LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: "SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHỈ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG GÂY CẢM NHIỄM VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC KHÁC NHAU"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:66

Thêm vào BST

Báo xấu

95
lượt xem 20
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Sự biến đổi các chỉ tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực khác nhau” nhằm xách sự biến động các chỉ tiêu huyết học của cá tra giống khi cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có LD50 khác nhau. Đề tài được thực hiện trên ba chủng chủng T8, KSL 103, CAF 258 với hai đối chứng (một đối chứng tiêm nước muối sinh lý và một đối chứng không tiêm). Nồng độ vi khuẩn gây cảm nhiễm là liều...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: "SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHỈ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG GÂY CẢM NHIỄM VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC KHÁC NHAU"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG VĂN NHÍ SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHỈ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG GÂY CẢM NHIỄM VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC KHÁC NHAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG VĂN NHÍ SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHỈ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG GÂY CẢM NHIỄM VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC KHÁC NHAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. PHẠM THANH LIÊM 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
LỜI CẢM TẠ Xin gởi lời cảm tạ sâu sắc đến thầy Phạm Thanh Liêm đã tạo điều kiện cho tôi được thực nghiệm và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin gởi lời cảm ơn quý báo đến cô Đặng Thị Mai Thy, cô Nguyễn Thị Thu Hằng cùng với tất cả các quý thầy cô, các anh chị cán bộ trong khoa Thủy Sản nói riêng và trường Đại học Cần Thơ nói chung đã truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức nền tảng quý báo trong suốt thời gian học tập ở trường và làm luận văn tốt nghiệp. Cảm ơn cha mẹ và các anh chị tôi đã động viên và tạo điều kiện cho tôi được hoàn thành tốt việc học tập trong suốt 4 năm theo học ở trường. Tôi xin cảm ơn bạn Nguyễn Thị Chúng, bạn Lê Thượng Khởi đã cùng thực hiện đề tài với tôi và cuối cùng là tất cả các bạn cùng lớp Bệnh học Thủy sản khóa 31 đã nhiệt tình động viên và hỗ trợ tôi trong thời gian học tập ở trường. Xin chân thành cảm ơn! i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
TÓM TẮT Đề tài “Sự biến đổi các chỉ tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực khác nhau” nhằm xách sự biến động các chỉ tiêu huyết học của cá tra giống khi cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có LD50 khác nhau. Đề tài được thực hiện trên ba chủng chủng T8, KSL 103, CAF 258 với hai đối chứng (một đối chứng tiêm nước muối sinh lý và một đối chứng không tiêm). Nồng độ vi khuẩn gây cảm nhiễm là liều gây chết 50% tương ứng với từng chủng vi khuẩn, thời điểm thu mẫu được được định là thu trước khi thí nghiệm,; thu lần 1 sau khi gây cảm nhiễm và lần 2 được thu sau 12 ngày cảm nhiễm. Hồng cầu được phân tích theo phương pháp của Natt and Herrick, (1952), bạch cầu được phân tích theo phương pháp của Humason, (1979), số liệu thống kê được sử lý bằng trương trình SPSS 16.0 (sử dụng phép thử phép thử Ducan và phép thử LSD). Sau khi phân tích nhậ thấy: sự biến động về số lượng tế bào hồng cầu giữa 3 chủng T8, KSL 103, CAF 258 là giống nhau; Chủng T8 có tỷ lệ giảm số lượng TBC, lympho, tiểu cầu ít hơn, BCĐN thì cao hơn chủng KSL 103 và CAF 258; Khả năng phục hồi TBC ở chủng T8 nhanh hơn, còn BCTT và BCĐN thì chủng CAF 258 nhanh hơn. ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
MỤC LỤC Trang Phần 1:ĐẶT VẤN ĐỀ ---------------------------------------------------------------- 1 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ------------------------------------------------- 3 2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi thâm canh cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long ----------------------------------------------------------------------------------- 3 2.2 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra ---------------- 3 2.2.1 Sơ lược về lịch sử bệnh do E.ictaluri gây ra trên cá trơn------------------ 3 2.2.2 Đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hóa ---------------------------------- 4 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý ---------------------------------------------------------------- 4 2.3 Các chỉ tiêu huyết học ------------------------------------------------------------ 5 2.3.1 Hồng cầu ------------------------------------------------------------------------- 6 2.3.2 Tế bào lympho ------------------------------------------------------------------ 6 2.3.3 Tiểu cầu ------------------------------------------------------------------------- 6 2.3.4 Bạch cầu đơn nhân ------------------------------------------------------------- 6 2.3.5. Bạch cầu trung tính ------------------------------------------------------------ 6 2.3.6 Một số nghiên cứu về huyết học trên cá ------------------------------------- 8 2.4 Một số kết quả gây cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong phòng thí nghiệm ------------------------------------------------------------------------------ 9 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ------------------ 11 3.1 Thời gian và địa điểm ---------------------------------------------------------- 11 3.2 Vật liệu nghiên cứu ------------------------------------------------------------- 12 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm --------------------------------------------------------- 12 3.2.2 Dụng cụ và thiết bị------------------------------------------------------------ 12 3.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn -------------------------------- 12 3.3 Phương pháp nghiên cứu ------------------------------------------------------- 12 3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể --------------------------------------------------------- 12 3.3.2 Cách chuẩn bị dung dịch vi khuẩn------------------------------------------ 12 3.3.3 Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cá ------------------------------------------------ 13 3.3.4 Bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm ------------------------------------------- 14 3.3.5 Thời gian thu mẫu ------------------------------------------------------------ 14 3.4 Phương pháp phân tích mẫu --------------------------------------------------- 14 3.4.1 Phương pháp đếm hồng cầu (Natt and Herrick, 1952) ------------------ 15 3.4.2 Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu (Humason, 1979) -------- 16 3.5 Tái phân lập và tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri theo phương pháp truyền thống-------------------------------------------------------------------- 17 3.6 Xử lý số liệu --------------------------------------------------------------------- 17 PHẦN 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ----------------------------------------------- 18 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
4.1 Đặc điểm cá thí nghiệm -------------------------------------------------------- 18 4.1.2 Đặc điểm bên ngoài----------------------------------------------------------- 18 4.1.3 Đặc điểm bên trong ----------------------------------------------------------- 18 4.2 Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn E. ictaluri ------------------- 19 4.3 Kết quả phân tích huyết học --------------------------------------------------- 21 4.3.1 Hồng cầu ----------------------------------------------------------------------- 22 4.3.1.1 Hình tái hồng cầu ----------------------------------------------------------- 22 4.3.1.2 Số lượng hồng cầu ---------------------------------------------------------- 23 4.3.2 Bạch cầu------------------------------------------------------------------------ 25 4.3.2.1 Tổng bạch cầu --------------------------------------------------------------- 25 4.3.2.2 Các loại tế bào bạch cầu --------------------------------------------------- 28 4.4 Mức độ biến động về huyết học giữa các chủng vi khuẩn----------------- 31 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT -------------------------------------------- 33 5.1 Kết luận --------------------------------------------------------------------------- 33 5.2 Đề xuất --------------------------------------------------------------------------- 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ---------------------------------------------------------- 34 Phụ lục -------------------------------------------------------------------------------- 35 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.3 5. Tế bào máu ......................................................................................... 8 Hình 3.1: Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm....................................................... 14 Hình 3.4 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu ................................................ 16 Hình 3.4.1 Buồng đếm hồng cầu ................................................................. 17 Hình 4.1 Hệ thống các bể bố trí thí nghiệm .................................................. 18 Hình 4.1.3 Nội tạng cá tra bị nhiễm E. Ictaluri ............................................ 19 Hình 4.2.1 Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.......................................... 19 Hình 4.2.2 Kết quả test sinh hóa vi khuẩn E. Ictaluri ................................... 20 Hình 4.3.1.1a Hồng cầu cá khỏe .................................................................. 23 Hình 4.3.1.1bHồng cầu cá bệnh ................................................................... 23 Hình 4.3.1.2 Sự biến động số lượng hồng cầu qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri ........................................................................................... 25 Hình 4.3.2.1 Sự biến động số lượng TBC qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri ........................................................................................... 28 Hình 4.3.2.2 Hình thái các tế bào bạch cầu .................................................. 31 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.2.1 Các chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm.............................. 11 Bảng 4.2 Kết quả tái định danh vi khuẩn sau khi gây cảm nhiễm ................. 21 Bảng 4.3.1.2 Sự biến động số lượng hồng cầu (tế bào x 10 5/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri ........................................................... 23 Bảng 4.3.2.1 Sự biến động số lượng TBC (tế bào x 10 4/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri ................................................................. 26 Bảng 4.3.2.2a Sự biến động số lượng lympho (tế bào x 10 3/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri ........................................................... 29 Bảng 4.3.2.2b Sự biến động số lượng tiểu cầu (tế bào x 10 3/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri ........................................................... 29 Bảng 4.3.2.2c Sự biến động số lượng bạch cầu trung tính (tế bào x 103/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri ......................................... 30 Bảng 4.3.2.2d Sự biến động số lượng bạch cầu đơn nhân (tế bào x 103/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluric ....................................... 30 Bảng 4.4a Sự biến động (%) của các tế bào hồng cầu và bạch cầu giữa các chủng vi khuẩn E.ictaluri ở đợt thu mẫu lần 1 ............................................. 31 Bảng 4.4a Sự biến động (%) của các tế bào hồng cầu và bạch cầu giữa các chủng vi khuẩn E.ictaluri ở đợt thu mẫu lần 2 ............................................. 32 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long TGTM: Trắng gan, trắng mang Tb: tế bào BCTT: Bạch cầu trung tính BCĐN: Bạch cầu đơn nhân TBC: Tổng bạch cầu vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Gới thiệu Hiện nay nuôi trồng thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước, sản lượng, diện tích ngày càng tăng. Riêng Đồng Bằng Sông Cửu Long, tính đến năm 2008 đã hơn 1,2 triệu ha diện tích mặt nước có khả năng nuôi trồng thủy sản, chiếm gần bằng 60% của cả nước, trong đó diện tích có khả năng nuôi thuỷ sản nước ngọt trên 500.000 ha và được xác định là có điều kiện rất thuận lợi. Giá trị xuất khẩu cũng rất lớn, năm 2007 tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long đạt 2,328 tỷ USD, năm 2008 tăng lên 2,5 tỷ USD, chiếm hơn 60% tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước. Trong đó cá tra là một trong những đối tượng thủy sản được xuất khẩu nhiều nhất, năm 2008 Đồng Bằng Sông Cửu Long có 5.102ha diện tích ao nuôi (tăng 11% so năm 2007), với sản lượng cá trên 1 triệu tấn, xuất khẩu trên 535 ngàn tấn qua 117 quốc gia (http://seafoodno4.com/chitiettt.php?id=143). Để đảm bảo sản lượng xuất khẩu nên bên cạnh việc tăng diện tích nuôi người dân còn đẩy mạnh việc nuôi cá với mật độ cao, dẫn đến nhiều yếu tố bất lợi như ô nhiễm nguồn nước, dịch bệnh thường xuyên xảy ra… gây nhiều tổn thất cho người nuôi. Vì vậy, nhiều nghiên cứu nhằm tìm hiểu và phòng chống dịch bệnh trên thủy sản đựơc thực hiện là đều tất yếu. Kết quả điều tra của Lý Thị Thanh Loan (2008 ) về tình hình dịch bệnh năm 2007 ở đồng bằng sông Cửu Long thì tần suất xuất hiện bệnh mủ gan là 52,80%; xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70% và vàng da: 21,60%,trong đó bệnh mủ gan gây nhiều tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi. Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998 (Ferguson et al.., 2001). Về tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra đã được Từ Thanh Dung (2005) xác định là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi. Khi bệnh cá bơi lờ đờ, bỏ ăn, thân, vi và hậu môn bị huyết, đồng thời trên gan, thận và tụy tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3 mm bên trong chứa dịch màu trắng đục. Cùng với việc xác định được tác nhân gây bệnh, từ trước đến nay đã có nhiều chủng vi khuẩn được phân lập từ các ao nuôi cá bị bệnh mủ và gây cảm nhiễm trở lại trong phòng thí nghiệm nhằm tìm hiểu khả năng gây bệnh, đặc điểm sinh hóa, tìm hiểu độc lực…Tuy nhiên, vẫn chưa có chủng vi khuẩn nào đã phân lập, được tìm hiểu về huyết học. Vì vậy đề tài “Sự biến đổi các chỉ 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực khác nhau” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu Xác định sự biến động các chỉ tiêu huyết học của cá tra giống khi cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có LD50 khác nhau 1.3 Nội dung thưc hiện • Gây cảm nhiễm cho cá tra giống với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có LD50 khác nhau. • Định loại và định lượng các tế bào máu trên cá tra cảm nhiễm. • Tái phân lập và định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi thâm canh cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Với xu hướng thâm canh trong nghề nuôi cá tra thì dịch bệnh tren cá xảy ra là đều khó có thể tránh khỏi. Bệnh gây tổn thất lớn cho người nuôi, nếu không có biện pháp phòng và điều trị hiệu quả, bệnh sẽ lây lang và phát triển thành dịch thì khó mà khống chế được. Cùng với sự thâm canh đó là nguồn nước ngày càng bị ô nhiễm do việc sử dụng nhiều thuốc và hoá chất phòng trị bệnh, sự phân hủy thức ăn dư thừa, các sản phẩm bài tiết của cá…từ các ao nuôi thải ra kinh, rạch không qua sử lý, trong nguồn nước thải đó luôn tồn tại nhiều mầm bệnh, chúng sẽ bộc phát khi đủ số lượng và điều kiện thuận lợi. Theo kết quả điều tra của Nguyễn Chính (2005) ở Cần Thơ và An Giang cho thấy có nhiều bệnh xuất hiện trong nuôi cá tra thâm canh như: mủ gan, đốm đỏ, phù đầu, lở loét, trắng mang-trắng gan, lồi mắt nổ mắt, nấm thủy mi, xuất huyết đường ruột, ký sinh trùng. Trong đó, bệnh thường gặp và gây hại lớn là bệnh mủ gan với tỷ lệ chết lên đến 80-90%, kế đến là những bệnh phù đầu, lồi mắt, nổ mắt với tỷ lệ chết từ 60% đến 70%. Còn theo Từ Thanh Dung (2005) thì tần xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản với vi khuẩn (50,9%), virut (24,6%), kí sinh trùng (21,1%), n ấm (3,4%). Theo Nguyễn Tấn Duy Phong (2008), bệnh xuất hiện quanh năm nhưng chủ yếu tập trung vào tháng 5 đến tháng 9, đỉnh điểm là từ tháng 9 đến tháng 11 hàng năm. Một số bệnh xuất hiện với tần số cao như gan thận mủ (93,8%), xuất huyết (75%), trắng gan trắng mang (68,8%). 2.2 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra 2.2.1 Sơ lược về lịch sử bệnh do E.ictaluri gây ra trên cá trơn Vi khuẩn E.ictaluri được Hawke (1979) phân lập đầu tiên trên cá nheo Mỹ. Đến năm 1981, Hawke và ctv. xác định vi khuẩn E.ictaluri là nguyên nhân gây bệnh ESC (Enteric septiceamia catfish). Vi khuẩn E.ictaluri có khả năng gây bệnh trên một số nhóm cá như Blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish (Ictalurusrcatus) (Hawke, 1981), cá trê trắng (Clarias batrachus) (Plumb,1987). Ở Việt Nam, bệnh do vi khuẩn E.ictaluri gây ra trên cá tra được gọi là bệnh BNP (Bacillary necrosis of Pangasius)-mủ gan. Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở ĐBSCL cuối năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh 3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ (Ferguson et al., 2001). Bệnh gây hao hụt rất lớn ở cá giống nhưng thiệt hại kinh tế lớn nhất ở giai đoạn vào khoảng 300- 500 g (Từ Thanh Dung và ctv, 2005), những mô tả về mô bệnh học đầu tiên của bệnh này được thực hiện bởi Ferguson et al., (2001). Đến năm 2002, Crumish et al. (2002), khẳng định rằng E.ictaluri là tác nhân chính gây bệnh mủ gan trên cá tra nuôi ở ĐBSCL, thiệt hại do bệnh mủ gan gây lên đến 90% ( Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003), hơn nữa mầm bệnh diễn biến ngày càng phức tạp và có chiều hướng gia tăng, theo Phạm Thanh Tuấn (2004) tần số xuất hiện của bệnh là 43,3% sang năm 2005 là 82% (Nguyễn Chính, 2005) đến năm 2008 là 96,8% (Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008). 2.2.2 Đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hóa Vi khuẩn E.ictaluri được mô tả đầu tiên bởi Hawke et al. (1981) là vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae , vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, kích thước khoảng 0,75 x 1,5-2,5 nm, di động ở 25-300C và di động yếu hoặc không di động ở nhiệt độ cao hơn 300C, không có khả năng chịu được ở độ mặn cao hơn 1,5%, phát triển trên môi trường thạch rất chậm, trên môi trường TSA sau 48 giờ ở 28- 300C hình thành khuẩn lạc nhỏ, tròn và trắng đục. Môi trường đặc trưng là EIA (Edwardsiella ictaluri agar) và EMB ( Eosin Methylen Blue). Theo Từ thanh Dung và ctv (2003) vi khuẩn E.ictaluri phân lập từ cá tra Việt Nam có một số đặc điểm khác so với mô tả của Plumb (1999) như có dạng hình que và có kích thước biến đổi, phát triển tốt ở 280C và phát triển yếu ở 370C. Điều này lý giải tại sao E.ictaluri cho tới nay chỉ phát hiện trên cá mà chưa tìm thấy trên các động vật máu nóng khác. Theo Lương Trần Thục Đoan (2006), khi kiểm tra đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn E.ictaluri 224 phân lập trên cá tra ở Việt Nam thì chỉ tiêu citrate cho kết quả dương tính, đây là điểm khác biệt so với vi khuẩn E.ictaluri phân lập trên cá nheo. 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý Cá bệnh mủ gan không có những biểu hiện bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi nhưng giảm ăn, một số trường hợp cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ da nhợt nhạt, có biểu hiện xuất huyết trên da và hậu môn. Dấu hiệu bệnh lý đặc thù nhất là bên trong nội quan các cơ quan gan, thận,và tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng, đường kính 1- 3mm, các cơ quan này sưng to và có biểu hiện nhũng thận (Ferguson et al., 2001). Trên cá tra, E.ictaluri tấn công vào các cơ quan như thận, gan, tỳ tạng (Ferguson, Từ Thanh Dung và ctv., 2001). Theo Lương Trần Thục Đoan (2006), thì thận và tỳ tạng là 2 hai cơ quan mà vi khuẩn tấn công đầu tiên chứ 4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
không phải ở gan. Ngoài ra, khi thu mẫu ngoài thực tế cũng tìm thấy vi khuẩn tại các cơ quan khác như: máu, não, cơ,mang, tim, bóng hơi. Trong đó, thận, tỳ tạng, bóng hơi là những cơ quan bị nhiễm E.ictaluri cao. Kết quả kiểm tra bằng phương pháp mô bệnh học quan sát thấy trên gan xuất hiện nhiều vùng xung huyết động mạch và tĩnh mạch gan, mô gan bị hoại tử và mất cấu trúc, từng cụm vi khuẩn xuất hiện ở rìa các vết thương ở gan cá tra bị bệnh. Tương tự, ở thận cũng xung huyết và hoại tử, tỳ tạng xuất hiện nhiều vùng ngoại tử trên các vết thương (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002; Trần Thị Ngọc Hân, 2006), trong khi những biến đổi mô học nghiêm trọng được ghi nhận trên cá nheo bệnh ESC là ở cơ quan thận và tỳ tạng, cả 2 cơ quan này đều hoại tử, gan chỉ bị sưng (Areechon et al., 1983; trích dẫn từ Plumb, 1999). 2.3 Các chỉ tiêu huyết học Máu cá là thành phần quan trọng trong hệ tuần hoàn của tất cả cơ thể sống, là môi trường sinh lý của cơ thể. Chính vì vậy, các chỉ tiêu huyết học của cá được nghiên cứu ngày càng nhiều và có liên quan đến vấn đề sức khỏe của cá (Bhasker and Rao, 1995 trích dẫn bởi Yazlak, 2003). Máu cá gồm những tế bào máu được lưu thông trong môi trường lỏng là huyết tương hay dịch bạch huyết đối với động vật không xương sống. Máu có chức năng vận chuyển oxi, cung cấp vật chất dinh dưỡng, bài tiết những sản phẩm từ mô và các cơ quan ra ngoài cơ thể. Ngoài ra, máu có vai trò tạo ra sức hô hấp cho cá, máu được tuần hoàn trong cơ thể là nhờ sự họat động của hệ thống mao mạch hoặc cơ quan đặc biệt là tim (Aqualex Multimedia Consortium Ltd Ireland, 1988). Trong thành phần của máu cá, huyết tương có khoảng 90% là nước và 10% là những vật chất vô cơ gồm những chất như globulin miễn dịch, globulin α, globulin β, kháng thể,.. và hữu cơ hòa tan. Huyết thanh là chất lỏng có màu vàng, là phần còn lại sau hiện tượng máu đông lại, thành phần của huyết thanh tương tự như huyết tương nhưng không có các thành phần máu vón lại (Aqualex Multimedia Consortium Ltd Ireland, 1988). Máu cá bị tác động bởi nhiều yếu tố: điều kiện môi trường (Casillas and Smith, 1977), giống loài ( Siddiquire and Nasim, 1979), kích cở cá (Garcia, 1992), mùa vụ (Cech and Wohlschlag,1981) trích bởi Yazlak, 2003. Tế bào máu của cá được chia làm hai nhóm chính: Hồng cầu (erythrocyte) và bạch cầu (gồm có 4 loại tế bào chính là bạch cầu có hạt (granulocyte), bạch cầu đơn nhân (monocyte), tế bào lympho (lymphocyte) và tiểu cầu (thrombocyte). Trong đó, bạch cầu có hạt (granulocyte) gồm bạch cầu 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
trung tính (neutrophil), bạch cầu kiềm tính (basophil) và bạch cầu toan tính (eosinophil). 2.3.1 Hồng cầu Hồng cầu trưởng thành ở cá có hình tròn hoặc hình oval với nhân bắt màu đậm và kích thước từ 10x11–12x13 µm, đường kính 4-5 µm. Hồng cầu phổ biến trong máu ngoại vi của cá chủ yếu lá hồng cầu trưởng thành, hồng cầu chưa trưởng vẫn tìm thấy nhưng rất ít và kích thước giống hồng cầu trưởng thành nhưng nhân lớn hơn. Hồng cầu có tế bào chất bắt màu xanh nhạt hoặc xám bởi thuốc nhuộm Wright và Giemsa (Chinabut et al., 1991). 2.3.2 Tế bào lympho Tế bào lympho ở cá da trơn nhỏ hơn hồng cầu, kích thước biến động 6 - 11 µm. Tế bào có hình tròn, nhân chiếm toàn bộ tế bào bắt màu tím đậm khi nhuộm với Giemsa, tế bào chất nhỏ không rõ ràng và thường bắt màu xanh nhạt (Chinabut et al., 1991). Theo Phuong et al. (2007) chia tế bào lympho trong máu cá trê lai thành 2 loại: tế bào lympho nhỏ có kích cở 3,92-5,00 µm và, và tế bào lympho lớn có kích cở khoảng 5,09-8,77 µm và có số lượng lớn nhất trong số tổng bạch cầu (17,55-108,37x10 3 tb/µL). 2.3.3 Tiểu cầu Hình dạng thay đổi, có thể là hơi tròn, dài hoặc hơi thoi. Có vành mỏng của tế bào chất bao quanh nhân. Tế bào chất có màu xanh nhạt khi nhuộm với dung dịch Wright & Giemsa. Tiểu cầu tham gia vào quá trình đông máu trong trường hợp bị tổn thương (Chinabut et al., 1991). 2.3.4 Bạch cầu đơn nhân Bạch cầu đơn nhân là tế bào lớn nhất trong các dạng tế bào máu với đường kính 10-14 µm, hình dạng không đều, chúng có tâm lệch, trong tế bào chất tồn tại những không bào có nhiều kích thước khác nhau. Nhân bắt màu xanh, tế bào chất bắt màu xanh nhạt. (Chinabut et al.,1991). Bạch cầu đơn nhân chỉ tồn tại vài ngày trong vòng tuần hoàn máu, sau đó di chuyển xuyên qua màng trong của mao mạch để liên kết với các mô và thực hiện chức năng thực bào (Gartner & Hiatt, 1997). Chúng thực bào, hủy diệt những vật lạ (vi khuẩn), những tế bào chết hoặc những tế bào già cỗi (như hồng cầu) và tham gia vào quá trình trình diện kháng nguyên. 2.3.5. Bạch cầu trung tính Tế bào lớn và tròn đường kính nhân 9-13 µm với số lượng lớn của những hạt nhỏ trong tế bào chất màu xanh nhẹ hoặc hơi hồng. Nhân bắt màu 6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
xanh đậm, chia hai thùy ở tế bào thành thục và dạng tròn thành thục và dạng tròn lệch tâm ở dạng chưa trưởng thành (Chinabut et al., 1991). Ở động vật có vú, bạch cầu trung tính là tế bào thực bào chính và xuất hiện nhanh tại vị trí viêm. Nó có khả năng ăn những tế bào nhỏ nên còn được gọi là tiểu thực bào. Finn & Nielson (1971) đã báo cáo về sự di chuyển và thực bào bởi bạch cầu trung tính và các đại thực bào trong quá trình viêm do vi khuẩn ở cá hồi. Khi bạch cầu trung tính thực hiện chức năng thực bào xong thì nó cũng chết và trở thành đối tượng thực bào của đại thực bào (Hibiya, 1982), kết quả là xuất hiện mủ tại chỗ viêm. Chúng chỉ tồn tại trong máu khoảng 10 giờ rồi đi ra khỏi ống mạch tới mô. 7 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
A B C D E F Hình 2.3.5 Tế bào máu (Multimedia et al., 1988) A: Hồng cầu (erythrocyte) B: Bạch cầu đa nhân (granulocyte) C: Bạch cầu đơn nhân (monocyte) D: Tiểu cầu (thrombocyte) E: Lympho (lymphocyte) F: Lympho chưa trưởng thành 2.3.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến các thông số huyết học trên cá Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chỉ tiêu huyết học của cá chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: Ảnh hưởng của hàm lượng kẽm, nghiên cứu của Kori- Siakpere et al. (2008) trên đối tượng Heteroclarias sp, khi cho cá tiếp xúc với môi trường nước có lượng kẽm 5mg/l trong 15 ngày. Sau đó kiểm tra các chỉ tiêu huyết học về chỉ tiêu haematocrit, haemoglobin,...Trong đó, tổng số tế bào bạch cầu (8,22 ± 0,09.10 3 tb/mm3) và hồng cầu (1,41 ± 0,06. 10 6 tb/mm3 ) điều giảm nhưng không có ý nghĩa so với đối chứng (8,42 ± 0,06.10 3 tb/mm3) và 1,63 ± 0,12.10 6 tb/mm3), riêng tế bào lympho lại tăng. Ngoài ra, dưới điều kiện stress do sự thay đổi giá trị của pH làm cho lượng bạch cầu giảm, tăng 8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
lượng đường trong máu và tạo ra nhiều tế bào hồng cầu chưa trưởng thành ở 3 loài cá chép ấn độ (Jera et al., 2006). Năm 2003, Harikrishnan et al. nghiên cứu huyết học của cá chép (Cyprinus carpio) gây cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila, kết quả cho thấy tế bào hồng cầu giảm, bạch cầu tăng so với đối chứng với giá trị lần lượt là: 1,68 ± 0,12.106 tb/mm3 , 3,6 ± 0,2.10 4 tb/mm3 và 2.31 ± 0,16.10 3 tb/mm3, 3,15 ± 0,14.103 tb/mm3. Bên cạnh đó, cá rô phi (Nile tilapia) được gây cảm vi khuẩn Enterococus sp. Sau 24 giờ kiểm tra chỉ tiêu huyết học cho kết quả tương tự, số lượng hồng cầu giảm đi, còn số lượng bạch cầu tăng lên. Trong đó, số lượng bạch cầu đơn nhân (monocyte) lại giảm so với đối chứng (Martins et al., 2008). Theo Dương Thành Long, 2008 đã nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học trên cá tra với trọng lượng khác nhau. Cá nhỏ có trọng lượng trung bình 38,24 g/con mật độ hồng cầu 1,86.10 6 tb/mm3, tổng bạch cầu 7,39. 10 6 tb/mm3. Trong khi đó, cá lớn có trọng lượng 1060g/con thì mật độ hồng cầu 1,32.106 tb/mm3, tổng bạch cầu 8,07. 10 6 tb/mm3. Kết quả cho thấy mật độ hồng cầu, tế bào lympho và bạch cầu trung tính của cá nhỏ cao hơn cá lớn. Ngược lại, tổng bạch cầu, tế bào monocyte và tiểu cầu thì thấp hơn cá lớn. Ngoài ra, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu huyết học của cá tra bị trắng gan trắng mang (TGTM) cho thấy hồng cầu ở cá bị TGTM nhẹ (4,25.105 tế bào/mm3) hay nặng (1,04.105 tế bào/mm3) đều giảm hơn so với cá khỏe (2,27.10 6 tế bào/mm3), mật độ bạch cầu ở cá không có biểu hiện TGTM tăng hơn so với cá khỏe. Trong khi đó, mật độ bạch cầu của cá bị TGTM nhẹ (3,27.10 4 tế bào/mm3), TGTM nặng (0,99.10 4 tế bào/mm3) thì giảm hơn cá khỏe (10,12.10 4 tế bào/mm3). Mật độ tiểu cầu, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính giảm ở cá bị trắng gan trắng mang điều giảm, trừ tế bào lympho tăng ở cá bị TGTM nhẹ (Phạm Thị Phương Tiến, 2008). 2.4 Một số kết quả gây cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong phòng thí nghiệm Thí nghiệm cảm nhiễm là việc làm rất quan trọng và không thể thiếu trong nghiêu cứu bệnh học thủy sản vì “tác nhân gây bệnh phải có khả năng gây bệnh khi gây nhiễm vào con vật mẫn cảm”. Tùy vào mục đích nghiên cứu mà lựa chon phương pháp gây cảm nhiễm khác nhau, riêng đối với vi khuẩn nói chung và vi khuẩn E. Ictaluri nói riêng thì thường dùng phương pháp tiêm và phương pháp ngâm để gây cảm nhiễm cho cá. Lương Trần Thục Đoan (2006) gây cảm nhiễm khảo sát sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh mủ gan trên các cơ quan khác nhau của cá tra theo 2 9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
phương pháp ngâm và tiêm cho thấy ở phương pháp ngâm do mật độ vi khuẩn thấp nên tỉ lệ cá chết thấp (8,3%), còn phương pháp tiêm cá chết với tỷ lệ 33,3%, 66,7% và 100% tương ứng với 3 mật độ 104, 105, 106. Tuy nhiên, theo Williams & Lawrence (2005) đã sử dụng vi khuẩn E. ictaluri R4383 WT và R4383 HM với nồng độ lần lượt là 7,0 x 107CFU/ml và 7,2x107 CFU/ml ngâm trên cá nheo Mỹ trong thời gian 30 phút, tỉ lệ chết là 90% và 85%. Đồng thời, tác giả cũng sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri để so sánh với phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn tăng dần. Đối với vi khuẩn E. ictaluri R4383 WT tiêm với mật độ 5,2x103 CFU/ml, 5,2x104 CFU/ml, 5,2x105 CFU/ml thì tỉ lệ chết lần lượt là 67,2%, 100%, 100%. Trong khi đó, tiêm E. ictaluri R4383 HM với mật độ vi khuẩn là 5,2x103 CFU/ml, 5,2x104 CFU/ml, 5,2x105 CFU/ml và 5,2x10 6 CFU/ml gây chết 63,5%, 98,7%, 100%, 100%. Qua kết quả thí nghiệm, họ kết luận rằng không có sự khác nhau giữa hai phương pháp ngâm và tiêm. Thí nghiệm của Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) khi tiến hành ngâm vi khuẩn E. ictaluri ở mật độ 1,5x102 và 1,5x103 CFU/ml thì tỉ lệ cá chết dao động từ 56,6% đến 96,7%. Bên cạnh đó Tiết Ngọc Trân (2007) cũng ngâm với 2 dòng vi khuẩn là 18764 và 223 mật độ 0,9x108 CFU/ml, sau 1h tỉ lệ xâm nhập của 2 dòng tương đối cao khoảng 104-105CFU/ml sau đó giảm dần, trong các cơ quan phân tích thì ruột là cơ quan cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri cao nhất, kế đến là thận, tỳ tạng, gan. Lê Minh Đương (2007) cũng tiến hành thí nghiệm trên cá tra bằng phương pháp ngâm với 2 dòng vi khuẩn EH02 & E223 kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm của dòng vi khuẩn EHO2 cao nhất là ở tỳ tạng (92,5%), thấp nhất là não (27,5%). Trong khi đó, lô E223 thì tỉ lệ cảm nhiễm cao nhất là lớp nhớt trên da (80%) và thấp nhất là mang (2,5%). Nghiên cứu này cũng xác định được tỉ lệ cá chết dao động từ 2,5-92,5% với mật độ vi khuẩn là 108 CFU/ml. Trong thí nghiệm xác định LD50 của các chủng A1, CAF 258, T8, KSL 103, Lê Thượng Khởi (2009) xác định được LD50 của 3 chủng CAF258, T8, KSL103 với giá trị LD50 lần lượt là 4,7x102 CFU/ml; 1,3x104 CFU/ml và 2,1x104 CFU/ml, còn chủng A1 không xác định được LD50 do ở nồng độ thấp (103) đã gây chết 100% số cá thí nghiệm. Qua đó cho thấy độc chủng CAF 258 khá mạnh, còn LD 50 chủng A1 dưới 103. 10 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm - Thời gian: tháng 01/2009 đến 06/2009. - Địa điểm: Phòng cảm nhiễm, phòng thí nghiệm của Bộ môn sinh học và Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm Cá tra giống có trọng lượng trung bình khoảng 20g/con, được mua từ các trại giống thuộc khu vực Cần Thơ. Nguồn vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được phân lập từ mẫu cá tra bị bệnh gan thận mủ và được trữ trong tủ - 800C của bộ môn sinh học và bệnh thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ và đã được xác định LD50 (Lê Thượng Khởi, 2009) ở Bảng 3.1. Bảng 3.2.1 Các chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm STT Chủng vi khuẩn Năm thu mẫu Nguồn gốc LD50 1 T8 2008 Thốt Nốt - Cần Thơ 1,3x104 CFU/ml 2 CAF258 2006 Châu Phú - An Giang 4,7x102 CFU/ml 3 KSL103 2008 Kế Sách - Sóc Trăng 2,1x104 CFU/ml 3.2.2 Dụng cụ và thiết bị • Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt, ống nghiệm, đĩa petri thủy tinh, micropipet 1ml, 5ml, hộp đầu col 1ml, 5ml, chai 100ml, 250ml, 500ml, lame, lamen, đĩa Petri viết lông dầu, viết chì, bình xịt cồn, sổ ghi chép, kim tiêm 1ml, bộ tiểu phẩu, ống nghiệm, buồng đếm hồng cầu... • Bể Composite (2m3), bể thí nghiệm (100L), máy bơm nước (cấp nước cho hệ thống thí nghiệm), máy sục khí, ống sục khí, đá bọt, tủ ấm, nồi thanh trùng, máy ly tâm, máy so màu quang phổ, máy trộn mẫu (vortex). Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho nghiên cứu… 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
3.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn • NaCl, Na2SO4, Na2HPO4.2.H2O, NaH2PO4.2H2O, KH2PO4 • Formaline (37%). • Methanol • Glycerol • Wright, Giemsa. • Acid citric • Tripticase soy agar (TSA), nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA). • Cồn tuyệt đối, NaCl, H2O2, vaselin, hóa chất nhuộm gram, dầu paraffin, oxidase và một số hóa chất và môi trường để test truyền thống. 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể • Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorin 200ppm, phơi khô. Sau đó cấp nước vào: • Đối với bể 2m3 để trữ cá thì cấp nước khoảng 2/3 bể, sục khí 1-2 ngày trước khi thí nghiệm. Bể được đặt ngoài trời có mái che (tránh mưa). • Đối với bể thí nghiệm 100L thì cấp khoảng 60L nước, sục khí. Bể được đặt trong phòng kín nhiệt độ phòng 26-28 0C. • Nguồn nước sử dụng là nguồn nước máy Các dụng cụ thí nghiệm như: xô, dợt, ống sục khí, đá bọt…cũng được vệ sinh kỹ. 3.3.2 Cách chuẩn bị dung dịch vi khuẩn Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường NA/TSA ở 280C. Sau 24-48 giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn. Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng 2 đến 3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml NB đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ. Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm 4000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần). 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com