Nghiên cứu khoa học " Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống "

Chia sẻ: Nguye Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

83
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv. Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Đặt vấn đề Trong số hàng nghìn cây gỗ rừng Việt Nam, có tới hàng trăm loài đang bị đe dọa ở các mức độ khác nhau, một số loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng mà nguyên nhân...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu khoa học " Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống "

Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2004. 464-468. Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv. Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Đặt vấn đề Trong số hàng nghìn cây gỗ rừng Việt Nam, có tới hàng trăm loài đang bị đe dọa ở các mức độ khác nhau, một số loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng mà nguyên nhân chủ yếu vẫn là hậu quả của việc tàn phá môi trường sống và thu hẹp diện tích rừng tự nhiên. Cây Lim Xanh Erythrophleum fordii Oliv. còn gọi là cây Lim, họ phụ Vang Caesalpinioideae, họ Đậu Leguminosae. Lim xanh là loài cây gỗ quý, nổi tiếng từ lâu đời, có giá trị kinh tế cao và hiện vẫn đang được ưa chuộng trên thị trường [1]. Lim xanh có phân bố trải dài suốt từ Quảng Ninh đến Quảng Bình trong đó có các xuất xứ nổi tiếng như Cầu Hai, Chân Mộng (Vĩnh Phú), Ba Vì, Sơn Tây (Hà Tây), Mai Sưu (Hà Bắc) hoặc Hữu Lũng (Lạng Sơn) song đến nay khó tìm thấy những quần thụ lim rộng lớn mà chỉ còn một số cá thể rải rác [12]. Hiện nay Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã sưu tầm và bảo tồn cây Lim xanh từ nhiều xuất xứ khác nhau. Câu hỏi được đặt ra là liệu các xuất xứ này có trùng lặp nhau hay không?, chúng ta có cần thiết phải bảo tồn nguồn gen Lim xanh ở tất cả các xuất xứ hay không? Những năm gần đây các chỉ thị phân tử được dùng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại ở nhiều loại cây. Trong số đó, chỉ thị RAPD được sử dụng rộng rãi nhất, bởi kỹ thuật này đơn giản và ít tốn kém. RAPD đã được sử dụng để xác định giống [4,5] và mối quan hệ phát sinh loài ở Citrus [6]. Việc sử dụng chỉ thị ADN lục lạp (cpDNA) trong phân tích phát sinh loài đã mang lại những kết quả rất lý thú bởi tính bảo thủ của nó trong thiên nhiên, tần số đột biến thấp hơn ADN nhân và có kích thước nhỏ. Sự đa hình của ADN lục lạp được sử dụng trong nhiều nghiên cứu xác định mối quan hệ địa lý hoặc đa dạng di truyền các loài [3,10]. Phản ứng PCR để nhân các vùng không mã hoá của cpDNA với các mồi lục lạp phổ biến, sau đó sản phẩm PCR được cắt bằng các enzym cắt hạn chế để tìm đa hình đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài ở Citrus . Trong bài này, chúng tôi trình bày những kết quả về sử dụng chỉ RAPD và cpDNA trong nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ cây Lim xanh nhằm đưa ra khuyến cáo về việc bảo tồn nguồn gen đối với loài cây quan trọng này. Nguyên liệu và phương pháp Nguyên liệu 1
Chín mẫu xuất xứ Lim xanh (Thanh Hoá, Ba Vì, Hà Bắc, Đông Giang, Lang Hanh, Nghệ An, Cầu Hai, Tam Đảo, Quảng Ninh) do Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp. Hoá chất chuẩn được mua từ các hãng Sigma và Amersham (Mỹ). Các mồi RAPD (C1, C7, C9, B1, B4, B9) được mua từ hãng Operon - Mỹ. Các mồi lục lạp (cpDNA) trnH-trnK, PsbC-trnS được mua từ hãng Fermentas theo trình tự đã công bố [9] . Phương pháp Nghiên cứu đa dạng loài. Tách chiết ADN genome và kỹ thuật RAPD được tiến hành như đã công bố [2]. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực tím và chụp ảnh bằng hệ thống Thermal Imaging System FTI-500, Pharmacia Biotech. Kỹ thuật PCR với các mồi lục lạp. Phản ứng PCR của ADN genome các xuất xứ Lim xanh với hai cặp mồi cpDNA (20 nucleotide) được tiến hành với tổng thể tích là 25 μl/mẫu gồm: ADN tổng số (12 ng), dNTP (0,2 mM), mồi cpDNA (10 ng), MgCl2 (1,5 mM), Taq polymerase (2 đơn vị) và 2,5 μl đệm 10xPCR. Chu trình nhiệt: 920C 2 phút; 10 chu kỳ gồm các bước: 920C 5 giây, 550C 15 giây, 720C 1 phút; 20 chu kỳ gồm các bước sau: 920C 5 giây, 550C 15 giây, 720C 1 phút 10 giây; cuối cùng kéo dài ở 720C 10 phút [7,8]. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực tím. Phân đoạn ADN duy nhất nhận được từ sản phẩm PCR với các mồi lục lạp được cắt bằng các enzym cắt hạn chế Tag I, Hha I, Hinf I và sau đó điện di trên gel agarose 1,5 %, quan sát dưới đèn cực tím và chụp ảnh. Phân tích số liệu Các số liệu được đưa vào xử lý bằng chương trình NTSYS pc (Rohlf F. J, 1993) [11] để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu. Sau đó các mẫu nghiên cứu được xử lý tiếp trong NTSYS - SIMQUAL và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền. Kết quả nghiên cứu và thảo luận Phân tích đa hình di truyền ở các xuất xứ Lim xanh bằng các chỉ thị RAPD Trung bình mỗi mồi cho 5,2 đến 9,7 phân đoạn (hình 1). Tổng số 428 băng đa hình/428 băng nhận được từ các phản ứng PCR ADN genome từ 9 xuất xứ với 6 mồi RAPD. Như vậy là tỷ lệ đa hình đạt 100%. Số phân đoạn đa hình ở từng mồi là rất cao, đạt 47-87 phân đoạn. Mồi C7 cho số phân đoạn đa hình thấp nhất cũng đạt 47 phân đoạn ở 9 xuất xứ, mồi C1 và B1 cho số phân đoạn đa hình cao nhất, 87 phân đoạn. ở 9 xuất xứ Lim xanh, số phân đoạn trung bình từ 5 đến 11. Xuất xứ Nghệ An cho số phân đoạn trung bình thấp nhất (5 phân đoạn), xuất xứ Hà Bắc cho số phân đoạn trung bình cao nhất (11 phân đoạn). Cả chín xuất xứ đều cho số phân đoạn đa hình bằng số phân đoạn đếm được, nghĩa là tỷ lệ phân đoạn đa hình ở 9 xuất xứ Lim đều đạt 100%. Như vậy, bước đầu dựa trên các chỉ thị RAPD chúng tôi có nhận xét là các xuất xứ Lim xanh rất đa dạng về mặt di truyền. Bảng 1. Tỷ lệ đa hình của 9 xuất xứ Lim xanh với chỉ thị RAPD 2
Ký Xuất xứ Tổng số băng Tổng số băng Số băng tb ở Tỷ lệ băng đa hiệu đếm được đa hình mỗi xuất xứ hình(%) 1 Thanh Hoá 38 38 7,6 100 2 Ba Vì 41 41 8,2 100 3 Hà Bắc 53 53 10,6 100 4 Đông Giang 31 31 6,2 100 5 Lang Hanh 46 46 9,2 100 6 Nghệ An 25 25 5 100 7 Cầu Hai 44 44 8,8 100 8 Tam Đảo 41 41 8,2 100 9 Quảng Ninh 24 24 4,8 100 Tổng 428 428 Phân tích sự đa hình di truyền ở các xuất xứ Lim bằng chỉ thị ADN lục lạp Kết quả PCR-cpDNA với mỗi mồi lục lạp đều nhận được một phân đoạn ADN duy nhất có kích thước mong muốn. Sản phẩm với cặp mồi trnH-trnK cho phân đoạn ADN có độ dài 1750 bp (hình 2a) còn với cặp mồi psbC-trnS thì cho phân đoạn có kích thước 1600 bp. Sản phẩm PCR-cpDNA của cặp mồi trnH-trnK với 9 xuất cây Lim xanh được cắt bởi các enzym cắt hạn chế Tag I, Hha I, Hinf I với mục đích tìm ra các vị trí cắt của các enzym này ở các xuất xứ khác nhau. Từ đó có thể nhận được đa hình giữa các xuất xứ. Kết quả minh họa ở hình 2b. Từ kết quả ở các hình ảnh thu được cho thấy sau khi cắt với 3 enzym đã thu được 72 phân đoạn từ sản phẩm cắt, trong đó có 54 phân đoạn đa hình. Enzym Tag I cắt gen lục lạp của một xuất xứ duy nhất đó là Quảng Ninh và ở một vị trí cắt duy nhất (1600 bp). Enzym Hha I cắt gen lục lạp của các xuất xứ ở 4 vị trí (thứ tự như sau vị trí 1: 1500 bp, vị trí 2: 1000 bp, vị trí 3: 700 bp, vị trí 4: 600 bp). Các xuất xứ Thanh Hoá, Hà Bắc, Lang Hanh, Cầu Hai, Tam Đảo có vị trí cắt như nhau, đó là vị trí cắt 2, 3, 4. ở xuất xứ Ba Vì, Đông Giang, enzym Hha I cắt gen lục lạp vị trí 2 và 4; còn xuất xứ Nghệ An và Quảng Ninh, enzym này cắt ở vị trí 1, 2, 3. Enzym Hinf I cắt gen lục lạp của các xuất xứ ở 6 vị trí (vị trí 1: 700 bp, vị trí 2: 600 bp, vị trí 3: 500 bp, vị trí 4: 200 bp, vị trí 5: 100 bp, vị trí 6: 80 bp). Enzym này cắt gen lục lạp các xuất xứ Ba Vì, Đông Giang ở cả 6 vị trí nêu trên. Các xuất xứ Thanh Hoá, Hà Bắc, Lang Hanh, Cầu Hai, Tam Đảo, enzym này cắt ở 5 vị trí 1, 2, 3, 4, 5. Tuy nhiên, enzym Hinf I không cắt bất kỳ một vị trí nào trên gen lục lạp của 2 xuất xứ Quảng Ninh và Nghệ An. Như vậy, các kết quả phân tích chỉ thị cpDNA cho thấy các xuất xứ Lim xanh rất khác nhau về mặt di truyền tế bào chất. 3.3. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ cây Lim xanh Các phân đoạn đa hình dựa trên phân tích RAPD và cpDNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng. Nếu có thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số liệu này được xử lý bằng chương trình NTSYS-pc để phân tích mối tương quan giữa các đối tượng nghiên cứu. Dựa trên ma trận số liệu được thiết lập, chúng tôi tiến hành xác định mối tương quan di truyền giữa các xuất xứ Lim xanh. 3
Dựa vào các hệ số giống nhau về di truyền Jaccard thu được, một sơ đồ về quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Lim xanh được thiết lập (hình 3). Từ sơ đồ nhận được chúng tôi thấy rằng quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Lim là rất xa nhau. 100% các xuất xứ có hệ số di truyền nhỏ hơn 0,5. Hai xuất xứ Lang Hanh và Cầu Hai được coi là gần nhau nhất về quan hệ di truyền (tuy nhiên hệ số Jaccard cũng chỉ đạt 0,43). Hai xuất xứ Quảng Ninh và Nghệ An có mối quan hệ di truyền xa nhất so với các xuất xứ còn lại (hệ số Jaccard là 0,17). Kết luận Trong tổng số 428 phân đoạn ADN được nhân ngẫu nhiên trong phản ứng PCR- RAPD sử dụng 6 mồi với 9 xuất xứ cây Lim xanh cho 100% phân đoạn đa hình. Điều này cho thấy các mồi RAPD được nghiên cứu cho sự đa hình cao ở các xuất xứ Lim xanh. Phân tích các vị trí cắt đặc hiệu của các enzym cắt hạn chế trong sản phẩm PCR với các mồi lục lạp cũng cho thấy chỉ thị ADN lục lạp cho mức độ đa hình cao. Các phân tích đa dạng di truyền dựa trên hệ số di truyền giống nhau Jaccard giữa các xuất xứ cây Lim xanh bằng các số liệu về chỉ thị RAPD và ADN lục lạp đã cho thấy các xuất xứ này rất đa dạng về di truyền. Từ các kết luận trên, chúng tôi đi đến khuyến cáo về sự cần thiết phải bảo tồn vốn gen Lim xanh ở tất cả các xuất xứ vì các xuất xứ được nghiên cứu rất xa nhau về di truyền. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999. Một số loài cây bị đe dọa ở Việt Nam. Nxb Nông nghiệp Hà nội. 147 tr. 2. Nguyễn Đức Thành, 1999. Phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng phân tử ở lúa. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội: 1205-1215 3. Demesure B., Sodzi N., Petit RJ., 1995. A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Mol Ecol 4:35-38. 4. Deng ZN. et al, 1995. Identification of in vivo and in vitro lemon mutants by RAPD markers. J Hortic Sci, 70:117-125. 5. Deng ZN. et al, 1995. Parentage determination of some citrus hybrids by molecular markers. Proc Int Soc Citricul 2:849-854. 6. Federici CT. et al, 1998. Phylogenetic relationship within the genus Citrus (Rutaceae) and related genera as revealed by RFLP and RAPD analysis. Theor Appl Genet, 96:812-822. 7. Gielly L., Taberlet P., 1994. The use of chloroplast DNA to resolve plant phylogenies: non-coding vs RbcL sequences. Mol Biol Evol, 11: 769-777. 8. Mohanty A. et al, 2001. Chloroplast DNA study in wild population and some cultivars of Prunus avium L.. Theor Appl Genet, 103: 112-117. 4
9. Nicolosi E. et al, 2000. Citrus phylogeny and genetic origin of important species as investigated by molecular markers. Theor Appl Genet, 100: 1155- 1166. 10. Olmstead RG., Palmer JD., 1994. Chloroplast DNA systematics: a review of methods and data analysis. Am J Bot 81: 1205-1224. 11. Rohlf FJ., 1993. NTSYS-pc Numerrical taxonomy and multivariate system, Version 1.80. Applied Biostatitics Inc., New York. 12. Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của Chương trình NCCB trong KHTN. Chúng tôi xin cám ơn GS. TSKH. Lê Xuân Tú đã đọc và góp ý cho bản thảo. Summary The use of RAPD and chloroplast DNA markers in the study of genetic relationship of Erythrophleum fordii Oliv. From different origins Quach Thi Lien, Nguyen Đuc Thanh Institute of Biotechnology –VAST Nguyen Hoang Nghia Forest Science Institute of Viet Nam Genetic relationship of nine Erythrophleum fordii Oliv. origins were investigated using RAPD and cpDNA markers. The RAPD analysis using random amplified polymorphic primers reveled 428 Polymorphic bands. All the bands were polymorphic among the investigated origins. Non-coding regions of cpDNA were amplified using chloroplast universal primers trnH-trnK and PsbC-trnS, and polymorphisms were subsequently generated by digestion of the PCR products with TaqI, HhaI and HinfI endonucleases. Eleven restriction sites were detected and 54 polymorphic bands of the total number 72 bands were obtained. The coefficients of genetic similarity between the investigated origins based on RAPD and cpDNA data were rather low (from 0,17 to 0,43) showing the genetic divergent of the E. fordii origins. Our results indicated an necessary to protect all of the E. fordii investigated. 5