intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh giữa các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam bằng phương pháp MIG-seq

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST
Báo xấu
2
lượt xem 1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này nhằm xây dựng mối quan hệ phát sinh giữa các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam bằng phương pháp MIG-seq trên nền tảng giải trình tự gene thế hệ mới. Tổng cộng 29 mẫu thuộc các loài Panax ở Việt Nam và 01 mẫu thuộc loài Panax ginseng (làm nhóm ngoài) đã được sử dụng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh giữa các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam bằng phương pháp MIG-seq

  1. TNU Journal of Science and Technology 230(01): 423 - 431 PHYLOGENETIC RELATIOSHIP OF PANAX SPECIES IN VIENAM USING MIG-SEQ METHOD Hoang Thi Binh1, Le Minh Tam2, Pham Quang Tuyen3, Trinh Ngoc Bon3, Vu Quoc Luan4, Nguyen Van Ngoc1* 1DalatUniversity, 2Vaccine Company Limited of Dalat Pasteur, 3Silviculture Research Institute - Forest Science Institute of Vietnam, 4Tay Nguyen Institute for Scientific Research - Vietnam Academy of Scientific and Technology ARTICLE INFO ABSTRACT Received: 04/6/2024 This study aim to examine the phylogenetic relationship between Panax species (Araliaceae) of Vietnam using MIG-seq method based on Next Revised: 17/12/2024 Generation Sequencing platform. A total of 29 Vietnamese Panax Published: 18/12/2024 samples, including five species, two varieties, and one sample of Panax ginseng as an outgroup, were utilized. The MIG-seq method generated KEYWORDS a dataset of 6821 SNPs, which was used to reconstruct a phylogenetic tree using maximum likelihood. The tree demonstrated the phylogenetic Araliaceae relationship between Panax species with high resolution and strongly Classification supported monophyly through bootstrap values. The results revealed that ISSR the Panax species of Vietnam comprise two main sister groups. The first group includes P. stipuleanatus and P. bipinnatifidus, while the second Phylogeny group comprises three species (P. pseudoginseng, Panax sp., P. Sequencing vietnamensis) and two varieties (P. vietnamensis var. fuscidicus and P. vietnamensis var. langbianensis). These research findings provide a foundation for the application of the MIG-seq method in studying phylogenetic relationships of plant in Vietnam. NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ PHÁT SINH GIỮA CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX Ở VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MIG-SEQ Hoàng Thị Bình1, Lê Minh Tâm2, Phạm Quang Tuyến3, Trịnh Ngọc Bon3, Vũ Quốc Luận4, Nguyễn Văn Ngọc1* 1 Trường Đại học Đà Lạt, 2Công ty TNHH Một thành viên Vắc Xin Pasteur Đà Lạt 3Viện Nghiên cứu Lâm sinh - Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam 4Viện Khoa học Tây Nguyên - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam THÔNG TIN BÀI BÁO TÓM TẮT Ngày nhận bài: 04/6/2024 Nghiên cứu này nhằm xây dựng mối quan hệ phát sinh giữa các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam bằng phương pháp MIG-seq trên nền tảng Ngày hoàn thiện: 17/12/2024 giải trình tự gene thế hệ mới. Tổng cộng 29 mẫu thuộc các loài Panax Ngày đăng: 18/12/2024 ở Việt Nam và 01 mẫu thuộc loài Panax ginseng (làm nhóm ngoài) đã được sử dụng. Nghiên cứu đã thu được tổng cộng 6821 điểm đa hình TỪ KHÓA đơn nucleotide (SNPs) làm chỉ thị phân tử để xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp maximum likelihood. Cây biểu thị mối Họ Nhân sâm quan hệ phát sinh giữa các loài Panax ở Việt Nam có độ phân giải cao, Phân loại với các nhóm đơn hình được hỗ trợ mạnh mẽ bởi các chỉ số bootstrap. Kết quả nghiên cứu cho thấy, chi Panax ở Việt Nam gồm 2 nhóm có ISSR quan hệ gần gũi, nhóm thứ nhất gồm các loài P. stipuleanatus và P. Phát sinh loài bipinnatifidus, nhóm thứ 2 gồm các loài P. pseudoginseng, Panax sp., Giải trình tự P. vietnamensis và 02 thứ P. vietnamensis var. fuscidicus và P. vietnamensis var. langbianensis. Kết quả nghiên cứu làm cơ sở cho việc ứng dụng phương pháp MIG-seq trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh cho các đối tượng thực vật ở Việt Nam. DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10537 * Corresponding author. Email: ngocnv@dlu.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 423 Email: jst@tnu.edu.vn
  2. TNU Journal of Science and Technology 230(01): 423 - 431 1. Giới thiệu Chi Panax thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), là một chi thực vật gồm nhiều loài có giá trị dược liệu cao [1], [2]. Các loài thuộc chi này phân bố chủ yếu ở ba khu vực chính là Đông Bắc Á, Tây Trung Quốc và Bắc Mỹ [3]. Ở Việt Nam, năm 1969, Grushvitzky và cộng sự (1969) đã ghi nhận loài Panax bipinnatifidus Seem. trong họ Araliaceae ở miền Bắc Việt Nam [4]. Sau đó, Phạm Hoàng Hộ đã phát hiện loài P. schinseng Nees var. japonicum Mak. (Sâm Nhật Bản) có phân bố tại vùng núi Langbiang (năm 1970), và ba loài ở vùng núi phía Bắc và Tây Nguyên Việt Nam (năm 1993) là: P. bipinnatifidus Seem, P. japonica (Nees) Meyer, và P. pseudoginseng Wall (Tam thất Bắc) [5]. Năm 1985, Sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis) được Hà Thị Dung và Grushvitzky phát hiện và công bố loài mới [6]. Từ năm 2000, nhiều nghiên cứu về thành phần loài chi Panax đã được thực hiện. Theo Nguyễn Tập (2005), chi này ở Việt Nam có 5 loài, trong đó P. bipinnatifidus Seem, P. stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng (Tam thất hoang) và P. vietnamensis Ha et Grushv. (Sâm Ngọc Linh) là các loài bản địa, còn P. ginseng (sâm Hàn Quốc) và P. notoginseng (Tam thất) là loài nhập nội [7]. Năm 2013, Phan Kế Long và cộng sự đã ghi nhận một thứ sâm mới P. vietnamensis var. fuscidiscus tại Mường Tè, Lai Châu và đặt tên địa phương là sâm Lai Châu [8]. Các nghiên cứu sau đó đã phát hiện thêm nhiều loài và thứ mới, nâng tổng số loài Panax ở Việt Nam lên 6 loài và 3 thứ, bao gồm: Panax japonicus var. japonicus (Sâm Nhật Bản), P. japonicus var. bipinnatifidus (Sâm Vũ Diệp), P. stipuleanatus (Tam thất hoang), P. notoginseng (Tam thất), P. pseudoginseng (Tam thất Bắc), P. vietnamensis var. vietnamensis (Sâm Ngọc Linh), P. vietnamensis var. fuscidiscus (Sâm Lai Châu), P. vietnamensis var. langbianensis (Sâm Langbian) và P. zingiberensis (Tam thất gừng) [1]. Trong đó, Panax vietnamensis var. langbianensis (sâm Langbian) được Nông Văn Duy và cộng sự công bố vào năm 2016 [9]. Mối quan hệ phát sinh chủng loại và lịch sử tiến hóa của chi Panax đã được nghiên cứu bằng các mã vạch phân tử truyền thống phổ biến như ITS, 18SRNA, trnC-trnD, matK, rbcL hay psbK- psbL,… [10]-[13]. Ở Việt Nam, việc ứng dụng mã vạch phân tử trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh các loài thuộc chi Panax gần đây nhận được nhiều quan tâm. Nguyễn Thị Phương Trang và cộng sự đã sử dụng trình tự gen ITS-rDNA để phân tích lịch sử tiến hoá, mối quan hệ di truyền giữa sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis) và các loài khác thuộc chi Panax, cho thấy P. vietnamensis có quan hệ gần gũi với P. notoginseng mặc dù có sự sai khác 18 nucleotide [14]. Nhóm nghiên cứu của Phan Kế Long đã sử dụng trình tự ITS-rDNA và matK để nghiên cứu quan hệ phát sinh giữa các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu đã chỉ ra mối quan hệ gần gũi giữa sâm Lai Châu và sâm Ngọc Linh [15]. Nguyễn Thị Phương Trang cùng các đồng nghiệp đã sử dụng các vùng gen rbcL và rpoL để phân biệt các loài sâm Việt Nam [16], trong khi nhóm của Lê Thanh Hương đã khảo sát tiềm năng của 5 mã vạch DNA ứng dụng trong định loại các loài sâm ở Việt Nam, kết quả đã xác định ITS và psbA-trnH là chỉ thị đạt hiệu quả cao nhất [17]. Phạm Quang Tuyến và cộng sự cũng đã dùng trình tự ITS1-5.8S-ITS2 để nghiên cứu đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ tiến hóa của 24 mẫu sâm Lai Châu [18]. Nền tảng giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing: NGS) ra đời những năm 2000 đã giúp giảm 50.000 lần chi phí và có thể đọc trên toàn hệ gene (hàng tỉ cặp base) tăng từ 100 đến 1000 lần lưu lượng xử lý so với công nghệ trước đó của dự án giải mã hệ gen người. Dữ liệu lớn thu được từ các nền tảng giải trình tự gene thế hệ mới (Illumina, IonTorrent, PGM, SOLiD, 454,…) có thể sử dụng trong nghiên cứu lắp ráp, chú giải và lập bản đồ hệ gen (de novo assembly), phân tích đa hình đơn nucleotide (SNPs/InDel), lắp ráp, chú giải hệ phiên mã (de novo), nghiên cứu xác định hệ SNPs đặc trưng cho các loài hay các dòng giúp cho công tác định danh, phân loại, nghiên cứu mối quan hệ phát sinh,… Kỹ thuật “xác định đặc tính di truyền các đoạn trình tự đơn giản lặp lại (Inter Simple Sequence Repeats: ISSR) bằng giải trình tự gene” (Multiplexed ISSR genotyping by sequencing: MIG-seq) được phát triển bởi Suyama và Matsuki năm 2015 dựa trên nền tảng công nghệ giải trình tự gene http://jst.tnu.edu.vn 424 Email: jst@tnu.edu.vn
  3. TNU Journal of Science and Technology 230(01): 423 - 431 thế hệ mới [19]. MIG-seq đã được Suyama và cộng sự ứng dụng trong phân tích các biến dị di truyền theo các quy luật Mendel, di truyền quần thể, định danh các dòng, các cá thể và trong phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại,… [20]. Phương pháp giải trình tự gene MIG-seq cung cấp các chỉ thị SNPs từ các trình tự đọc tương đối ngắn trải đều trên toàn hệ gene, trái ngược với các đoạn DNA có bộ gene kéo dài liên tục. MIG-seq tương tự như RAD-seq [21], [22], tuy nhiên MIG- seq thực hiện một phản ứng PCR, không sử dụng enzyme cắt giới hạn và có thể ứng dụng rộng rãi cho nhiều loại mẫu hơn là kỹ thuật RAD-seq, kể cả mẫu bảo tàng và hoá thạch, thậm chí với chất lượng và số lượng DNA rất thấp [19]. Khác với các chỉ thị phân tử truyền thống, các mồi dùng trong MIG-seq có thể khuếch đại hiệu quả hàng nghìn vùng trên toàn bộ hệ gen kể cả trong điều kiện chưa có bất kỳ thông tin di truyền gì trước đó, và cho phép phát hiện hàng trăm cho đến hàng nghìn biến dị di truyền (SNPs, InDel,…). Ở Việt Nam, việc ứng dụng các phương pháp giải trình tự gene thế hệ mới để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh giữa các loài thuộc chi Panax còn hạn chế, đặc biệt chưa có nghiên cứu nào sử dụng phương pháp MIG-seq. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các chỉ thị SNPs có được từ việc ứng dụng phương pháp MIG-seq để nghiên cứu làm rõ mối quan hệ phát sinh giữa các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu bao gồm 30 mẫu lá được thu từ các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam. Các mẫu được Phạm Quang Tuyến và Trịnh Ngọc Bon, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam định danh ban đầu dựa vào các đặc điểm hình thái. Theo đó, vật liệu nghiên cứu bao gồm mẫu của các loài: sâm Ngọc Linh – P. vietnamensis (P01, P02), tam thất Bắc – P. pseudoginseng (P11, PB1, PB2, PB3), sâm Vũ Diệp – P. bipinnatifidus (PD1, PD2), sâm Lai Châu - P. vietnamensis var. fuscidiscus (P03, P04, PV1, PV2), tam thất hoang – P. stipuleanatus (PS1, PS2, PS3, PS4, TT41, TT41A, TT42, TT42A) và sâm Langbian - P. vietnamensis var. langbianensis (P10). Ngoài ra, trong nghiên cứu này có sử dụng 8 mẫu chưa được định danh, trong đó 4 mẫu (P06, P07, P08, P09) được thu từ Lai Châu và 4 mẫu (PT1G, PT2G, PT3G, PT3GA) thu từ Tuyên Quang. Mẫu sâm Hàn Quốc – P. ginseng (P05) thu tại vườn thực nghiệm khoa Sinh học, trường Đại học Đà Lạt được lựa chọn làm nhóm đối chứng (out group). Thông tin chi tiết được được mô tả tại Bảng 1. Bảng 1. Danh sách các mẫu sử dụng trong nghiên cứu STT Ký hiệu mẫu Tên khoa học Tên thông thường Địa điểm thu mẫu 1 P01 P. vietnamensis Sâm Ngọc Linh Kon Tum 2 P02 P. vietnamensis Sâm Ngọc Linh Kon Tum 3 P03 P. vietnamensis var. fuscidicus Sâm Lai Châu Tam Đường, Lai Châu 4 P04 P. vietnamensis var. fuscidicus Sâm Lai Châu Tam Đường, Lai Châu 5 P05 P. ginseng Sâm Hàn Quốc Đại học Đà Lạt 6 P06 Panax sp. Chưa biết Tuyên Quang 7 P07 Panax sp. Chưa biết Tuyên Quang 8 P08 Panax sp. Chưa biết Tuyên Quang 9 P09 Panax sp. Chưa biết Tuyên Quang 10 P10 P. vietnamensis var. langbianensis Sâm Langbian Lâm Đồng 11 P11 P. pseudoginseng Tam thất Bắc Lai Châu 12 PB1 P. pseudoginseng Tam thất Bắc Tam Đường, Lai Châu 13 PB2 P. pseudoginseng Tam thất Bắc Tam Đường, Lai Châu 14 PB3 P. pseudoginseng Tam thất Bắc Tam Đường, Lai Châu 15 PD1 P. bipinnatifidus Sâm Vũ Diệp Tam Đường, Lai Châu 16 PD2 P. bipinnatifidus Sâm Vũ Diệp Tam Đường, Lai Châu 17 PS1 P. stipuleanatus Tam thất hoang Sapa, Lào Cai 18 PS2 P. stipuleanatus Tam thất hoang Sapa, Lào Cai 19 PS3 P. stipuleanatus Tam thất hoang Sapa, Lào Cai http://jst.tnu.edu.vn 425 Email: jst@tnu.edu.vn
  4. TNU Journal of Science and Technology 230(01): 423 - 431 STT Ký hiệu mẫu Tên khoa học Tên thông thường Địa điểm thu mẫu 20 PS4 P. stipuleanatus Tam thất hoang Sapa, Lào Cai 21 PT1G Panax sp. Chưa biết Tuyên Quang 22 PT2G Panax sp. Chưa biết Tuyên Quang 23 PT3G Panax sp. Chưa biết Tuyên Quang 24 PT3GA Panax sp. Chưa biết Tuyên Quang 25 PV1 P. vietnamensis var. fuscidicus Sâm Lai Châu Tam Đường, Lai Châu 26 PV2 P. vietnamensis var. fuscidicus Sâm Lai Châu Tam Đường, Lai Châu 27 TT41 P. stipuleanatus Tam thất hoang Sapa, Lào Cai 28 TT41A P. stipuleanatus Tam thất hoang Sapa, Lào Cai 29 TT42 P. stipuleanatus Tam thất hoang Sapa, Lào Cai 30 TT42A P. stipuleanatus Tam thất hoang Sapa, Lào Cai 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu lá đã được sấy khô trong túi silicagel bằng phương pháp CTAB [23] với sự điều chỉnh nhỏ theo mô tả của Toyama và cộng sự [24]. DNA sau khi được tách sẽ được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy NanoDrop (Hoa Kỳ) và được lưu trữ ở nhiệt độ -40oC để dùng cho các phân tích phân tử tiếp theo. 2.2.2. Phương pháp giải trình tự gene thế hệ tiếp theo (MIG-seq) DNA tổng số được pha loãng ở nồng độ 10 pM/μl làm khuôn mẫu để khuếch đại hàng nghìn chuỗi trình tự ngắn của các vùng Inter-simple sequence repeats (ISSR) với bộ mồi PCR tiêu chuẩn theo Suyama và Matsuki [19], [25]. Mồi xuôi và mồi ngược của phản ứng PCR thứ nhất có chiều dài 31 nucleotide, bao gồm 14 nucleotide trình tự đuôi, 3 nucleotide mỏ neo, 12 nucleotide vùng SSR, cuối cùng là 2 nucleotide mỏ neo thứ hai ở đầu 3’. Sự khác biệt giữa mồi xuôi và mồi ngược chỉ ở trong trình tự đuôi của chúng. Nhiệt độ bắt cặp thấp (48oC) được sử dụng để tăng khả năng khuếch đại vùng ISSR hơn, bao gồm cả một số bắt cặp không hoàn toàn khớp [19], [20]. Phản ứng PCR đầu tiên được thực hiện nhằm khuếch đại các vùng ISSR từ bộ gene DNA bằng sự kết hợp PCR với đoạn mồi đuôi ISSR. Theo đó, thành phần của phản ứng PCR thứ nhất bao gồm: 1 μl DNA mẫu, 0,2 μM của mỗi mồi PCR thứ nhất, 3,5 μl dung dịch đệm PCR (Multiplex PCR Assay Kit Ver.2, Takara Bio, Kusatsu, Japan), 0,035 μl hỗn hợp enzyme PCR (Multiplex PCR Assay Kit Ver.2, Takara Bio). Điều kiện thực hiện phản ứng PCR thứ nhất như sau: Bước kích hoạt ban đầu ở 94°C trong 1 phút, 25 chu kỳ khuếch đại (mỗi chu kỳ khuếch đại bao gồm: Biến tính ở 94°C trong 30 giây, bắt cặp ở 48°C trong 1 phút, kéo dài ở 72°C trong 1 phút), bước ủ cuối cùng ở 72°C trong 10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng hệ thống điện di vi mạch (MultiNA; Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản) với thuốc thử DNA-2500 (Shimadzu). Mỗi sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất sẽ được pha loãng xuống 50 lần bằng nước cất và sau đó sử dụng làm mẫu cho phản ứng PCR thứ hai (phản ứng PCR gắn đuôi). Bước này cho phép thêm các trình tự bổ sung để gắn các vùng của tế bào Flow cell trên máy giải trình tự Illumina và các chỉ dấu đối với từng mẫu cho các sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng cặp mồi xuôi và mồi ngược đã được chỉ dấu (index) riêng cho từng mẫu. Trình tự mồi xuôi: 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCTCTG-3', trình tự mồi ngược: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCT TCCGATCTGAC-3' (trong đó "XXXXX" và "xxxxxxxxx’" biểu thị chỉ dấu gồm 5 và 9 base tương ứng với mồi xuôi và mồi ngược) [19], [20]. Thành phần phản ứng PCR thứ 2 gồm: 2,5 μl sản phẩm PCR thứ nhất đã pha loãng, 2,4 μl dung dịch đệm PrimeSTAR GXL 5X (Takara Bio), 0,96 μM dNTP mixture, 0,24 μl enzym DNA polymerase PrimeSTAR GXL (Takara Bio), 1,2 μl mỗi loại mồi xuôi và mồi ngược, 3,5 μl nước cất. Phản ứng PCR thứ 2 được chạy theo 20 chu kỳ khuếch đại. Mỗi chu kỳ bao gồm: Biến tính ở http://jst.tnu.edu.vn 426 Email: jst@tnu.edu.vn
  5. TNU Journal of Science and Technology 230(01): 423 - 431 98°C trong 10 giây, bắt cặp ở 54°C trong 15 giây và kéo dài ở 68°C trong 30 giây. Sau đó, 3 μl mỗi sản phẩm của phản ứng PCR thứ 2 sẽ được cho vào một thư viện hỗn hợp. Hỗn hợp này sau đó được tinh sạch và các phân đoạn với kích thước từ 350–800 bp sẽ được chọn bởi một hệ thống chọn lọc kích thước Pipin Prep DNA (Sage Science, Beverly, MA, USA). Nồng độ cuối cùng được đo bằng phản ứng định lượng PCR, thư viện mẫu với nồng độ khoảng 10 pM sẽ được dùng cho việc giải trình tự gene trên thiết bị Illumina MiSeq Sequencer (Illumina, San Diego, CA, USA) sử dụng bộ Kit MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle, Illumina). Để đảm bảo thu được số lượng và chất lượng trình tự đọc (read) lớn nhất, nhóm nghiên cứu đã thực hiện chạy 2 lần MIG-seq cho tất cả các mẫu nghiên cứu. Dữ liệu thu được từ 2 lần chạy sẽ được tổ hợp để có được bộ dữ liệu tối ưu thực hiện các phân tích tiếp theo. 2.2.3. Chọn lọc các điểm đa hình đơn nucleotide (SNPs) Dữ liệu thu được bằng phương pháp MIG-seq sẽ được kiểm soát chất lượng bằng phần mềm Trimmomatic phiên bản 0.39 [26]. Sau đó, chương trình Population trong phần mềm Stacks [27] được sử dụng để gọi các điểm đa hình đơn nucleotide theo các thông số được thiết lập như mô tả trong các nghiên cứu trước đó [28], [29]. Dữ liệu SNPs thu được sẽ được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại. 2.2.4. Phương pháp phân tích phát sinh chủng loại Phần mềm RAxML ver. 8.2 [30] được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào dữ liệu SNPs bằng phương pháp Maximum likelihood và mô hình tiến hoá GTR + G theo khuyến nghị của jMmodelTest 2.1.1 [31]. Hình thái cây phát sinh được khẳng định bằng việc thực hiện phương pháp bootstrap lặp lại 1000 lần. 3. Kết quả và bàn luận 3.1. Kết quả tách chiết DNA và giải trình tự gen bằng phương pháp MIG-seq Tất cả 30 mẫu Panax được tách chiết và giải trình tự thành công bằng phương pháp MIG-seq. Theo hình 1, tất cả các mẫu có số lượng trình tự đọc thô (đường solid line), số lượng trình tự đọc sau khi cắt adapter (dashed line) và số lượng trình tự đọc đạt chất lượng (dotted line) đạt trên 10000 read. Hình 1. Tổng số lượng trình tự đọc thu được sau hai lần chạy MIG-seq Kết quả tổng hợp sau 2 lần chạy MIG-seq thu được mẫu có số lượng trình tự đọc thấp nhất (11122 read) là P10 (P. vietnamensis var. Langbianensis), mẫu có số lượng trình tự đọc cao nhất http://jst.tnu.edu.vn 427 Email: jst@tnu.edu.vn
  6. TNU Journal of Science and Technology 230(01): 423 - 431 (100938 read) là P02 (P. vietnamensis). Dữ liệu trình tự đọc sau khi được kiểm soát chất lượng sẽ được sử dụng để gọi các điểm đa hình đơn nucleotide, làm chỉ thị phân tử cho phân tích phát sinh chủng loại. 3.2. Kết quả phân tích phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu MIG-seq Kết quả gọi các biến dị (variant call) thu được 6281 điểm đa hình đơn nucleotide (SNPs), các điểm đa hình đơn nucleotide sau đó được sử dụng làm dữ liệu đầu vào cho phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại bằng phương pháp Maximum likelihood. Cây phát sinh chủng loại thu được có độ phân giải cao, 29 mẫu Panax (không bao gồm mẫu P05 – P. ginseng) tạo thành hai nhóm chính trên cây phát sinh (nhánh I và nhánh II), các nhánh này được hỗ trợ bởi chỉ số bootstrap lần lượt là 100% và 91% (Hình 2). Hình 2. Cây phát sinh chủng loại của 30 mẫu Panax theo phương pháp Maximum Likehood dựa trên bộ dữ liệu SNPs từ phương pháp MIG – seq Trên nhánh I, các mẫu liên kết tạo thành 2 phân nhánh (1a và 1b), phân nhánh 1a bao gồm các mẫu của loài P. stipuleanatus (Tam thất hoang: PS3, PS2, TT41, TT41A, TT42, và TT42A); phân nhánh 1b gồm mẫu của các loài: P. vietnamensis var. fuscidiscus (sâm Lai Châu: P03, P04), P. stipuleanatus (Tam thất hoang: PS1, PS4); và các mẫu được định danh ban đầu là P. bipinnatifidus (sâm Vũ Diệp: PD1, PD2). Ở nhánh số II, các mẫu liên kết phân thành hai phân nhánh (2a và 2b) và được hỗ trợ bởi chỉ số bootstrap tuyệt đối (100%). Phân nhánh 2a bao gồm các mẫu của 2 loài P. pseudoginseng (PB1, PB3, P11, PB2) và Panax sp. (PT1G, PT2G, P08, P09, PT3G, PT3GA, P06, P07), đây là các mẫu được thu tại Lai Châu và Tuyên Quang, có hình thái khác với các loài đã biết, tuy nhiên tại thời điểm hiện tại chưa có đầy đủ bằng chứng về hình thái do đó chưa thể xác định là loài nào. Phân nhánh 2b, gồm các loài có quan hệ gần gũi là P. vietnamensis var. Fuscidiscus (sâm Lai Châu: PV1 PV2), P. vietnamensis (sâm Ngọc Linh: P01, P02) và P. vietnamensis var. langbianensis (sâm Langbian: P10). 4. Thảo luận Từ kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại trên, kết hợp với các kết quả nghiên cứu trước đó, chúng tôi đưa ra một số nhận định và thảo luận sau: http://jst.tnu.edu.vn 428 Email: jst@tnu.edu.vn
  7. TNU Journal of Science and Technology 230(01): 423 - 431 Thứ nhất, trên cây phát sinh chủng loại, các mẫu P03, P04, PV1 và PV2 đều được định danh ban đầu là sâm Lai Châu (P. vietnamensis var. fuscidicus), nhưng P03, P04 nằm trên phân nhánh 1b và có mối quan hệ gần gũi với P. binpinnatifidus và P. stipuleanatus, trong khi PV1 và PV2 nằm trên phân nhánh 2b và có mối quan hệ gần gũi với sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis) và sâm Langbian (P. vietnamensis var langbianensis). Theo kết quả nghiên cứu năm 2014 của Phan Kế Long, sâm Lai Châu có mối quan hệ phát sinh gần gũi với sâm Ngọc Linh [15], kết hợp kết quả phân tích phát sinh của nghiên cứu này, chúng tôi kết luận các mẫu PV1, PV2 là sâm Lai Châu (P. vietnamensis var. fuscidicus). Thứ hai, trong khi phân nhánh 1a được xác định bao gồm 6 mẫu thuộc loài Tam thất hoang (PS3, PS2, TT41, TT41A, TT42, và TT42A), thì phân nhánh 1b bao gồm cả các mẫu thuộc sâm Vũ Diệp (PD1, PD2), 02 mẫu (PS1, PS4) được định danh ban đầu là loài Tam thất hoang, và 02 mẫu P03, P04 được định danh là sâm Lai Châu. Tuy nhiên, theo như cây phát sinh, tính đơn hình (monophyly) của phân nhánh 1a và 1b được hỗ trợ mạnh mẽ bởi các chỉ số bootstrap cao (96% và 88%), chứng tỏ có sự tương đồng cao về mặt di truyền giữa các mẫu thuộc hai nhánh này. Kết hợp kết quả phân tích phát sinh với kết quả kiểm tra, so sánh hình thái vật liệu nghiên cứu ban đầu cũng như địa điểm thu mẫu (các mẫu PD1, PD2 và P03, P04 cùng được thu tại Tam Đường, Lai Châu), trong nghiên cứu này chúng tôi kết luận các mẫu thuộc phân nhánh 1a (PS3, PS2, TT41, TT41A, TT42, và TT42A) là loài Tam thất hoang (P. stipuleanatus), các mẫu thuộc phân nhánh 1b (P03, P04, PS4, PS2, PD1, PS1) thuộc loài sâm Vũ Diệp (P. binpinnatifidus). Thứ ba, kết quả phân tích phát sinh chủng loại cho thấy các mẫu trên nhánh 2a chia thành 2 nhóm rõ ràng với chỉ số bootstrap là 100%. Nhóm thứ nhất gồm PB01, PB03, PB03 và P11 được định danh là Tam thất Bắc (P. pseudoginseng), nhóm thứ 2 gồm các mẫu P06, P07, P08, P09 được thu từ Lai Châu và các mẫu PT1G, PT2G, PT3G, PT3GA được thu từ Tuyên Quang. Các mẫu PT1G, PT2G, PT3G, PT3GA được thu từ các mẫu thuộc nghiên cứu của Trịnh Ngọc Bon và cộng sự năm 2019 [32], theo đó tác giả đã mô tả các mẫu này là một loài Panax sp. có một số đặc điểm hình thái khác với các loài khác thuộc chi Panax ở Việt Nam, nhưng chưa kết luận là loài nào. Từ các dẫn liệu trên, chúng tôi nhận thấy rằng các mẫu P06, P07, P08, P09, PT1G, PT2G, PT3G và PT3GA là một loài riêng biệt, cần tiếp tục nghiên cứu thêm các bằng chứng hình thái để kết luận là một loài hay thứ sâm mới của Việt Nam. Thứ tư, các loài sâm Lai Châu (P. vietnamensis var. fuscidicus: PV1, PV2), sâm Ngọc Linh (P. vietnamemsis: P01, P02) và sâm Langbian (P. vietnamensis var langbianensis: P10) có mối quan hệ gần gũi với nhau trên cây phát sinh (hình 2), tuy nhiên mẫu P10 của sâm Langbian liên kết với các mẫu P02 và P01 của sâm Ngọc Linh với chỉ số bootstrap thấp (58%). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đó của Phan Kế Long [15], phản ánh mối quan hệ phát sinh gần gũi giữa sâm Ngọc Linh và sâm Lai Châu. 5. Kết luận Bằng việc ứng dụng phương pháp MIG-seq, nghiên cứu này đã xây dựng được mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam, cây phát sinh có độ phân giải cao, các nhóm đơn hình được hỗ trợ mạnh mẽ bởi các chỉ số bootstrap. Theo kết quả nghiên cứu này, chi Panax ở Việt Nam chia làm 2 nhóm chính, nhóm thứ nhất gồm hai loài P. stipuleanatus (Tam thất hoang) và P. bipinnatifidus (sâm Vũ Diệp) có quan hệ phát sinh gần gũi, trong khi nhóm thứ hai gồm 3 loài và 2 thứ là: P. pseudoginseng (Tam Thất Bắc), Panax sp., P. vietnamensis (sâm Ngọc Linh), P. vietnamensis var. fuscidicus (sâm Lai Châu) và P. vietnamensis var. langbianensis (sâm Langbian). Nghiên cứu này là tiền đề cho việc ứng dụng phương pháp MIG-seq trên nền tảng giải trình tự gene thế hệ mới để nghiên cứu lịch sử tiến hoá, mối quan hệ phát sinh, cũng như định danh các loài thuộc chi Panax nói riêng và các loài dược liệu ở Việt Nam nói chung. http://jst.tnu.edu.vn 429 Email: jst@tnu.edu.vn
  8. TNU Journal of Science and Technology 230(01): 423 - 431 Lời cảm ơn Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn các đồng nghiệp tại khoa Sinh học trường Đại học Đà Lạt, Viện Khoa học Tây Nguyên, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, trường Đại học Tohoku, Nhật Bản đã hỗ trợ trong công tác thu mẫu và thực nghiệm, giúp chúng tôi hoàn thành nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO/ REFERENCES [1] D. V. Nguyen, A. P. T. Tran, C. T. Vu, L. K. Phan, and A. T. L. Hoang, “The genus Panax L. (Araliaceae) in Vietnam,” The 5th National Scientific Conference on Ecology and Biological Resources, 2017, pp. 106-111. [2] M. Zhou, G. Young, G. Sun, Z. Guo, G. Xun, and Y. Pan, “Resolving complicated relationships of the Panax bipinnatifidus complex in southwestern China by RAD-seq data,” Molecular Phylogenetics and Evolution, vol. 149, 2020, Art. no. 106851. [3] T. N. Le, M. T. Nguyen, T. V. Ngu, K. V. Nguyen, and D. V. Nong, “Genetic diversity of Panax stipuleanatus Tsai in North Vietnam detected by inter simple sequence repeat (ISSR) markers,” Biotechnology & Biotechnological Equipment, vol. 30, no. 3, pp. 506-511, 2016. [4] I. V. Grushvitzky, V. N. Tikhomirov, E. S. Aksenov, and G. V. Shibakina, “Succulent fruit with carpophore in species of the genus Stilbocarpa Decne. et Planch.(Araliaceae),” Bulletin of the Moscow Society of Naturalists, Biological Series, vol. 74, pp. 64-76, 1969. [5] H. H. Pham, An illustrated flora of Vietnam, vol. 1-3. Young Publishing House, Ho Chi Minh City, 2003. [6] D. T. Ha, “A new species of the genus Panax (Araliaceae) from Vietnam,” Botanicheskii Zhurnal, vol. 70, pp. 519-522, 1985. [7] T. Nguyen, “Panax species in Vietnam,” Journal of Medicinal Materials, vol. 10, no. 3, pp. 71-76, 2005. [8] L. K. Phan, S. T. Le, L. K. Phan, D. D. Vu, and T. V. Pham, “Lai Chau ginseng Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai I. morphology, ecology, distribution and conservation status,” Proceeding of the 2nd VAST-KAST Workshop on Biodiversity and Bio-active compounds, 2013, pp. 65-73. [9] D. V. Nong, T. N. Le, C. D. Nguyen, and T. V. Chan, “A new variety of Panax (Araliaceae) from Lam Vien Plateau, Vietnam and its molecular evidence,” Phytotaxa, vol. 277, no. 1, pp. 47-58, 2016, doi: 10.11646/phytotaxa.277.1.4. [10] J. Wen and E. A. Zimmer, “Phylogeny and Biogeography of Panax L. (the Ginseng Genus, Araliaceae): Inferences from ITS Sequences of Nuclear Ribosomal DNA,” Molecular Phylogenetics and Evolution, vol. 6, no. 2, pp. 167-177, 1996, doi: 10.1006/mpev.1996.0069. [11] J. Wen, “Evolution of The Aralia–Panax Complex (Araliaceae) As Inferred From Nuclear Ribosomal Its Sequences,” Edinburgh Journal of Botany, vol. 58, no. 2, pp. 243-257, 2001. [12] K. Kim, B. V. Nguyen, J. Dong, Y. Wang, J. Y. Park, S. C. Lee, and T. J. Yang, “Evolution of the Araliaceae family inferred from complete chloroplast genomes and 45S nrDNAs of 10 Panax related species,” Scientific Reports, vol. 7, no. 1, p. 4917, 2017, doi: 10.1038/s41598-017-05218-y. [13] V. Manzanilla, A. Kool, L. N. Nguyen, H. V. Nong, H. T. T. Le, and H. J. Boer, “Phylogenomics and barcoding of Panax: toward the identification of ginseng species,” BMC Evolution Biology, vol. 18, no. 1, pp. 1-14, 2018, doi: 10.1186/s12862-018-1160-y. [14] T. P. T. Nguyen, S. G. Nguyen, S. T. Le, and L. K. Phan, Genetic relationships of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv., 1985) to other species of the genus Panax (Araliaceae),” The 4th National Scientific Conference on Ecology and Biological Resources, 2011, pp. 955-959. [15] L. K. Phan, D. D. Vu, L. K. Phan, S. G. Nguyen, T. P. T. Nguyen, L. M. T. Le, and S. T. Le, “Phylogenetic relationships of the Panax samples collected in Lai Chau province based on MatK and ITS-rDNA sequences,” Journal of Biotechnology, vol. 12, no. 2, pp. 327-337, 2014. [16] T. P. T. Nguyen, H. N. T. Mai, N. Z. Yury, and D. R. Galina, “rbcL and rpoL gene sequences of Panax vietnamensis var. fuscidiscus and Panax vietnamensis, the background for identification and comparison,” Academia Journal of Biology, vol. 39, no. 1, pp. 80-85, 2016. [17] H. T. Le, L. N. Nguyen, M. M. Bui, H. H. Ha, H. T. T. Huynh, H. V. Nong, H. V. Ha, and H. T. T. Le, “Application of DNA barcodes in identification of ginseng samples in the genus Panax L” Journal of Biotechnology, vol. 15, no. 1, pp. 63-72, 2017. [18] T. Q. Pham, D. M. Nguyen, B. T. Khuong, D. T. Nguyen, K. T. Nguyen, T. T. Bui, A. H. T. Nguyen, B. N. Trinh, H. K. T. Tran, K. D. Tran, and T. H. Khuat, “Genetic diversity assessment of some ginseng http://jst.tnu.edu.vn 430 Email: jst@tnu.edu.vn
  9. TNU Journal of Science and Technology 230(01): 423 - 431 samples collected in Lai Chau,” Vietnam Journal of Science and Technology, vol. 60, no. 2, pp. 27-31, 2018. [19] Y. Suyama and Y. Matsuki, “MIG-seq: an effective PCR-based method for genome-wide single- nucleotide polymorphism genotyping using the next-generation sequencing platform,” Scientific Report, vol. 5, no. 1, p. 16963, 2015, doi: 10.1038/srep16963. [20] Y. Suyama, S. K. Hirota, A. Matsuo, Y. Tsunamoto, C. Mitsuyuki, A. Shimura, and K. Okano, “Complementary combination of multiplex high throughput DNA sequencing for molecular phylogeny,” Ecological Research, pp. 1-11, 2021, doi: 10.1111/14401703. 12270. [21] J. Cavender-Bares, A. Gonzalez-Rodriguez, D. A. R. Eaton, A. Hipp, A. Beulke, and P. S. Manos, “Phylogeny and biogeography of the American live oaks (Quercus subsection Virentes): a genomic and population genetics approach,” Molecular Ecology, vol. 24, no. 14, pp. 3668-3687, 2015, doi: 10.1111/mec.13269. [22] S. Fitz-Gibbon, A. Hipp, K. Pham, P. Manos, and V. L. Sork, “Phylogenomic inferences from reference- mapped and de novo assembled short read sequence data using RADseq sequencing of California white oaks (Quercus subgenus Quercus),” Genome, vol. 60, no. 9, pp. 743-755, 2017, doi: 10.1139/gen-2016- 0202. [23] J. J. Doyle and J. L. Doyle, “A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue,” Phytochemical Bulletin, vol. 19, pp. 11-15, 1987. [24] H. Toyama, T. Kajisa, S. Tagane, K. Mase, P. Chhang, V. Samreth, V. Ma, H. Sokh, R. Ichihasi, Y. Onoda, N. Mizoue, and T. Yahara, “Effects of logging and recruitment on community phylogenetic structure in 32 permanent forest plots of Kampong Thom, Cambodia,” Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, vol. 370, no. 1662, pp. 1-13, 2015, doi: 10.1098/rstb.2014.0008. [25] B. T. Hoang, N. V. Nguyen, S. Tagane, H. Toyama, K. Mase, C. Mitsuyuki, J. S. Strijk, Y. Suyama, and T. Yahara, “A taxonomic study of Quercus langbianensis complex based on morphology and DNA barcodes of classic and next generation sequences,” PhytoKeys, vol. 95, pp. 37-70, 2018, doi: 10.3897/phytokeys.95.21126. [26]A. M. Bolger, M. Lohse, and B. Usadel, “Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data,” Bioinformatics, vol. 30, pp. 2114-2120, 2014, doi: 10.1093/bioinformatics/btu170. [27] J. Catchen, P. A. Hohenlohe, S. Bassham, A. Amores, and W. A. Cresko, “Stacks: An analysis tool set for population genomics,” Molecular Ecology, vol. 22, pp. 3124-3140, 2013, doi: 10. 1111/mec.12354. [28] K. Takata, H. Taninaka, M. Nonakam, F. Iwasem, T. Kikuchi, Y. Suyama, S. Nagai, and N. Yasuda, “Multiplexed ISSR genotyping by sequencing distinguishes two precious coral species (An thozoa: Octocorallia: Coralliidae) that share a mitochondrial haplotype,” PeerJ, vol. 7, p. e7769, 2019, doi: 10.7717/peerj.7769. [29] N. V. Nguyen, B. T. Hoang, A. Nagahama, S. Tagane, H. Toyama, A. Matsuo, Y. Suyama, and T. Yahara, “Morphological and molecular evidence reveals three new species of Lithocarpus (Fagaceae) from Bidoup-Nui Ba National Park, Vietnam,” PhytoKeys, vol. 186, pp. 73–92, 2021, doi: 10.3897/phytokeys.186.69878. [30] A. Stamatakis, “RAxML Version 8: A tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies,” Bioinformatics, vol. 30, no. 9, pp. 1312-1313, 2014, doi: 10.1093/bioinformatics/btu033. [31] D. Darriba, G. L. Taboada, R. Doallo, and D. Posada, “jModelTest 2: More models, new heuristics and parallel computing,” Nature Methods, vol. 9, no. 8, p. e772, 2012, doi: 10.1038/nmeth.2109. [32] B. N. Trinh, T. Q. Pham, S. T. Hoang, A. T. H. Nguyen, T. T. Bui, S. T. Nguyen, H. Q. Nguyen, and A. T. V. Nguyen, “Panax sp. in Tuyen Quang, North Vietnam – A Potential Plant for Poverty Reduction,” Asian Journal of Research in Botany, vol. 2, no. 2, pp. 1-10, 2019. http://jst.tnu.edu.vn 431 Email: jst@tnu.edu.vn
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2