LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT GIỐNG CÁ TRÊ VÀNG ĐA BỘI (Clarias macrocephalus Gunther)"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:56

Thêm vào BST

Báo xấu

147
lượt xem 25
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

So sánh tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng về chiều dài và khối lượng giữa cá sốc nhiệt và cá bình thường sau khi ương. Xác định tỷ lệ cá trê vàng đa bội xuất hiện trong các nghiệm thức sốc nhiệt. Theo dõi các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, hàm lượng oxy hòa tan, NH3, NO2

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT GIỐNG CÁ TRÊ VÀNG ĐA BỘI (Clarias macrocephalus Gunther)"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN HUỲNH TẤN HỒNG THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT GIỐNG CÁ TRÊ VÀNG ĐA BỘI (Clarias macrocephalus Gunther) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. BÙI MINH TÂM 2009 1
Chương I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Giới thiệu Nhóm cá trơn nói chung và cá trê nói riêng phân bố khá rộng rãi, đặc biệt là vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới. Chúng sống được trong nhiều loại hình thủy vực khác nhau kể cả môi trường giàu chất dinh dưỡng. Trong 4 loài cá trê ở nước ta hiện nay thì cá trê vàng (Clarias macrocephalus) là loài có giá trị kinh tế nhất, do chất lượng thịt thơm ngon nên được nhiều người ưa chuộng và thịt cá có màu vàng nghệ trông hấp dẫn hơn nên càng thu hút nhiều thực khách. Do cá chậm lớn hơn so với cá giống loài khác nên xu hướng người ta nuôi các loại cá khác trong họ cá trê nhiều hơn, chính điều này đã làm sản lượng cá trê vàng ngày càng cạn kiệt. Với thực tế đó, để khắc phục nhược điểm trên của cá trê vàng thì một số biện pháp được đặt ra như cho lai tạo giữa các loài cá trê với nhau. Bên cạnh đó thì cũng có vài nghiên cứu về gây đa bội thể cá được tiến hành nhưng chưa phổ biến rộng rãi. Kết quả là sản lượng cá trê tăng lên nhưng lại làm chất lượng thịt cá giảm đi và làm cho nguy cơ con cá trê vàng bị tuyệt chủng do sự phát triển lấn át của các loài cá khác. Từ vấn đề này nên đề tài “Thử nghiệm sản xuất cá trê vàng (Clarias macroephalus Gunther, 1864) đa bội” được thực hiện ở Trại Thực Nghiệm – Bộ môn kỹ thuật nuôi thủy sản nước ngọt – Khoa thủy sản – Trường Đại Học Cần Thơ là rất cần thiết. 1.2. Mục tiêu của đề tài Nhằm tìm ra được thời gian sốc nhiệt hợp lý cho tỷ lệ cá trê vàng đa bội cao. 1.3. Nội dung của đề tài Tiến hành sốc nhiệt trứng đã thụ tinh sau 15 phút ở 4 oC trong 10, 20, 30 phút. So sánh các chỉ tiêu về tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở và tỷ lệ dị hình giữa cá trê vàng bình thường và cá trê vàng đa bội. 2
So sánh tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng về chiều dài và khối lượng giữa cá sốc nhiệt và cá bình thường sau khi ương. Xác định tỷ lệ cá trê vàng đa bội xuất hiện trong các nghiệm thức sốc nhiệt. Theo dõi các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, hàm lượng oxy hòa tan, NH3, NO2-. 3
Chương II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược đặc điểm sinh học cá trê vàng 2.1.1. Vị trí phân loại Cá trê vàng có tên khoa học là Clarias macrocephalus Gunther (Nguyễn Bạch Loan, 2003) với vị trí phân loại như sau: Ngành: Chordata Ngành phụ: Verebrata Lớp: Osteichthyes Bộ: Siluriformes Họ: Clariidae Giống: Clarias Loài: Clarias macrocephalus Gunther 2.1.2. Phân bố Cá phân bố rộng trên thế giới, đặc biệt là vùng Á nhiệt đới và nhiệt đới.Chúng có khả năng sống tốt ở vùng nước thiếu oxy và giàu chất hữu cơ.Để nhận dạng cá trê vàng với các loài cá trê khác ta dựa vào: cá trê vàng xương chẩm hình vòng cung, trê trắng xương hình chữ V, trê phi xương chẩm hình chữ M, trê đen xương chẩm tương tự như cá trê trắng, nhưng gốc của xương chẩm hơi tù hơn. Cá trê vàng mấu xương chẩm có dạng hình vòng cung, chiều rộng gốc mấu xương chẩm lớn hơn 3 lần chiều cao của chính nó (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993) 2.1.3. Đặc điểm sinh sản Ngoài tự nhiên cá có thể sinh sản quanh năm, cá thành thục lần đầu khi được khoảng 8 tháng tuổi. Cá có hai mùa sinh sản chính là tháng 3-6 và tháng 7-8 hàng năm. Sức sinh sản tương đối của cá dao động từ 40.000 – 50.000 trứng/kg cá cái. Trứng cá trê thuộc loại trứng dính và có tập tính làm tổ đẻ dọc theo các bờ 4
ao, mực nước nông, nhiệt độ cho cá sinh sản tốt từ 28-30 o C. Sau khi cá sinh sản xong ta có thể nuôi vỗ tái thành thục khoảng 30 ngày thì cá có thể tham gia sinh sản trở lại. Phân biệt cá đực, cá cái: Cá cái: Bụng to, mềm đều, lỗ sinh dục hình vành khuyên và phồng to thường có màu đỏ nhạt. Lấy ngón tay vuốt nhẹ bụng cá từ trên xuống thấy có trứng chảy ra, kích cở trứng đồng đều, căng tròn với màu sắc đặc trưng. Cá đực: Có gai sinh dục dài, hình tam giác, phía đầu gai sinh dục nhọn và hơi nhỏ, gai sinh dục màu hồng nhạt. 2.1.4. Đặc điểm dinh dưỡng Cá trê là loài ăn tạp thiên về động vật đáy, cá thích ăn xác động vật đang thối rữa. Cá trê có đặc tính ăn tạp, thức ăn chủ yếu là động vật. Trong tự nhiên cá trê ăn côn trùng, giun ốc, tôm, cua, cá, ... ngoài ra trong điều kiện ao nuôi cá trê còn có thể ăn các phụ phẩm từ trại chăn nuôi, nhà máy chế biến thủy sản, chất thải từ lò mổ (Dương Nhật Long, 2003). Khả năng sử dụng thức ăn chế biến của cá cũng rất cao. (Nguyễn Văn Kiểm, 2004). 2.1.5. Điều kiện nuôi Cá trê vàng là loài dễ nuôi, có thể sống và phát triển tốt trong môi trường có hàm lượng hữu cơ cao. Vùng nước ngọt không bị nhiễm phèn hay nhiễm phèn nhẹ, các yếu tố môi trường thích hợp cho sự phát triển của cá. Nhiệt độ thích hợp từ 26-32oC, chịu nhiệt độ thấp 15 oC và trên 38-40oC. pH thích hợp 6,5-7 và cũng có thể sống ở những vùng nhiễm phèn trung bình với pH = 5,5. Oxy trên 3 ppm, đặc biệt cá có cơ quan hô hấp phụ nên có thể chịu đựng môi trường dưỡng khí thấp, trên 2 ppm là đã sống được. N-NH3 0,2 - 2 ppm. 2.1.6 Một số bệnh thường gặp Trong quá trình ương nuôi cá thì có một số bệnh sau (Đào Hoàng Đẳng, 1992). 5
Bệnh lỡ loét: Bệnh xuất hiện sau những cơn mưa kéo dài. Cá bị xay xát do đánh bắt hay vận chuyển. Môi trường nuôi quá bẩn. Triệu chứng: Trên cơ thể xuất hiện những vết loét lúc đầu nhỏ, dần dần to ra và ăn sâu vào xương, bệnh nặng vết loét ăn sâu vào đầu, cá bỏ ăn và chết hàng loạt. Bệnh trắng da: Bệnh thường xuất hiện khi nhiệt độ môi trường thấp, cá bị đánh bắt, lọc, vận chuyển làm cá xay xát làm bệnh dễ dàng xâm nhập. Bệnh thường xảy ra ở cá giống. Triệu chứng: Trên da cá xuất hiện vài điểm trắng lớn nhỏ khác nhau, hoặc cả thân có màu trắng nhợt nhạt, gan có những đốm trắng nhỏ li ti, cá mất nhớt, râu quéo lại hoặc bị ăn cụt, cá treo mình ngày càng nhiều và sau đó chết hàng loạt trong thời gian ngắn. Ngoài ra còn một số bệnh khác như bệnh do nhiễm nấm thủy my, ký sinh trùng bám. 2.2. Sơ lược về đa bội thể Việc vận dụng kỷ thuật nhiễm sắc thể để sản xuất cá đa bội được tiến hành nghiên cứu từ giữa những năm 1970 (Thorgaard 1983, 1986). 2.2.1 Khái niệm đa bội thể Đa bội thể được dùng để chỉ cá thể có thừa bộ nhiễm sắc thể. Bình thường bộ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh là lưỡng bội (2N). Và cá thể đa bội (3N) và tứ bội (4N). Đa bội ở cá thì có khả năng sống sót và thường bất thụ do tuyến sinh dục không phát triển (Phạm Thanh Liêm & ctv, 2006). Đa bội thể là sự thay đổi số lượng nhiễm sắc thể. Sự thay đổi số lượng nhiễm sắc thể có nhiều kiểu gồm đa bội nguyên (euploidy), đa bội thể lai (alloploidy) và đa bội thể lệch (aneuploidy). 6
Đa bội thể nguyên: Sự tăng nguyên lần số nhiễm sắc thể đơn bội của một loài. Các dạng này gồm thể đơn bội (monoploid), thể đa bội (triploid) và thể tứ bội (tetraploidy). Đa bội thể lai: Là sự kết hợp của 2 bộ nhiễm sắc thể của 2 loài khác nhau cùng đứng chung trong một tế bào. Đa bội thể lệch: Là sự thay đổi số lượng nhiễm sắc thể của từng cặp (Phạm Thành Hổ, 2000). 2.2.2 Đặc điểm của cá thể đa bội Theo Phạm Thanh Liêm & ctv (2006), thì cá đa bội thường tăng trưởng nhanh hơn so với cá lưỡng bội bình thường, sự gia tăng này có được là do có thể là kết quả của việc tuyến sinh dục không phát triển, tốc độ tăng trưởng của các loài cá thường chậm lại khi chúng thành thục sinh dục hoặc là do sự gia tăng kích thước tế bào. 2.2.3 Thuận lợi của việc nuôi cá đa bội Tăng trưởng nhanh, gia tăng sản lượng, chất lượng thịt tăng. Sự bất thụ là một tính trạng mong muốn đạt được, đồng thời ngăn cản sự tạp lai trở lại với loài bố mẹ. Hạn chế được quá trình xác định các loài ngoại nhập có thể nuôi được hay không, cũng như hạn chế sự phân bố của chúng ở các vùng địa lý khác nhau. Nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn và thường áp dụng cho những loài lớn chậm (Jeff C. Dillon, 1988). 2.2.4 Nguyên lý tạo ra cá thể đa bội Phương pháp gây đa bội dựa trên nguyên lý kích thích mẫu sinh nhân tạo. Tiến hành thụ tinh trứng bình thường, rồi xử lý trứng để lưỡng bội hóa bộ nhiễm sắc thể cái ở thời điểm giảm phân II, kết quả là hình thành phôi đa bội. Ngoài ra, đa bội thể còn được tạo ra bằng cách lai giữa thể tứ bội (4n) và thể lưỡng bội (2n) (Nguyễn Tường Anh, 1999). Đa bội có thể tạo ra bằng một quá trình thụ tinh bình thường, sau đó là quá trình giữ lại thể cực thứ 2. Nếu con cái là đồng hợp XX , tất cả các thế hệ con sẽ nhận 2 nhiễm sắc thể X từ mẹ và hoặc là nhiễm sắc thể X hoặc Y từ bố. Khi đó XXX sẽ là con cái, XXY là con đực. Nếu con đực đồng hợp ZZ, thế hệ 7
con đa bội sẽ có 3 kiểu gen WWZ, WZZ và ZZZ, nhưng giới tính thì không xác định. Thể cực thứ 2 có thể giử lại bằng cách sốc nhiệt (lạnh hoặc nóng), áp suất thủy tỉnh, hoặc sốc hóa chất trong thời gian ngắn sau khi thụ tinh. Thời gian gây sốc khác nhau tùy loài. Gây sốc bằng áp suất thủy tỉnh thường có tỷ lệ sống, và tỷ lệ đa bội cao hơn so với sốc nhiệt. 2.3. Các phương pháp gây đa bội Theo Phan Cự Nhân và ctv (2003), thì hiện nay người ta đã sử dụng 7 phương pháp chính để gây đa bội thể ở thực vật và động vật (thực vật là chủ yếu). 2.3.1 Phương pháp ly tâm Người ta đặt cơ thể hoặc cơ quan có tế bào phân chia vào ly tâm, để ngăn cản sự hình thành sợi thoi vô sắc, hoặc ngăn cản các nhiễm sắc thể di chuyển về các cực của tế bào. 2.3.2 Phương pháp sốc nhiệt Nhiệt độ tăng hoặc giảm dần trong giới hạn ít ảnh hưởng tới tần số đột biến. Sốc nhiệt hoặc làm thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn mức trung bình đột ngột có hiệu quả gây đột biến. Nguyên nhân do mỗi cơ thể sinh vật có cơ chế nội cân bằng, giữ cho hoạt động sinh lý của tế bào không bị thay đổi khi nhiệt độ thay đổi. Khi sốc nhiệt, khi nhiệt độ tăng hay giảm một cách bất bình thường thì cơ chế này bị phá vỡ, gây chấn thương bộ máy di truyền của tế bào. Và cản trở sự dịch chuyển của các nhiễm sắc thể từ mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc và các cực của tế bào tạo nên đột biến. 2.3.3 Phương pháp gây chấn thương Phương pháp này hiệu quả nhất đối với cây họ cà. Ở cây họ cà, chổ chấn thương do cắt hoặc ghép dễ hình thành mô sẹo. Từ mô sẹo, từ nách lá cắt ngang sẽ mộc chồi bất định có số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào tăng gấp đôi. 8
2.3.4 Phương pháp đa phôi Sau khi thụ tinh, một số phôi đa bội có thể hình thành và từ đó có thể hình thành thể đa bội. 2.3.5 Phương pháp phóng xạ Khi tế bào sắp hoặc đang phân chia tiến hành chiếu xạ bằng bức xạ ion hóa sẽ ngăn cản hoặc làm đứt sợi thoi vô sắc. Nhiễm sắc thể ở lại mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, tạo nên tế bào đa bội. 2.3.6 Phương pháp xử lý bằng các tác nhân hóa học Một số chất như Acenafen, Monoclobenzen, Paradiclorbenzen,… có thể ngăn cản sự hình thành thoi vô sắc, gây đứt sợi thoi vô sắc hoặc cản trở sự hình thành màng ngăn trong tế bào khi đang phân cắt. Kết quả tạo ra tế bào nhiều nhân, có số lượng nhiễm sắc thể tăng gấp bội. Nguyên nhân, do các tác nhân gây đột biến có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và màng nhân, đồng thời gây thay đổi trạng thái của DNA và nhiễm sắc thể (Khuất Hữu Thanh, 2005). 2.3.7 Xử lý Colchicine Đây là phương pháp cho hiệu quả cao nhất và đang được áp dụng phổ biến hiện nay. Colchicine có công thức hóa học là C22H25NO6, là một loại kiềm thực vật, có độc tính cao được chiết xuất từ cây Colchicum autumnale mọc ở Địa Trung Hải, dễ tan trong nước, rượu và benzen. Colchicine ngăn cản nhiễm sắc thể di chuyển từ mặt phẳng xích đạo về 2 cực của tế bào, làm tăng gấp đôi số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào. Người ta còn sử dụng Colchicine ở nồng độ 0,1-0,2% để xử lý tế bào động vật nuôi cấy. 2.4. Sơ lược về hồng cầu 2.4.1 Hồng cầu Hồng cầu là một loại huyết cầu có số lượng nhiều nhất trong các tế bào máu. Huyết cầu ở các tế bào trưởng thành phần lớn hình bầu dục. Hồng cầu cá có nhân, hai bên lồi ra. Do có nhân nên hồng cầu cá có mức độ tiêu hao oxy lớn (Đỗ Thị Thanh Hương & ctv, 2000). 9
Kích thước: Biến động lớn tùy theo loại cá, to nhất là cá sụn, cá miệng tròn rồi đến cá xương. Kích cở hồng cầu càng nhỏ thì số lượng hồng cầu trên một đơn vị thể tích càng nhiều, và mức độ tiến hóa của loài càng cao. Kích thước hồng cầu được biểu thị là a*b, đơn vị tính µm. Trong đó, a: là đường kính lớn, b: đường kính nhỏ. 2.4.2 Số lượng hồng cầu Trong điều kiện bình thường thì số lượng hồng cầu của mỗi loài cá là ổn định, nó phản ánh tập tính sống của cá, cá sống tầng mặt thì có số lượng hồng cầu thấp do có đầy đủ oxy và càng xuống sâu thì số lượng hồng cầu càng nhiều (Đỗ Thị Thanh Hương & ctv, 2000). 2.4.3 Chức năng của hồng cầu Hồng cầu là tế bào chuyên biệt có chức năng là vận chuyển oxy và CO2. Tham gia duy trì thành phần các ion của máu, điều hòa pH máu. 2.5. Phương pháp xác định thể đa bội Theo Đặng Hữu Lanh và ctv (1999), thì việc xác định thể đa bội có những phương pháp sau: Những nghiên cứu cho thấy kích thước của nhân và tế bào là phương tiện đáng tin cậy để phân biệt thể đa bội và lưỡng bội. Loại tế bào sử dụng phổ biến là tế bào hồng cầu. Việc xác định thể đa bội bằng tế bào hồng cầu thực sự thuận lợi với người nghiên cứu. Phương pháp đơn giản là nhuộm tiểu hạch (nucleoli), số lượng của chúng tỷ lệ thuận phản ánh số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào. Phương pháp đơn giản hơn là so sánh giải phẩu hình thái giữa con lai đa bội và bố mẹ lưỡng bội bằng cách đếm số lượng sắc tố ấu trùng. Một cách trực tiếp là kiểm tra số lượng nhiễm sắc thể. Phương pháp này chính xác, nhưng gặp khó khăn trong chuẩn bị tiêu bản. Ngoài ra, có thể dựa vào hàm lượng DNA, tuy phức tạp trong ứng dụng thực tế nhưng rất được chú ý trong nghiên cứu. 10
2.6. Sơ lược về đa bội thể ở cá Đa bội được thực hiện thành công ở cá bằng việc sử dụng hóa chất như colchicine (Smith and Leoine, 1979), cytochalasin B (Refstie et al, 1977), áp suất (Benfey and Sutterlin 1984b; Chourrout 1984), sốc lạnh (Swarup 1959a; Purdom 1972; Gervai et al. 1980; Meriwether 1980; Wolters et al. 1981a) và sốc nhiệt (Lincoln and Scott 1983; Scheerer and Thorgaard 1983). Theo Wolter et al (1984). đã nghiên cứu thành công phương pháp cho sinh sản nhân tạo cá nheo đa bội đạt 100% , bằng cách sốc nhiệt lạnh sau khi trứng đã thụ tinh trong 5 phút ở 5 oC trong 1 giờ và tỷ lệ nở đạt 79%. Ueno Koichi (1984), tiến hành nghiên cứu đa bội thể cá chép bằng cách sốc nhiệt ở 0-0,3oC sau 5 và 10 phút thụ tinh trong 30 phút và 60 phút. Kết quả là ở thời điểm sau thụ tinh 5 phút và sốc trong 30 phút cho kết quả tốt nhất. Tại Thailand, Uthairat Na-Nakorn (1995) tiến hành so sánh sốc nhiệt cá trê vàng ở 41-42oC trong 1 phút và sốc lạnh ở 7oC trong 14 phút. Kết quả cho thấy tiến hành sốc lạnh ở 7 oC cho kết quả tốt nhất. Và nhiệt độ tốt nhất để sốc nóng trứng đã thụ tinh là 42oC (U. Na-Nakorn et al, 1993). Linhart et al (1991), thì các loài cá vùng nước ấm nói chung và cá trê vàng nói riêng thì sốc lạnh thì đạt hiệu quả cao về tăng trưởng và tỷ lệ đa bội cũng cao. Ngoài ra thì việc thực hiện đa bội cá trê vàng được thực hiện, với kết quả khả quan cho tỷ lệ sinh trưởng nhanh và thịt có chất lượng cao (Arlo W. Fast, 1998). 2.6.2 Việt Nam Ở việt nam thì cá trê vàng đa bội được tiến hành nghiên cứu trong 2 năm 1997 và 1998 ở Chi nhánh phía nam trung tâm nhiệt đới Việt Nga và viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2 (Nga và ctv., 1998). 11
Chương III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu Dụng cụ trong phòng thí nghiệm: Cân 2 số lẻ, kính hiển vi, thước đo cá, đĩa pêtri, lame và lamel, cối nghiền thuốc và ống kim tiêm. Dụng cụ kiểm tra môi trường: Máy đo pH, bộ test kiểm tra các yếu tố (NO2-, NO3-, NH4+/NH3, Oxy hòa tan). Dụng cụ kiểm tra đa bội: Kính hiển vi, lame và lamel, buồng đếm hồng cầu, cốc thủy tinh. Kích dục tố: Não thùy cá chép, HCG (Human chorionic gonadotropin). Hóa chất pha dung dịch Natt-Herrick NaCl: 3,88g Na2SO4: 2,50g Na2HPO4:12H2O: 2,91g KH2PO4: 0,25g Formalin (37%): 7,50 mL Methyl Violet 2B: 0,10g Nước cất: 1000 mL 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện trong khoảng 3 tháng. 3.2.2 Địa điểm Đề tài được thực hiện tại trại thực nghiệm - Bộ môn kỹ thuật nuôi thủy sản nước ngọt - Khoa thủy sản - trường Đại Học Cần Thơ. 3.2.3 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần. Gồm nghiệm thức đối chứng (NTDC) không sốc lạnh và các nghiệm thức sốc 12
lạnh trứng đã thụ tinh sau 15 phút ở 4oC trong 10 phút (NTI), 20 phút (NTII) và 30 phút (NTIII). Tiến hành sốc nhiệt trứng sau thụ tinh 15 phút. Chuẩn bị: Cá bố mẹ được thu mua từ chợ 12 cặp. Tiêu chuẩn cá bố mẹ: Cá ít hay không bị xay xát, khỏe mạnh. Con đực thon dài, gai sinh dục dài và hơi ửng hồng. Con cái bụng to, mềm đều, lổ sinh dục hơi xung huyết. Khi để nhẹ xuống đất thì thấy rỏ 2 buồng trứng. Cá mua xong được vận chuyển nhanh về trại và trữ trong thau lớn, thêm nước vào qua khỏi phần lưng cá và được đậy kín. F M Hình 1: Cá trê vàng đực (M) và cá trê vàng cái (F). Kích thích sinh sản nhân tạo Cá cái được tiêm 2 liều: Liều sơ bộ 4 não thùy/kg và liều quyết định 4000 UI HCG/kg, liều quyết định sau liều sơ bộ là 8h. Cá đực liều bằng ½ cá cái (2000 UI HCG/kg) và được chích cùng thời điểm với liều quyết định. Vị trí tiêm: Tiêm ở cơ vi lưng cách đầu 2-3 cm, mỗi con tiêm 0,5 mL thuốc. 13
Vuốt trứng, thụ tinh và sốc nhiệt: Trước khi vuốt trứng cần chuẩn bị sẵn thau để ấp trứng sau khi sốc nhiệt và có gắn sục khí. Sau khi chích liều quyết định khỏang 14h là cá bắt đầu rụng trứng, chờ khoảng 30 phút sau thì ta lựa chọn ra những con cái khi nâng cá lên (phần đầu hướng lên) và dùng tay ấn nhẹ vào bụng cá thấy trứng chảy ra là có thể vuốt được, những con còn lại sau khi vuốt lần đầu xong thì vuốt các con còn lại. Trứng cá tốt khi trứng được vuốt nhẹ nhàng và chảy ra thành dòng và không bị vón lại. Vuốt trứng: Trước khi vuốt cần chuẩn bị cân, đĩa pêtri, lông gà, chén nhỏ, Cối nghiền, dung dịch nước muối ure (3g muối + 4g Urea)/L nước. Dùng khăn khô giữ con đực mổ lấy tinh sào, lau khô cho vào cối nghiền để sẵn. A A B Hình 2: Tinh sào cá sau khi mổ cá đực (A) và cá đực sau khi mổ (B) Cá cái được lấy ra khỏi nước và cho vào một thao khác không có nước, dùng một khăn khô để bắt cá, thao tác phải nhẹ nhàng và tiến hành vuốt trứng cá. Khi vuốt xong thì thụ tinh cho trứng. Tinh sào cắt nhỏ ra, và nghiền mịn, sau đó rắc vào trứng và dùng lông gà quậy đều, tiếp theo cho một ít dung dịch muối urea vào và quậy nhanh tay hơn. Tiếp theo trứng được rắc lên vĩ ấp trứng để chờ sốc nhiệt. 14
Sốc nhiệt trứng: Sau khi trứng và tinh trùng gặp nhau, trứng được cho trực tiếp vào nước lạnh ở 4oC, nhiệt độ được duy trì bằng cách thêm hay bớt nước đá ra. Hình 3: Sốc lạnh trứng sau khi thụ tinh Hình 4: Ấp trứng sau khi sốc lạnh Khi thời gian sốc tương ứng với từng nghiệm thức là 10’, 20’, 30’ thì ta tiến hành thuần nhiệt độ nước lên nhiệt độ phòng rồi lấy ra cho vào bể ấp trứng (thau). 3.2.4 Ương cá từ bột lên giống Bể ương: Gồm có 4 bể có thể tích 2,5 m3 (Bể được vệ sinh trước khi sử dụng). 15
Hình 5: Hệ thống bể ương Khi ấp khoảng 12h và quan sát phôi ta thấy phôi nằm ở giai đoạn cuối phôi vị thì tính tỷ lệ thụ tinh cho từng nghiệm thức, sau 26h tính tỷ lệ nở. Trứng sẽ nở sau khi ấp khoảng 24-26h, thu cá bột ở từng nghiệm thức sang thau chứa nước khác sạch hơn nhằm nâng cao tỷ lệ sống của cá bột. 3.2.5 Bố trí cá bột Khi cá nở được 1 ngày thì ta bố trí cá bột vào bể ương được chuẩn bị sẵn, mật độ bố trí ban đầu 1300 cá bột/bể. Cá được bố trí vào sáng sớm. 3.2.6 Cho ăn và chăm sóc Trong 2 ngày đầu cho ăn trứng nước với mật độ vừa phải (bổ sung thêm trứng nước nếu cần). Những ngày còn lại cho ăn trùng chỉ, mỗi ngày cho cá ăn 4 lần, và thả thêm giá thể (chùm dây nilon) vào bể làm nơi trú ẩn cho cá vào ban ngày. Sau khi ương được 25 ngày thì bắt đầu tập cho cá ăn thức ăn chế biến với hàm lượng đạm 30%. Trong quá trình ương cơ bản không thay nước, khi thấy đáy bể dơ thì tiến hành syphon và cấp thêm nước vào. 16
3.2.7 Các chỉ tiêu theo dõi Theo dõi các chỉ tiêu môi trường, phương pháp phân tích được thể hiện ở Bảng 1 Bảng 1: Chu kỳ và phép phân tích các yếu tố môi trường Thủy lý hóa Chu kỳ theo dõi Phương pháp Nhiệt độ (OC) 2 lần/ngày Nhiệt kế pH 2 lần/tháng Máy đo Hanna DO (mg/L) 2 lần/tháng Test (Germany) NO2- (mg/L) 2 lần/tháng Test (Germany) NO3- (mg/L) 2 lần/tháng Test (Germany) NH4+/NH3 (mg/L) 2 lần/tháng Test (Germany) Theo dõi tốc độ tăng trưởng của cá: 2 lần/tháng, mỗi bể lấy 30 con. Dùng phương pháp khối lượng: Sử dụng cân 2 số lẻ để xác định khối lượng của cá ở các thời điểm khác nhau, dùng thước nhựa để đo chiều dài cá, sau đó trừ đi khối lượng và chiều dài ban đầu, xác định được tốc độ tăng trưởng theo thời gian. Áp dụng các công thức sau: ln(Wt2)-ln(Wt1) Tốc độ tăng trưởng khối lượng tương đối (%/ngày) = t2-t1 ln(Lt2)-ln(Lt1) Tốc độ tăng trưởng chiều dài tương đối (%/ngày) = t2-t1 Wt2-Wt1 Tốc độ tăng trưởng khối lượng tuyệt đối (g/ngày) = t2-t1 Lt2-Lt1 Tốc độ tăng trưởng chiều dài tuyệt đối (mm/ngày) = t2-t1 Số cá thu hoạch Tỷ lệ sống (%) = * 100 Số cá bột thả ban đầu Trong đó: Wt1, Lt1: Khối lượng và chiều dài cá tại thời điểm t1 Wt2, Lt2: Khối lượng và chiều dài cá tại thời điểm t2 17
3.2.8 Xác định tỷ lệ đa bội Liên hệ với sự gia tăng mức độ đa bội của sinh vật là sự gia cân đối của kích thước tế bào máu (Swarup (1959b); Purdom (1972), về số lượng nhiễm sắc thể và DNA, tất cả các đặc điểm này thường được sử dụng để phân biệt cơ thể cá đa bội hay lưỡng bội. Thể tích nhân hồng cầu được dùng để đánh giá lên mức độ đa bội ở cá (Allen and Stanley (1978, 1979); Thorgaard and Gall (1979); Wolters et al. (1982b); Beck and Biggers, (1983). Bên cạnh đó thì mật độ tế bào máu cũng được sử dụng để nhận dạng cá thể đa bội (Johnstone, 1985). Trong nghiên cứu ở đây, ta dựa vào kích cỡ và mật độ tế bào hồng cầu để xác định tỷ lệ cá thể đa bội xuất hiện trong các nghiệm thức sốc nhiệt. Phương pháp kiểm tra đa bội Do cá thể đa bội lớn nhanh hơn cá thể lưỡng bội, nên một cách đơn giản là so sánh tốc độ tăng trưởng giữa cá thể lưỡng bội và cá thể đa bội. từ đó ta có thể xác định được tỷ lệ đa bội xuất hiện trong từng nghiệm thức sốc nhiệt (Thorgaard, 1983). Nhuộm tế bào máu bằng dung dịch Natt & Herrick , để quan sát và đo kích thước tế bào hồng cầu cá. Dựa vào sự khác biệt về kích thước và số lượng của tế bào hồng cầu trong mẩu quan sát và xác định được tỷ lệ cá thể đa bội xuất hiện trong các nghiệm thức có sốc nhiệt (Purdom, 1972). Phương pháp thực hiện Pha dung dịch Natt & Herrick gồm NaCl (3,88g), Na 2 SO4 (2,5g), Na 2 HPO4 .12H2 O (2,91g), KH 2 PO4 (0,25g), Methyl violet 2B (0,1g), Formalin solution (7,5mL). Tất cả các hóa chất trên được cân bằng cân 2 số lẻ và cho vào bình tam giác thủy tinh 1L, sau đó cho vào 1L nước cất, lắc đều để yên trong bóng tối. Sau 24h lấy ra lọc qua lọc giấy có mắc 125 µm, bảo quản ở 6 oC và được che tối trong túi nylon đen. Trước khi tiến hành lấy mẫu máu cá, dùng bơm tiêm 1mL lấy 1990 µL dung dịch thuốc nhuộm cho vào lọ thủy tinh (3mL) và lấy 10 µL máu cá cho vào, vị trí lấy máu là nằm ở tỉnh mạch đuôi của cá. Mỗi nghiệm thức lấy 30 con cá, khi lấy máu cá cho vào lọ chứa thuốc nhuộm lắc đều, trên nắp mỗi lọ đựng mẫu đều được đánh số thứ 18
tự phân biệt cho từng nghiệm thức. Mỗi cá thể khi lấy máu đều được cân, đo chiều dài. A B Hình 6: Chuẩn bị mẫu thuốc (A) và lấy máu cá (B) Nghiên cứu kích thước tế bào hồng cầu cá bằng cách đo đường kính lớn và đường kính nhỏ của hồng cầu. Lấy 1 giọt mẫu máu cho lên lame, đậy lamel lại sau cho không có bọt khí, quan sát và đo bằng kính hiển vi có trắc vi thị kính ở độ phóng đại 40X. Sau đó ta đặt trắc vi vật kính vào đo để xác định chiều dài mỗi vạch của trắc vi vật kính, từ đó xác định được chiều dài của đường kính lớn và đường kính nhỏ của tế bào hồng cầu. Tương tự cho việc xác định số lượng tế bào hồng cầu cá có trong một đơn vị thể tích, cho một ít mẫu máu lên vùng đếm của buồng đếm hồng cầu và quan sát ở vật kính 40X, ta đếm số lượng tế bào hồng cầu có được trong 4 ô ở 4 gốc và một ô ở trung tâm. Công thức tính mật độ hồng cầu H=(A*200)/80*0,00025 mm 3 hay H=A*10 4 tế bào/mL Với A: tổng số hồng cầu đếm được trong 5 ô Công thức tính diện tích hồng cầu S=a*b*  / 4 a: đường kính lớn (µm) b: đường kính nhỏ (µm) 19
Công thức tính tỷ lệ cá đa bội Tỷ lệ đa bội (%) = Số cá thể đa bội * 100 Số cá thể quan sát 3.3. Xử lý số liệu Số liệu về kích thích sinh sản, biến động môi trường và đa bội được xử lý bằng phần mềm Excel 2007 và SPSS để kiểm định sự khác biệt về tăng trưởng và tỷ lệ sống giữa cá trê vàng đa bội (3n) và cá trê vàng bình thường (2n). 20