Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 2

Chia sẻ: Asdfadf Adgsg | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

109
lượt xem 25
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Các kĩ thuật chẩn đoán miễn dịch học mà điển hình là kĩ thuật ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) cũng tỏ ra rất hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh không thua kém phƣơng pháp PCR. Nguyên tắc của kĩ thuật này dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 2

DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân tử kháng thể ...................................................... 4 Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu lộ trên bề mặt tế bào ......................................................................................... 10 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4+ trên tế Hình 2.3 bào TH ................................................................................................... 10 Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào tƣơng ...................................................... 11 Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh .................................. 12 Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN không phụ thuộc tuyến ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B .................................................. 13 Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay không phụ thuộc tuyến ức. KN không phụ thuộc vào tuyến ức không gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG ........................................ 13 Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngoài còn KT bị giữ lại .................................................................................. 17 H ình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên ............................................. 19 Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus .................................... 20 Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh........................................................................... 26 Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm tích ........................................................................................................ 27 Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ...................................................... 30 Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ........................................ 32 Hình 7.1 Thỏ nuôi thí nghiệm............................................................................... 50 Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai ........................................................................... 50 Hình 7.3 Tiêm dƣới da .......................................................................................... 50 x
DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình ngắn ngày ........................ 23 Bảng 3.2 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình dài ngày (qui trình viện Pasteur Tp. HCM) ................................................................................. 24 Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................ 33 Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 ............................................................. 34 Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................................ 35 Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và thỏ 4 ...................................................................................................... 36 Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở qui trình ngắn ngày và dài ngày............................................................ 37 Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh gắn S. aureus ở các nồng độ khác nhau ....................................................... 38 Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2 ............................................................................................................ 39 Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 ...................................................................................................... 39 Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 (qui trình ngắn ngày) ........................................ 40 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày) ........................................... 41 xi
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu ............................................. 35 Biểu đồ 4.2 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích của thỏ 2 ........................................................................... 36 Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 3 và thỏ 4 ở các thời điểm khác nhau ...................................................... 36 Biểu đồ 4.4 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích của thỏ 4 ........................................................................... 37 Biểu đồ 4.5 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không đƣợc hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 ở qui trình ngắn ngày .................. 41 Biểu đồ 4.6 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không đƣợc hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 ở qui trình dài ngày ..................... 42 xii
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1 Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli ............................ 22 Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh ......................................... 25 Sơ đồ 3.3 Qui trình hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu ................................. 28 Sơ đồ 3.4 Qui trình gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus .... 29 Sơ đồ 3.5 Qui trình chuẩn bị dịch kháng nguyên thực hiện phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ........................................................................ 31 xiii
1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong chăn nuôi việc chẩn đoán, phát hiện bệnh sớm để điều trị kịp thời sẽ làm giảm đáng kể những thiệt hại gây ra về kinh tế cũng nhƣ sức khỏe của ngƣời tiêu dùng. Tùy theo từng tác nhân gây bệnh mà có các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh khác nhau. Thông thƣờng để chẩn đoán bệnh do vi sinh vật ngƣời ta dùng phƣơng pháp cổ điển là nuôi cấy phân lập tế bào vi sinh vật, định danh chúng bằng các phản ứng huyết thanh học. Kĩ thuật hiện đại nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn các phƣơng pháp kinh điển do đó giúp chẩn đoán nhanh và chính xác hơn. Nhƣng kĩ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên liệu riêng, đắt tiền, kĩ thuật thực hiện còn phức tạp, cán bộ kĩ thuật phải có trình độ kĩ thuật nhất định. Các kĩ thuật chẩn đoán miễn dịch học mà điển hình là kĩ thuật ELISA (Enzyme- linked immunosorbent assay) cũng tỏ ra rất hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh không thua kém phƣơng pháp PCR. Nguyên tắc của kĩ thuật này dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Dựa vào nguyên tắc này các nhà sản xuất tạo ra các bộ kít chẩn đoán phát hiện vi sinh vật gây bệnh để ngƣời chăn nuôi có thể tự mình kiểm tra xem vật nuôi có mang mầm bệnh hay không nhƣ bộ kit chẩn đoán bệnh đốm trắng cho tôm... Hiện nay ở Việt Nam việc sản xuất kháng huyết thanh và kháng thể phục vụ cho việc chẩn đoán bệnh bằng miễn dịch học trong chăn nuôi còn ít, chỉ mới áp dụng cho một số bệnh. Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó chúng tôi đi vào nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E. coli” để phục vụ cho việc chẩn đoán nhanh và điều trị bệnh kịp thời. Ngoài ra có thể ứng dụng vào sản xuất kháng huyết thanh kháng các vi sinh vật gây bệnh quan trọng khác.
2 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất kháng huyết thanh phục vụ cho công tác chẩn đoán bệnh. 1.2.2. Yêu cầu  Xây dựng quy trình tiêm thỏ thí nghiệm.  Thu nhận kháng huyết thanh từ thỏ thí nghiệm.  Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc.
3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH 2.1.1. Khái niệm miễn dịch Miễn dịch là khả năng đề kháng của sinh vật chống lại một sinh vật khác và các chất mang trên bản thân chúng với những dấu hiệu thông tin di truyền ngoại lai. Khả năng miễn dịch của một cơ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố di truyền của loài, sức đề kháng của mỗi cá thể, điều kiện ngoại cảnh (dinh dƣỡng, vệ sinh, môi trƣờng…). 2.1.2. Kháng nguyên [2] 2.1.2.1. Định nghĩa Kháng nguyên (KN) là tất cả các chất, đôi khi kể cả thành phần cấu tạo của cơ thể, khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật sẽ gây nên một đáp ứng miễn dịch, tức một quá trình sinh học phức tạp dẫn đến sự tổng hợp một phân tử đặc biệt gọi là kháng thể dịch thể hoặc kháng thể tế bào và chúng có đặc tính liên kết đặc hiệu với KN đó. 2.1.2.2. Khái niệm về epitop (biểu vị) Epitop là những cấu trúc trên bề mặt của phân tử KN, có khả năng tạo kháng thể riêng biệt hoặc những thụ thể đặc hiệu trên bề mặt của một số tế bào lympho. Epitop có 2 đặc tính: Tính KN: là đặc tính của một epitop có cấu trúc ba chiều liên kết bổ sung với phần cấu trúc ba chiều của phân tử kháng thể (KT). Phần cấu trúc này của phân tử KT hoặc của thụ thể đƣợc gọi là paratop. Tính miễn dịch: của một epitop là đặc tính gây ra một đáp ứng miễn dịch trong một cơ thể. Nếu KN là protein thì kích thƣớc của một epitop KN vào khoảng 5 -10 gốc acid amin. Một phân tử KN có thể có một hoặc nhiều epitop. Số lƣợng epitop phụ thuộc vào kích thƣớc của phân tử KN và thƣờng có khoảng 1 epitop cho mỗi 5 kDa.
4 2.1.3. Kháng thể dịch thể [2] 2.1.3.1. Định nghĩa Kháng thể dịch thể hay immunoglobulin (Ig) là protein “dạng cầu” đƣợc tổng hợp bởi tế bào tƣơng (plasma cell) khi bị kích thích bởi KN. Nó đƣợc tạo ra để giúp sinh vật chống đỡ các yếu tố KN có hại xâm nhập vào cơ thể. 2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin Phân tử Ig gồm một hay nhiều đơn vị với cấu trúc tƣơng đối giống nhau. Mỗi đơn vị là một phân tử protein có 4 chuỗi polypeptid giống nhau từng đôi một: 2 chuỗi nhẹ và 2 chuỗi nặng, chúng đƣợc nối với nhau bằng những cầu nối disulfua (-S-S-) (hình 2.1). Chuỗi nhẹ L (light chain) Chuỗi nhẹ có trọng lƣợng phân tử Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân khoảng 23.000 Da. Có hai loại chuỗi tử kháng thể nhẹ chung cho tất cả các lớp Ig: (http://www.accessexcellence.org/ RC/VL/GG/antiBD_mol.html) Chuỗi nhẹ Kappa (kí hiệu K hay κ) Chuỗi nhẹ Lambda (kí hiệu λ) Tỉ lệ mang chuỗi nhẹ κ và λ của các Ig khác nhau giữa các loài. Chuỗi nhẹ đƣợc chia thành hai phần dài bằng nhau:  Phần hằng định: kí hiệu CL (constant) có tận cùng –COOH với trình tự acid amin tƣơng đối không đổi.  Phần thay đổi: kí hiệu VL (variable) có tận cùng là –NH2. Trật tự acid amin trong vùng này thay đổi từng nhóm một, rất khác nhau từ cá thể này đến cá thể khác và ngay trong một cá thể, phần này đƣợc kí hiệu Vκ (cho type kappa) và Vλ (cho type lambda). Chuỗi nặng H (heavy chain) Chuỗi nặng có trọng lƣợng phân tử từ 50.000 Da đến 70.000 Da tùy theo lớp Ig (IgM, IgG, IgA, IgE…). Chuỗi nặng cũng chia thành 2 vùng: vùng hằng định (C H) và vùng thay đổi (VH).
5 Ngƣời ta phân biệt 5 lớp Ig chủ yếu dựa vào sự khác nhau của các mạch polypepptid trong chuỗi nặng. Nếu trong chuỗi nặng của Ig có các chuỗi: Gamma (γ) thì Ig đó đƣợc gọi là IgG Muy (μ) thì Ig đó đƣợc gọi là IgM Alpha (α) thì Ig đó đƣợc gọi là IgA Delta (δ) thì Ig đó đƣợc gọi là IgD Epsilon (ε) thì Ig đó đƣợc gọi là IgE Ngoài các phần bất biến và siêu biến, chuỗi nặng còn một nhóm glucid đƣợc gọi là oligosaccharide có nhiệm vụ cố định bổ thể giúp cho kháng thể dễ dàng bám vào bề mặt của tế bào thực bào và quyết định tính KN của phân tử KT. Theo quan điểm ngày nay thì vùng siêu biến của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ tham gia vào sự hình thành cấu trúc bổ sung đặc hiệu trong sự kết hợp với KN (paratop). Paratop không phải là một đoạn peptid liên tục, dài mà chỉ là một (hoặc một số) acid amin nằm cách quãng. Đó là những “điểm” mà paratop tiếp xúc với epitop, thông thƣờng mỗi paratop có từ 3-6 “điểm” nhƣ vậy. 2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của thú [2] [13] 2.1.4.1. Loài thú Đáp ứng miễn dịch càng tăng khi có sự khác biệt di truyền giữa thú gây miễn dịch (túc chủ) với loài đƣợc sử dụng làm kháng nguyên càng lớn vì kháng nguyên sẽ có nhiều epitop lạ đối với túc chủ. Đối với hầu hết các kháng nguyên protein, thỏ là thú thuận tiện để gây miễn dịch thực nghiệm. 2.1.4.2. Yếu tố di truyền Khả năng đáp ứng miễn dịch của thú còn phụ thuộc vào yếu tố di truyền vì với cùng một loại kháng nguyên nếu đƣa vào các cá thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau. Thông thƣờng các thú lai khác dòng có khả năng kích thích miễn dịch cao hơn các thú lai cùng dòng.