Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 2

Chia sẻ: Nguyen Uyen | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

Thêm vào BST

Báo xấu

82
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phân tích thành phần acid béo 1. 5mg tế bào khô + dung dịch kiềm (R1) 1ml, vortex 5- 10 sec, giữ ở 100oC trong 5min, vortex 5-10 sec, giữ tiếp ở 100oC trong 25min, để nguội xuống nhiệt độ phòng, có thể đặt trực tiếp dưới vòi nước sau khi hạ xuống 80oC 2. Thêm dung dịch methyl hóa (R2): 2ml, giữ ở 80oC trong 10min, để nguội xuống nhiệt độ phòng. Quá trình này thấy xuất hiện khói trắng 3. Thêm dung dịch tách (R3) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong10min, loại bỏ lớp dưới...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 2

Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 2 Phân tích thành phần acid béo 5mg tế bào khô + dung dịch kiềm (R1) 1ml, vortex 5- 10 sec, giữ ở 1. 100oC trong 5min, vortex 5-10 sec, giữ tiếp ở 100oC trong 25min, để nguội xuống nhiệt độ phòng, có thể đặt trực tiếp dưới vòi nước sau khi hạ xuống 80oC Thêm dung dịch methyl hóa (R2): 2ml, giữ ở 80oC trong 10min, để 2. nguội xuống nhiệt độ phòng. Quá trình này thấy xuất hiện khói trắng Thêm dung dịch tách (R3) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng 3. trong10min, loại bỏ lớp dưới (lớp nước) Thêm dịch rửa (R4) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5 min, ly 4. tâm 2000rpm trong 3min, chuyển 2/3 lớp trên (lớp dung môi) sang ống đựng mẫu (mẫu thường không màu) Nếu lớp phía trên chưa trong, thêm 1-3 giọt dung dịch R5, đảo lộn 5. đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5min, ly tâm lại lần nữa.
Chú ý: Các bước cần thực hiện liên tục, trước khi tiến hành cần chuẩn bị heatblock 100 and 80oC. R1: NaOH 15g, Methanol (HPLC grade) 50 mg, MQ 50ml R2: 6N HCl 65ml, Methanol (HPLC grade) 55ml, pH 1.5 R3: n-hexane (HPLC grade or n-hexane 1000) 50ml, methyl-ter-butyl ethel (HPLC grade) 50ml R4: NaOH 10.8g, MQ 900ml R5: 100ml MQ + 40g NaCl 6. Mẫu được phân tích bằng sắc ký khí (hệ thống MIDI)
Phân tích thành phần phospholipid 100mg tế bào khô + dung dịch chlorofolm: methanol: 0,3% NaCl 1. (50:100:40) = 2ml: 4ml:1,6ml . Trộn bằng khuấy từ trong 4 giờ. Chuyển sang ống ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5 phút. Lấy dịch trên. Thêm 1,75ml NaCl 0.3% và 1,75ml chloroform. Lắc 2. đều, ly tâm 5000 rpm trong 5 phút. Loại lớp trên cùng và lớp giữa. Làm khô bằng Nitơ lỏng. Nếu ngừng công việc, giữ ở -20oC. 3. Hòa tan bằng 100 µl ethanol. 4. Chấm mẫu lên 4 bản HP-TLC (high performance) 5. Dung môi chạy TLC chiều 1: 6. Chloroform: Methanol: Water = 65:25:4 Dung môi chạy TLC chiều 2: Trước khi chạy chiều 2, chấm Standard Chloroform: Acetic acid: Methanol: Water = 80:18:12:5 Nhận biết các loại phospholipid: 7.
Bản 1: Nhận biết các glycolipit: Chuẩn bị thuốc thử anisaldehyde: Acetic acid 1ml p-anisaldehyde 5ml H2SO4 5ml Ethanol 90ml Phun thuốc thử, giữ ở 110oC trong 15 phút Các phospholipid chứa đường như GlcNU chứa NPG và PIMs, glycolipit sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu vàng xanh. Bản 2: Nhận biết các amino lipit Phun ninhydrin lên bản TLC. Giữ ở 120oC trong vài phút. - Các phospholipid chứa nhóm amino được nhận biết dưới dạng các - chấm màu tím đỏ như PE, OH-PE, lyso-PE, PME, PS, NPG Nhận biết tất cả phospholipid bằng thuốc thử Dittmer Lester
- Chuẩn bị thuốc thử Ditmer Lester: Sol I 25N H2SO4 100mg MoO3 4,011g Hòa tan bằng cách đun ở 90oC đến khi dung dịch trở nên trong SolII Iot 50mg Mo 0,178g Đun trong 15 phút, để nguội, lọc Trước khi dùng, trộn Sol I + Sol II (1:1) + 1 V nước rồi pha loãng 3 lần. Màu của dung dịch sẽ chuyển từ vàng sang xanh Phun thuốc thử lên bản TLC, tất cả các phospholipid sẽ hiện lên - Bản 3: Nhận biết các choline lipit Thuốc thử Dragendorff: - Sol A: Basic bismuth nitrate [Bi(OH)2NO3] 1,7g
Acetic acid 20ml Water 80ml Sol B: KI 10g Nước 25ml Trước khi dùng, trộn 20ml Sol A và 5ml Sol B vào 70ml nước. PC và sphingomyelin được nhận biết bằng chấm vàng da cam - Bản 4: Giữ bản TLC trong hộp chứa tinh thể Iot trong 3-5 phút. Các chấm - vàng và nâu vàng sẽ xuất hiện. Phản ứng dùng để nhận biết tất cả các loại phospholipid. Những chấm vàng sẽ dần dần biến mất, có thể sử dụng bản này - cho thí nghiệm tiếp theo. Nhận biết các glycolipit chứa nhóm OH Thuốc thử Periodic acid: 1% natri metaperiodic -
Phun thuốc tử periodic acid lên bản TLC. Giữ trong 5-10 phút để - nhóm glycol tách khỏi lipit bởi oxi hóa Phun nước (loại muối periodate) - Đặt bản TLC vào bể chứa acid sulfuric cho đến khi các chấm vàng - nhận biết bằng Iot biến mất. Phun thuốc thử Schiff - PI hiện lên màu vàng, PG hiện lên màu đỏ đến tím, Các lipit chứa - đường hiện lên màu xanh Phân tích thành phần G+C trong ADN 25µl ADN (2-25µg), giữ ở 60oC trong 1 giờ. Giữ ở 100oC trong 2 1. phút. Làm lạnh lập tức trong chậu đá, spin down. Mẫu ADN 25µl + đệm acetate (40mM, pH 5,3) chứa 2mM ZnSO4 2. 25µl + dung dịch nuclease P1 (20U/ml) 25µl. Spin down. Giữ ở 37oC trong 1 giờ.
3. Glycine buffer (0,1 M, pH 10,4) 25 µl + alkaline phosphatase 2µl (0.35U/µl). Spin down. Giữ ở 37oC trong 1-2 giờ. Sử dụng làm mẫu chạy HPLC Điều kiện HPLC: 4. Cột Cosmosil5 C18 - Nhiệt độ 35oC - - Dung môi: 0,2M ammonium phosphat: acetonenitril (40:1) Tốc độ dòng chảy: 1 ml/min - Bước sóng: 275nm - Phương pháp tách ADN xạ khuẩn Nuôi cấy lắc trong 5 ml môi trường dịch thể YG ở nhiệt độ 28oC - Lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy, ly tâm với tốc độ 16000g trong 5 phút ở - 4oC, thu sinh khối
Rửa bằng TE - Nghiền mẫu - Thêm 500 µl EDTA 5mM (pH 8,0), trộn đều - - Thêm 50 µl lysozym (0,75 mg trong 1 ml Tris-HCl 10mM pH 8,0), trộn, giữ ở 37oC trong 1 giờ - Thêm 50 µl SDS 20%, 50 µl proteinase K (4 mg trong 1 ml Tris- HCl 50mM pH 7,5), trộn, giữ ở 55oC trong 30 phút Thêm 400 µl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn - đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4oC, thu lớp trên. Thực hiện 3 lần. Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều - Thu ADN bằng đũa thủy tinh - Rửa trong 500 µl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên - - Thêm 500 µl TE
Nếu sử dụng mẫu ADN để tiến hành thí nghiệm lai ADN, cần làm tiếp các bước sau: - Thêm 50 µl RNase A (1 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), 0,5 µl RNase T1, giữ ở 37oC trong 20 phút Thêm 50 µl proteinase K, giữ ở 37oC trong 1 giờ - Thêm 400 µl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn - đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4oC, thu lớp trên. Thực hiện 3-4 lần. Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều - Thu ADN bằng đũa thủy tinh - Rửa trong 500 µl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên - - Thêm 100-200 µl TE Các số liệu trên được lấy từ sách Bergey’s manual systematic of bacteriology và sách Identification manual of actinomycetes.
Tài liệu tham khảo: 1. Miyadoh S. (ed.). 1997. Atlas of actinomycetes. Asakura Publishing Co. Ltd, Japan. 2. Miyadoh S. (ed.). 2001. Identification manual of actinomycetes. Business Center for Academic Societies Japan. 3. Williams S. T.,M.E. Sharpe , J.G. Holt (ed.). 1989. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore, USA. Holt J.G, N.R.Krieg, P.H.A.Sneath, J.T.Staley, S.T.Williams.2000. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (9th edition). Lippincott Williams & Wilkins