 Lê Minh Tuấn PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iii TÓM TẮT E. Coli một trong những nhóm vi khuẩn chính gây ra bệnh tiêu chảy ở lợn con. Chúng có khả năng sản sinh ra hai loại độc tố đường ruột : độc tố không bền nhiệt (LT) và độc tố bền nhiệt (ST). Độc tố ST có hai loại là STa và STb. Tuy nhiên cơ chế gây tiêu chảy của STb chưa được rõ. Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene độc tố trong đó có độc tố STb của E. coli gây ra bệnh tiêu chảy ở lợn con để làm nguyên liệu chế tạo vắc xin, kháng thể, chế phẩm sinh học dùng trong phòng, trị bệnh tiêu chảy ở lợn con là hết sức có ý nghĩa và mang tính cấp thiết, giảm thiệt hại kinh tế trong ngành chăn nuôi lợn nói chung và gia súc nói riêng. Trong nghiên cứu này, gene estB mã hoá cho kháng nguyên STb được phân lập bằng phản ứng PCR, tạo dòng và biểu hiện thành công gene estB vào hai vector pGEM-T easy và pET200/D-TOPO và biến nạp vào trong hai tế bào vật chủ E. coli TOP10 và E. coli BL21 (DE3). Trên đĩa petri, khuẩn lạc xanh trắng xuất hiện riêng rẽ như vậy việc lựa chọn các khuẩn lạc trắng để tách plasmid có thể loại bỏ được phần lớn các trường hợp không mong muốn mặc dù không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều có thể mang vector plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gene estB. Để khẳng định một cách chắc chắn hơn, chúng tôi cần chọn lọc các khuẩn lạc dương tính (khuẩn lạc màu trắng) để kiểm tra sự hiện diện của gene estB bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu và cặp mồi M13 Sản phẩm gắn được ủ ở 4°C qua đêm. Sản phẩm này sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42°C trong 60 giây. Sau khi biến nạp, nhờ sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp của tế bào vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp được tạo ra với số lượng lớn các bản sao. Dịch tế bào được được nuôi cấy bằng cách dàn đều trên môi trường LB (1% tryptone; 0,5% dịch chiết nấm men; và 1% NaCl; 1,5% agar, pH 7,0) có thạch, có bổ sung kháng sinh 100 µg/mL ampicillin, 100 mM IPTG và 20 mg/mL X-Gal. Trong môi trường chọn lọc này, các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi các khuẩn lạc mang vector pGEM®-T Easy không mang gene estB sẽ có màu xanh. Tế bào E. coli BL21 tái tổ hợp sinh trưởng tốt trên môi trường TB với tỷ lệ tiếp giống 2% (giống đã được hoạt hóa sau 8 giờ nuôi), lắc 220 vòng/phút. Gene estB biểu hiện tốt trong tế bào E. coli BL21 trên môi trường YJ, IPTG (0,8 mM), thời gian 10 giờ, ở thời điểm cảm ứng OD600 = 0,6, nhiệt độ 30-37°C. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii TÓM TẮT...................................................................................................................... iii MỤC LỤC ......................................................................................................................iv DANH MỤC VIẾT TẮT................................................................................................vi DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ ................................................................................ viii MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1. TÍNH CẤP THIẾT ......................................................................................................1 2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI ..........................................................................................2 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỂN .................................................................3 3.1. Ý nghĩa khoa học ......................................................................................................3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .....................................................................................................3 Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .....................................................................4 1.1. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli gây ra ở lợn ............................................4 1.1.1. Nghiên cứu trong nước ..........................................................................................4 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ......................................................................7 1. 2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN E. COLI ....................9 1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn E. coli .............................................................................10 1.2.2.Phân loại ...............................................................................................................10 1.2.3. Đặc điểm về hình thái của vi khuẩn E. coli .........................................................11 1.2.4. Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn E. coli ................................................................11 1.2.5. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli ................................................................12 1.2.6. Sức đề kháng của vi khuẩn E. coli ......................................................................13 1.2.7.Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli ........................................................13 1.2.8. Khả năng sản sinh độc tố đường ruột ..................................................................17 Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............20 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
v 2.1. MỤC TIÊU CỤ THỂ..............................................................................................20 2.2. PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................20 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu............................................................................................20 2.2.2. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................20 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................20 2.3.1. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................20 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................21 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...........................................34 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP E. COLI TỪ PHÂN LỢN .................................................34 3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GENE estB .......................................................................34 3.3. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GENE .............................................................................36 3.4. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN ........................................................................39 3.5. NUÔI CẤY VI KHUẨN ........................................................................................41 3.6. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN SINH TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO E. COLI TÁI TỔ HỢP .......................................................................................................41 3.6.1. Thành phần môi trường .......................................................................................41 3.6.2. Tỷ lệ tiếp giống ....................................................................................................42 3.6.3. Tốc độ lắc ............................................................................................................43 3.7. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN BIỂU HIỆN CỦA TẾ BÀO E. COLI TÁI TỔ HỢP .......................................................................................................44 3.7.1. Thời gian cảm ứng ...............................................................................................44 3.7.2. Nồng độ chất cảm ứng .........................................................................................45 3.7.3. Thành phần môi trường biểu hiện .......................................................................46 3.7.4. Mật độ tế bào trước khi bổ sung chất cảm ưng ...................................................47 3.7.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng .......................................................................48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................49 1. KẾT LUẬN ...............................................................................................................49 2. KIẾN NGHỊ ...............................................................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................50 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vi DANH MỤC VIẾT TẮT Amp Ampicillin ADN Acid deoxyribonucleic YJ Yang Jijian LB Luria Bertani SOB Super Optimal Broth SOC Super Optimal Broth with catabolic repressor TB Terrific broth SDS Sodium Dodecyl PC Positive Control (đối chứng dương tính) NC Negative Control (đối chứng âm tính)Sulfate PCR Polymerase Chain Rection OD Optical Density IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside v/v volume per volume (thể tích/thể tích) kDa Kilodalton E. coli Escherichia coli DNA Deoxyribo Nucleic Acid RNA Ribonucleic Acid bp base pair cDNA complement Deoxyribo Nucleic Acid E. coli Escherichia coli kDa kilodalton PCR Polymerase Chain Reaction SDS - PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis EPEC enteropathogenic E. coli ETEC enterotoxigenic E. coli EIEC enteroinvasive E. coli EHEC enterohaemorrhagic E. coli EAEC enteroaggregative E. coli PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các chủng E. coli gây bệnh trên lợn (Fairbrother, 1994) ...............................8 Bảng 2.1. Thành phần các hóa chất cho quá trình chuẩn bị gel polyacrylamide 15% ..32 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
viii DANH MỤC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Hình 2.1. Quy trình phân lập vi khuẩn E.coli................................................................23 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm về khả năng sinh trưởng của E. coli tái tổ hợp .................29 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu sự biểu hiện gene kháng nguyên độc tố tái tổ hợp STb.30 Hình 3.1. Ảnh phân lập E. coli trên môi trường MacConkey .......................................34 Hình 3.2. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene estB trên gel agarose 2%.. .............................................................................................................35 Hình 3.3. Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc. ..................................................36 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm plasmid từ các dòng dương tính và kết quả PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene estB từ khuôn mẫu DNA plasmid tái tổ hợp thu được trên gel agarose 2%.. ....................................................................................................................37 Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên gel agarose 2%.. ..38 Hình 3.8. Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc ...................................................40 Hình 3.9. Ảnh điện di thăm dò khả năng biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp STb và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ trên gel SDS – PAGE 15%.. ...40 Hình 3.10. Đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene estB mã hóa tạo kháng nguyên STb ............................................................................................41 Hình 3.11. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp ...................................................................................................42 Hình 2.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống lên sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp .............................................................................................................43 Hình 3.13. Ảnh hưởng của các tốc độ lắc lên sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp .............................................................................................................43 Hình 3.14. Ảnh điện di thăm dò thời gian cảm ứng biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp STb trên gel 15%.. ..................................................................................................................44 Hình 3.16. Ảnh điện di thăm dò thành phần các môi trường tối ưu trong biểu hiện gene kháng nguyên tái tổ hợp STb trên gel 15%.. .................................................................46 Hình 3.17. Ảnh điện di thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu trong biểu hiện gene kháng nguyên tái tổ hợp STb trên gel 15%...........................................................47 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1 MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT Chăn nuôi gia súc, gia cầm từ lâu đã đóng góp một vị trí vô cùng quan trọng đối với đời sống của loài người nói chung và đời sống của người Việt Nam nói riêng. Ổ Việt Nam chăn nuôi gia súc, gia cầm chính là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu phục vụ nhu cầu của người dân, hàng năm cung cấp khoảng 30% giá trị sản suất ngành nông nghiệp. Tuy nhiên, chăn nuôi lợn theo hướng công nghiệp còn nhiều vấn đề nan giải mà nổi lên là tình hình dịch bệnh và sử dụng thuốc trong điều trị bệnh tại các cơ sở chăn nuôi. Trong đó, bệnh tiêu chảy do E.coli gây ra là phổ biến và gây thiệt hại kinh tế đáng kể. Tiêu chảy ở lợn con do nhiều nguyên nhân, nhưng nguyên nhân chính là do các vi khuẩn đường ruột E. coli gây ra. Dựa vào khả năng gây tiêu chảy, vi khuẩn E.coli được chia thành 5 loại gồm: E. coli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic E. coli-EPEC), E.coli sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E. coli-ETEC), E. coli xâm nhập ruột (enteroinvasive E.coli- EIEC), E.coli gây xuất huyết ruột (enterohaemorrhagic E.coli-EHEC) và E.coli bám dính đường ruột (enteroaggregative E. coli-EAEC) (Kim và cs, 2007). Độc tố đường ruột là một trong những yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con. Độc tố đường ruột làm thay đổi nước, chất điện giải ở ruột non và dẫn tới tiêu chảy. Có 2 loại độc tố đường ruột của vi khuẩn thuộc nhóm ETEC được xác định là độc tố không chịu nhiệt (LT) và độc tố chịu nhiệt (ST). Bên cạnh đấy, vi khuẩn thuộc nhóm EAEC sản sinh độc tố chịu nhiệt EAST1 (Enteroaggregative heat-stable enterotoxin 1) cũng được xem là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở gia súc (Phùng khắc Cam và cs, 2003). Độc tố chịu nhiệt (độc tố ST) là những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ, được sản sinh bởi các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC. Độc tố này có thể chịu được nhiệt độ 1000C trong 15 phút. Độc tố ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động (Sack, 1975; Sherman và cs, 1983). Độc tố STb cũng là chuỗi polypeptide được sản sinh chủ yếu bởi các chủng vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn (Nataro và cs, 1998). Độc tố STb gồm có 48 axít amin, trong đó có 4 axít amin Cystein tạo thành 2 cầu nối disulfide giữa Cys10 – Cys48 và Cys21 – Cys36. Các cầu nối này có vai trò giúp cho STb bền vững trong chu chất (Fujii và cs, 1991). Gene mã hóa cho độc tố ST lần lượt là estA và estB. Gene estA được tìm thấy chủ yếu trên plasmid cùng mang nhiều gene mã hóa các yếu tố độc lực khác của các chủng PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2 ETEC như yếu tố xâm nhiễm, kháng kháng sinh, sản sinh colicin (Nataro và cs, 1998). Tương tự, gene estB được tìm thấy trên plasmid cùng mang nhiều yếu tố độc lực khác như độc tố LT, STa, kháng kháng sinh, yếu tố xâm nhiễm (Harnett và cs, 1985). Độc tố ST được tổng hợp trong tế bào chất như là tiền polypeptide. Đoạn tiền peptide mang tín hiệu vận chuyển sẽ bị phân cắt khi chuỗi polypeptide vận chuyển từ tế bào chất đến periplasm thông qua hệ thống vận chuyển SecA. Trong periplasm, các cầu nối disulfide của độc tố sẽ được hình thành trước khi độc tố được giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn qua hệ thống TolC dưới tác động của protein DsbA (periplasmic oxidoreductase protein) (Dubreuil và cs, 1997 và 2006a). Áp dụng công nghệ DNA và công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp sẽ tạo được sản phẩm có khả năng chống lại đồng thời nhiều chủng E.coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa. Đây là lợi thế của phương pháp tiếp cận mới có áp dụng công nghệ cao so với các phương pháp tách chiết kháng nguyên truyền thống. Nước ta là quốc gia có nền kinh tế dựa chủ yếu trên lĩnh vực nông nghiệp, trong đó chăn nuôi là một bộ phận quan trọng. Chăn nuôi lợn theo quy mô công nghiệp đã bắt đầu phát triển và mang lại hiệu quả kinh tế lớn. Tuy nhiên, cũng giống như các quốc gia khác trên thế giới, tình hình dịch bệnh tiêu chảy thường xảy ra trên các đàn lợn con, gây tổn thất không nhỏ cho người chăn nuôi. Vì vậy, các vấn đề liên quan đến căn bệnh này cũng như các chủng E. coli gây bệnh, các yếu tố kháng nguyên gây độc tố cũng đã được nghiên cứu như: Tìm hiểu vai trò E. coli trong bệnh phân trắng của lợn con và vắc xin dự phòng, xác định các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR, nghiên cứu phân lập và xác định độc tố đường ruột của các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy cho lợn con, nghiên cứu về khả năng gây bệnh của các chủng E. coli trong lợn con một ngày tuổi thiếu sữa ở năm tỉnh miền Bắc của Việt Nam. Xuất phát từ những yếu tố trên, cùng với nhu cầu ngày càng lớn của ngành chăn nuôi, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài " Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố bền nhiệt STb của E. coli trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện". 2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu phân lập gene estB , tạo dòng, biểu hiện và khảo sát điều kiện thích hợp để sản xuất số lượng lớn kháng nguyên tái tổ hợp STb, làm cơ sở cho việc sản xuất và ứng dụng trong việc phòng trị bệnh do E. coli gây ra ở lợn con bị bệnh tiêu chảy. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỂN 3.1. Ý nghĩa khoa học Trong những năm gần đây, kháng nguyên tái tổ hợp đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng ở một số nước trên thế giới, nhưng ở Việt Nam hầu như có rất ít nghiên cứu được thực hiện. Kết quả nghiên cứu sẽ giúp chúng ta có thể chủ động sản xuất một lượng lớn protein kháng nguyên tái tổ hợp STb theo mong muốn tạo nguồn nguyên liệu cho nhiều hướng ứng dụng. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Nội dung nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta tiếp cận và ứng dụng được các kỹ thuật hiện đại của Công nghệ sinh học nhằm rút ngắn thời gian nghiên cứu và hiệu quả kinh tế. - Các kết quả này sẽ là cơ sở cho phép nghiên cứu tạo các vacxin hoặc sản xuất kit chẩn đoán để phục vụ trong công tác phòng trị bệnh tiêu chảy do E.coli gây ra ở lợn. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
4 Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli gây ra ở lợn 1.1.1. Nghiên cứu trong nước Ở nước ta, bệnh do E. coli gây ra đã xuất hiện từ lâu và cho đến nay bệnh ngày càng trở nên phổ biến, rộng khắp ở hầu hết các cơ sở chăn nuôi. Tìm hiểu về bệnh do E. coli gây ra đã có nhiều nhà khoa học thú y quan tâm nghiên cứu. Theo Hoàng Văn Tuấn, Lê Văn Tạo và Trần Thị Hạnh (1998) điều tra tình hình bệnh tiêu chảy ở lợn con trong một trại lợn giống hướng nạc trong ba năm 1995, 1996, 1997, kết quả cho thấy tỷ lệ hao hụt do dịch bệnh ở lợn con theo mẹ (dưới 45 ngày tuổi) qua các năm là 25%, 12% và 15%. Trong đó tỷ lệ chết do tiêu chảy chiếm 67% và 80% trong số lợn con chết (Hoàng Văn Tuấn và cs, 1998). Trong khi, Đào Trọng Đạt và cs, (1996) cho biết bệnh phân trắng thường gặp ở lợn con mới sinh, giai đoạn từ 1 - 20 ngày tuổi với tỷ lệ mắc bệnh cao nhất có thể lên tới 100%. Đối với các hộ nông dân chăn nuôi lợn nái có tỷ lệ mắc bệnh khá cao 31,3 - 66% . Ngoài ra, nhóm tác giả này cho biết thêm “khoảng 48% các trường hợp bị bệnh tiêu chảy ở lợn con là do vi khuẩn E. coli gây ra. Vì vậy bệnh do vi khuẩn E. coli gây ra có vị trí đặc biệt trong các bệnh nhiễm khuẩn ở lợn con” (Đào Trọng Đạt và cs, (1996). Trong khi đó, theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Kình và cộng sự (1996) cho biết tỷ lệ mắc bệnh phân trắng ở lợn con cao khoảng 60 - 70% có khi lên tới 100% nhưng tỷ lệ chết không cao khoảng 15 - 18% (Nguyễn Văn Kình và cs,1996). Khả năng điều trị bệnh phân trắng lợn con rất khó nên việc phòng bệnh là rất quan trọng. Nguyễn Thị Nội (1984) đã dựa trên kết quả xác định tần suất của các serotype có tần suất cao dùng để chế tạo vacxin E. coli vô hoạt có chất bổ trợ keo phèn trên hai lần, cho lợn mẹ có chửa để phòng bệnh phân trắng lợn con. Kết quả đã làm giảm tỷ lệ lợn con mắc bệnh từ 73% xuống còn 27,3% (Nguyễn Thị Nội, 1984). Đến năm 1993, Nguyễn Thị Nội và cộng sự đã dựa vào kết quả phân lập các vi khuẩn đã chế tạo ra một loại vacxin có tên “Salsco” gồm E. coli, Salmonella, Streptococcus để phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con. Vacxin Salsco tiêm cho lợn con từ 21 ngày tuổi liều 3 – 5 mL/con, 2 lần cách nhau 10 ngày (Nguyễn Thị Nội và cs, 1993). Kết quả vacxin này làm giảm tỷ lệ lợn con bị tiêu chảy từ 30-50% và giảm tỷ lệ chết của lợn con do tiêu chảy từ 10 - 20%. Liên quan đến vacxin, nhóm tác giả Lê Văn Tạo và cộng sự (1993) dựa trên cơ sở xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli phân lập từ bệnh phẩm lợn con chết do ỉa chảy phân trắng đã chọn các giống vi khuẩn điển hình để chế vacxin chết ở dạng Bacterin cho uống. Vacxin sau khi đẻ 2 giờ uống liều 1 mL, liên PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
5 tục 3 - 5 ngày làm giảm tỷ lệ lợn con bị phân trắng từ 30 - 35% so với lô đối chứng (Lê Văn Tạo và cs, 1993). Từ trước đến nay, hiện tượng kháng thuốc xẩy ra ngày càng phổ biến, gây nhiều khó khăn cho ngành chăn nuôi. Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đã có nhiều nghiên cứu được công bố. Theo Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu (1995) nghiên cứu theo dõi tính kháng thuốc của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con phân trắng đã có kết luận rằng: Số chủng E. coli kháng thuốc từ năm 1978 - 1988 tăng khá nhanh, nhất là với các loại kháng sinh chloramphenicol, tetracylin. Các tác giả cũng đã khuyến cáo nếu sử dụng thuốc kháng sinh như một chất kích thích tăng trọng cần phải được kiểm tra nghiêm ngặt sử dụng trong chăn nuôi vì nó đã góp phần không nhỏ vào sự hình thành kháng thuốc và truyền kháng của vi khuẩn E. coli (Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu, 1995). Một giải pháp thây thế cho việc dùng thuốc trong chăn nuôi đã được tiến hành và có nhiều thử nghiệm. Theo Vũ Đình Hưng và cộng sự (1996) đã sử dụng globulin chiết tách từ máu gia súc để phòng bệnh phân trắng lợn con. Kết quả thu được: phòng bệnh sinh sản hay tiêm cho lợn mẹ trước khi đẻ 10 - 15 ngày thì tỷ lệ bảo hộ là 67,6% và 81,20%, khả năng chữa trị khỏi bệnh là 83,88% (Vũ Đình Hưng và cs, 1996). Tạ Thị Vịnh và cộng sự, (2002) đã nghiên cứu sử dụng mật lợn để phòng bệnh phân trắng lợn con và kết hợp với kháng sinh để điều trị bệnh. Kết quả cho thấy, lợn thí nghiệm có tăng trọng cao hơn so với lợn đối chứng. Lợn mắc bệnh phân trắng ở lô thí nghiệm hoàn toàn phòng được bệnh trong các hộ gia đình, lợn ở lô đối chứng qua 2 đàn trên đều mắc bệnh, tỷ lệ từ 33,33% - 66,67% (Tạ Thị Vịnh và cs, 2002). Trần Thị Hạnh và Đặng Xuân Bình (2002) đã nghiên cứu, thử nghiệm một số chế phẩm sinh học phòng bệnh tiêu chảy phân trắng lợn con do vi khuẩn E. coli và Cl. perfringens. Các tác giả đã chế tạo ba chế phẩm sinh học gồm E. coli-Sữa, Cl. perfringens dùng cho nái chửa và Bacterin EBC (E. coli, Bacterin và Cl. perfringens toxoid) dùng cho lợn con để phòng bệnh và xây dựng quy trình gây bệnh cho lợn con ngay từ những ngày đầu (Trần Thị Hạnh và Đặng Xuân Bình, 2002). Đỗ Trọng Cứ và Nguyễn Quang Tuyên (2002) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm EM (Effective Microorganism) phòng bệnh tiêu chảy lợn con trước và sau khi cai sữa. Kết quả cho thấy tỷ lệ tiêu chảy giảm 20%, tỷ lệ tái phát bệnh giảm so với đối chứng 50%, khả năng tăng trọng cao hơn, các chỉ tiêu sinh lý: máu, hồng cầu, bạch cầu và huyết sắc tố bình thường. Qua kiểm tra tổng số vi khuẩn Salmonella trong 1 g phân giảm đi rõ rệt từ 20,92 triệu vi khuẩn (1 g phân trước khi thí nghiệm) còn 16,99 triệu vi khuẩn (1 g phân sau khi kết thúc thí nghiệm) (Đỗ Trọng Cứ và Nguyễn Quang Tuyên, 2002). Tạ Thị Vịnh và Đặng Thị Hoè (2002) sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng bệnh tiêu chảy của lợn con. Kết quả thu được như sau (Tạ Thị Vịnh và Đặng Thị Hoè, 2002): PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
6 - Dùng chế phẩm VITOM1.1 có tác dụng rất cao đối với giống lợn ngoại, tỷ lệ khỏi bệnh 100% so với lô đối chứng là 80,7%; còn tỷ lệ tái phát khi sử dụng VITOM1.1 chỉ 25% trong khi lô đối chứng là 52,38%. - Sử dụng cao mật lợn để phòng và trị bệnh đường tiêu hoá cho lợn con. Kết quả cho thấy lô thí nghiệm so với lô đối chứng: tỷ lệ mắc bệnh giảm 5%, lô thí nghiệm không có tái phát 100% trong khi lô đối chứng tái phát 25% và chết 25%. Nó còn kích thích tăng trọng tốt. Sau 3 tuần tuổi các lô thí nghiệm so với lô đối chứng là 0,27 kg tức 13,77%. Tạ Thị Vịnh và Đặng Khánh Vân (1995) cho rằng E. coli thường trực cả ở cơ thể lợn khoẻ, từ lợn con đến lợn nái. Ở lợn khoẻ có nhiễm vi khuẩn E. coli K88 nhưng số lượng và độc lực chưa đầy đủ để gây bệnh. Ở lợn mắc chứng tiêu chảy số lượng và tỷ lệ vi khuẩn E. coli K88 tăng gấp bội, điều đó chứng tỏ môi trường trong ruột đã bị thay đổi thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn E. coli nhất là E. coli độc (Tạ Thị Vịnh và Đặng Khánh Vân, 1995). Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu (1996) đã tiến hành nghiên cứu theo dõi, kiểm tra một số yếu tố ảnh hưởng đến tính mẫn cảm và tính kháng thuốc của vi khuẩn E. coli phân lập từ bệnh lợn con phân trắng đã cho rằng việc sử dụng thuốc trong phòng, trị bệnh khác nhau đã dẫn đến tính mẫn cảm và tính kháng thuốc của vi khuẩn này là khác nhau. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli kháng thuốc cao thì tỷ lệ vi khuẩn E. coli đa kháng cũng cao. Tính kháng thuốc của vi khuẩn E. coli liên quan đến tuổi lợn bị bệnh (lợn dưới 4 ngày tuổi mắc bệnh có tỷ lệ vi khuẩn E. coli kháng thuốc thấp hơn ở các lứa tuổi trên 4 ngày tuổi), các chủng E. coli có khuẩn lạc dạng R có tính kháng thuốc cao hơn dạng S (Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu, 1996). Cù Hữu Phú và cộng sự, (2000) đã phân lập vi khuẩn E. coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy xác định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được và đề ra biện pháp điều trị. Tác giả đã phân lập được 60 chủng E. coli trong đó có 42 chủng gây dung huyết trên thạch máu chiếm tỷ lệ 70%, có 6 chủng E. coli sản sinh ra cả 2 loại độc tố là chịu nhiệt ST và không chịu nhiệt LT, các chủng E. coli mẫn cảm cao nhất với các loại kháng sinh: nitrofurazolidon (85%), neomycine (80), sulfonamid (75%). Dùng 4 chủng E. coli dung huyết và 3 chủng Salmonella có độc lực mạnh trên chuột sản sinh độc tố để sản xuất autovacxin phòng bệnh tiêu chảy, liều tiêm 3 – 5 mL/con đạt tỷ lệ phòng bệnh 89,22% (Cù Hữu Phú và cs, 2000). Lý Thị Liên Khai (2001) đã phân lập và xác định độc tố ruột của các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy cho lợn con, tác giả cho rằng các chủng K88 sinh độc tố ruột LT và ST; K99 và 987P sinh độc tố ruột ST và độc tố ST trở nên độc khi sức đề kháng của vật chủ giảm, gây tiêu chảy cho lợn con đang bú mẹ, phổ biến ở lợn 1 - 2 tuần tuổi (Lý Thị Liên Khai, 2001). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
7 Nghiên cứu của Đoàn Thị Kim Dung và Lê Thị Tài (1997) điều trị hội chứng tiêu chảy lợn con theo mẹ, sử dụng becberin liều 0,5 - 0,8/ngày cho uống đạt hiệu quả 68%. Sử dụng Oresol cho uống hoặc tiêm dưới da hạn chế được tiêu chảy hiệu quả đạt trung bình 60%. Phối hợp điều trị becberin và Oresol thêm chất trợ lực B complex hiệu quả đạt 90% (Đoàn Thị Kim Dung và Lê Thị Tài, 1997). Để góp phần vào việc giải quyết những thiệt hại của bệnh tiêu chảy cho lợn con, đã có nhiều tác giả nghiên cứu và thu được nhiều thành công ở những khía cạnh khác nhau. Mặc dù vậy, cho đến nay bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ vẫn là bệnh gây thiệt hại lớn đến các trại chăn nuôi lợn tập trung do tính chất phức tạp của mầm bệnh, hay do nhiều nguyên nhân, yếu tố tác động đến con vật và đặc biệt là tình trạng ô nhiễm môi trường, chuồng trại của các cơ sở chăn nuôi. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Từ lâu trên thế giới đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn E. coli đặc biệt là trong những thập niên 60, 70 và những năm gần đây. Vi khuẩn E. coli có 2 loại độc tố và là thành phần chính của enterotoxin được thấy ở các vi khuẩn E. coli gây bệnh, sự khác biệt giữa chúng là khả năng chịu nhiệt. Độc tố chịu nhiệt ST (heat-stable toxin) chịu được nhiệt độ 1000C trong 15 phút (Smith và Halls, 1967), độc tố không chịu nhiệt LT (heat-labile toxin) bị vô hoạt ở 600C trong 15 phút. Các vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột có khả năng bám dính vào tế bào nhung mao ruột, sự bám dính này do các pili thực hiện. Có 5 ngoại kháng nguyên K là yếu tố bám dính trong cấu trúc pili gồm K88ac, K88ab, K88ad, K99 và 987P. Năm 1975, Smith, năm 1978, Hall và Kokler (dẫn theo Lê Văn Tạo và cs, 1990) đã đề nghị: Khi lựa chọn những vi khuẩn E. coli để sản xuất vacxin phòng bệnh cần quan tâm đến các yếu tố gây bệnh mà vi khuẩn tiếp nhận được trong quá trình phát triển và có thể có ở bệnh đường ruột, sinh sản, hô hấp đều thấy có mặt của vi khuẩn này. Từ đó đi đến khẳng định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli và đi sâu nghiên cứu những yếu tố gây bệnh của nó (dẫn theo Lê Văn Tạo và cs, 1990). Theo Sokol và cộng sự (1981) sở dĩ vi khuẩn E. coli từ vai trò cộng sinh thường trực trong đường ruột trở thành vi khuẩn gây bệnh là vì trong quá trình sống cá thể vi khuẩn tiếp nhận được các yếu tố gây bệnh mà theo ông đó là yếu tố gây dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv), yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố độc tố đường ruột enterotoxin), yếu tố kháng kháng sinh (R). Các yếu tố gây bệnh này không được di truyền qua ADN của chromosome mà di truyền bằng ADN nằm ngoài chromosome (nhiễm sắc thể) được gọi là plasmid. Qua hiện tượng trao đổi di truyền bằng tiếp hợp, chính những yếu tố gây bệnh này đã giúp cho vi khuẩn bám dính vào được tế bào nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột. Từ đây vi khuẩn thực hiện quá trình PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
8 gây bệnh là sản sinh độc tố gây phá huỷ tế bào niêm mạc ruột, tế bào nhung mao ruột non, từ đó gây dung huyết, nhiễm độc huyết (Sokol và cs, 1981). Bảng 1.1. Các chủng E. coli gây bệnh trên lợn (Fairbrother, 1994) Type kháng Thể bệnh Loại Các yếu tố gây bệnh nguyên O gây ra của vi khuẩn F4 F5 F6 của E. coli E. coli E. coli ST STb LT VT (K88) (K99) (987P) O8K316 Gây bệnh + + + O9K35 ỉa chảy ở + + lợn sơ sinh O9K30 và lợn con ETEC + + O9K103 + + + + O9 Group + + + + O8K4627 Gây bệnh + + + O8 Group ỉa chảy ở + + + lợn sơ O157 KV17 sinh, lợn + + + + ETEC O147 K89 con xuất + + + + + O149 K91 huyết + + + + + đường tiêu hoá O8 Group + + O147 K1285 ETEC + + O115KV165 + O138 K81 ETEC và + + O139 K82 VTEC + + + AEEC O141 K85 + + O45KE65 + + + PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
9 Sau đó Yangc và Konisky (1984) lại thấy rằng Colv là một yếu tố không bền vững với nhiệt và men proteinaza (Yangc và Konisky, 1984). Minshew và cộng sự (1978) đã phát hiện có 48 trong số chủng E. coli phân lập ở đường ruột có khả năng dung huyết, trong khi đó vi khuẩn E. coli phân lập từ phân chỉ có 8 - 18% các chủng gây dung huyết (Minshew và cs, 1978). Evans và cộng sự (1973) cũng thu được kết quả tương tự khi tìm thấy 42% số chủng E. coli phân lập từ đường tiết niệu, 29% số chủng E. coli phân lập từ máu có khả năng gây dung huyết (Evans và cs, 1973). Theo Niconxki (1971) thì khoảng 20 - 50% lợn con bị bệnh chết trong những ngày sơ sinh, đôi khi tỷ lệ chết lên tới 100%. Thiệt hại do nhiễm khuẩn E. coli còn tăng cao do con non quá ốm hoặc sử dụng thức ăn không hợp lý, do chi phí chữa trị và phòng bệnh (Niconxki, 1971). Căn cứ vào kết quả nghiên cứu các yếu tố gây bệnh ở từng chủng E. coli phân lập từ các thể bệnh khác nhau, Faibrother (1992) đã nghiên cứu và đặt tên các chủng vi khuẩn E. coli theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sản sinh ra như: Enterotoxingenic E. coli (ký hiệu là ETEC); Enteropathogenic E. coli (EPEC); Verotoxigenic E. coli (VTEC); Adhesive Enteropathogenic E. coli (AEEC). Từ đó sắp xếp các serotype cùng mang các yếu tố gây bệnh vào các nhóm gây nên những thể bệnh đặc trưng cho từng lứa tuổi lợn khác nhau, như trình bày ở bảng dưới đây (Faibrother, 1992). 1. 2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN E. COLI Trực khuẩn ruột già Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae nhóm Escherichae, loài Escherchia. Trong các vi khuẩn đường ruột, loài Escherichia coli là loài phổ biến nhất. Escherichia coli còn có tên là Bacterium coli commune, Baccillus coli communis lần đầu tiên được Escherich phân lập vào năm 1885 từ phân trẻ em. Nơi cư trú chính của chúng thường ở phần sau của ruột, ít khi ở dạ dày hay ở phần trước ruột của các loài động vật như: ngựa, dê, chó, mèo, bò, gia cầm và người. Chúng theo phân của gia súc hay người mà gieo rắc ra ngoài. Loài vật ăn thịt và loài hỗn thực bài tiết nhiều vi khuẩn E. coli hơn loài ăn cỏ. Vi khuẩn E. coli xuất hiện và sinh sống trong động vật chỉ vài giờ sau khi sinh và tồn tại cho đến khi con vật chết. Ở điều kiện bình thường các chủng E. coli không gây bệnh, khi các điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc, vệ sinh thú y kém dẫn đến sức chống đỡ của con vật suy giảm thì vi khuẩn E. coli trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh. Những chủng E. coli phổ thông về mặt huyết thanh học được chia thành một số type. Một số của những type này đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh cho gia súc. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
10 1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn E. coli Theo Phạm Hồng sơn (2002), chi Escherichia coli 4 loài khác nhau nhưng loài chủ yếu là vi khuẩn E. coli. Vi khuẩn này phát triển rất tốt trên môi trường thạch thường ở 35 - 37ºC sau 12 – 18 giờ hành thành khuẩn lạc tròn lồi, không trong suốt, bóng láng. Trên thạch máu, đa số chủng không gây dung huyết, nhưng cũng có chủng gây dung huyết. Để phân lập thường nuôi cấy khởi đầu trên môi trường tuyển lựa như môi trường Istrati, MacConkey, Endo, Desoxycholat (Phạm Hồng sơn, 2002). 1.2.2.Phân loại Theo Phạm Hồng Sơn (2013) vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae (họ trực khuẩn đường ruột) có nhiều chi khác nhau. Quan niệm phân loại chấp nhận phổ biến hiện nay thì họ này thuộc bộ Enterobacteriales, thuộc lớp Gammaproteobacteria, có 51 chi (trước đây gọi là giống), trong đó có các chi gây bệnh ở động vật và người quan trọng như Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, Edwardsiella và Klebsiella…Chi Escherichia có 4 loài khác nhau gồm E. coli, E. fergusonii, E. hermannii và E. Vulneris nhưng loài chủ yếu là E. coli (Phạm Hồng Sơn, 2013). Căn cứ vào các yếu tố gây bệnh, vi khuẩn E. coli được chia làm 6 nhóm chính; các nhóm vi khuẩn này mang các yếu tố độc lực điển hình và gây nên các bệnh lý khác nhau trên động vật và người (Kaper và cs, 2004; Nataro và cs, 1998) . - Enteropathogenic E. coli (EPEC): Thuộc vào một nhóm huyết thanh học riêng biệt và có tính bám dính, có khả năng xâm nhiễm vào ruột non, phá hủy lớp tế bào biểu mô ruột, kèm theo biểu hiện sốt và tiêu chảy. Vi khuẩn nhóm này thường gây bệnh ở người, thỏ, chó, mèo, lợn và ngựa. - Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC): E. coli sinh độc tố tế bào vero hay còn gọi là E. coli xuất huyết ruột có năng lực sản sinh độc tố vero gây độc tế bào do bacteriphage chi phối và gây bệnh cục bộ (Phạm Hồng Sơn, 2013). - Enterotoxigenic E. coli (ETEC) : E. coli độc tố nguyên đường ruột, vi khuẩn thuộc nhóm này có năng lực hình thành các kháng nguyên lông F2 (tên cũ CFA/I), F3 (CFA/II), F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F16, F41 và các độc tố đường ruột (enterotoxin) do plasmid chi phối. - Enteroaggregative E. coli (EAEC): Vi khuẩn bám lên thành ruột non và ruột già, sản sinh độc tố tế bào và độc tố đường tiêu hóa (EAST1); vi khuẩn nhóm này chỉ có thể tìm thấy ở người và có thể ở lợn, bò. - Enteroinvasive E. coli (EIEC): E. coli xâm lấn đường ruột có khả năng xâm nhập đường ruột và do plasmid chi phối; vi khuẩn thuộc nhóm này chủ yếu được phân lập ở người. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
11 - Diffusely adherent E. coli (DAEC): Có thể tìm thấy trong ruột non, đặc biệt là ở trẻ em từ 12 tháng tuổi trở lên. Trong đó, các chủng vi khuẩn thuộc nhóm EHEC và ETEC thường gây bệnh tiêu chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa. 1.2.3. Đặc điểm về hình thái của vi khuẩn E. coli E. coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 2 - 3 x 0,4 - 0,6 µm. Trong cơ thể động vật chúng có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có khi trong môi trường nuôi cấy thấy có những trực khuẩn dài 4 - 8 µm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già và phần lớn vi khuẩn E. coli di động do có lông ở xung quanh thân, nhưng có một số không thấy di động. Vi khuẩn không hình thành nha bào, có thể có giáp mô (Nguyễn Như Thanh, 1997). Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu ở giữa bắt màu nhạt, không hình thành bào tử. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày để nhuộm có thể thấy giáp mô còn khi soi tươi sẽ không thấy được. Dưới kinh hiển vi điện tử người ta còn phát hiện được cấu trúc pili yếu tố mang kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli ( Nguyễn Như Thanh, 1977). E. coli có sức đề kháng kém với nhiệt độ, vi khuẩn bị tiêu diệt ở 550C trong vòng 1 giờ, 600C trong vòng 15-30 phút, đun sôi 1000C chết ngay. Ở môi trường bên ngoài, các chủng E. coli có thể tồn tại được đến 4 tháng. Các hóa chất sát trùng thông thường: Acid Phenic, Formol, Hydroperoxit 0,1% diệt vi khuẩn sau 5 phút. 1.2.4. Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn E. coli Vi khuẩn E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản nên người ta đã chọn chúng để nghiên cứu về sinh vật học (Nguyễn Như Thanh, 1977). E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5 - 400C, nhiệt độ thích hợp nhất là 370C. pH thích hợp là 7,2 - 7,4 phát triển được ở pH từ 5,5 - 8. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, E. coli phát triển ở các môi trường thông thường với các đặc điểm như sau: * Trên môi trường thạch thường: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, bóng láng, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 – 3 mm. Nuôi lâu khuẩn lạc chuyển màu gần như nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng M và R. * Trên môi trường thạch thịt pepton: sau 18 - 24 giờ bồi dưỡng trong tủ ấm chúng mọc thành những khuẩn lạc ẩm ướt, ánh màu xanh, kích thước trung bình, dạng tròn, mặt khuẩn lạc hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
12 * Trên môi trường nước thịt: Sau khi nuôi cấy 24 giờ, bồi dưỡng ở tủ ấm 370C vi khuẩn E. coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối. *Trên môi trường thạch máu: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng có thể gây dung huyết. Kích thước từ 1 – 2 mm tuỳ thuộc vào chủng và serotype. * Trên môi truờng thạch MacConkey: Sau khi nuôi cấy 24 giờ, bồi dưỡng tủ ấm 37 C hình thành khuẩn lạc màu đỏ cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, 0 không làm chuyển màu môi trường. * Trên môi trường Endo: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có ánh kim hoặc không có ánh kim. * Trên môi trường EMB (Eosin Methylen Blue): Hình thành khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim. * Trên môi trường thạch SS: Vi khuẩn E. coli có khuẩn lạc màu đỏ. * Trên môi trường thạch Brilliant green: Sau 24 giờ nuôi ở 370C hình thành khuẩn lạc không màu trên nền vàng chanh. 1.2.5. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli E. coli lên men sinh hơi các loại đường fructoza, glucoza, galactoza, lactoza, manniton, levuloza, xyloza. Trừ đường andonit và inozit thì vi khuẩn E. coli không lên men. Lên men không chắc chắn các loại đường dulcitol, saccharoza, salicin. Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi nhanh đường lactoza, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt E. coli và Salmonella. Vi khuẩn E. coli được phân biệt dựa vào các đặc tính sinh hóa trên môi trường 3 ống nghiệm sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C: Môi trường KIA (Kliglet Iron Agar) cho phép đọc 4 tính chất: Khả năng lên men đường Glucose (+), làm phần thạch đứng chuyển từ màu hồng sang màu vàng. - Khả năng lên men đường Lactose (+), làm phần thạch nghiêng chuyển từ màu hồng sang màu vàng. - Khả năng sinh hơi (+), làm phần thạch đứng bị nứt hoặc tạo thành bọt khí bên trong hoặc có thể đẩy toàn bộ khối thạch lên cao và ở dưới là hơi, - Khả năng sinh H2S (-): Vi khuẩn E. coli không có khả năng sinh hơi H2S nên phần thạch đứng không có màu đen. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma