Nghiên cứu nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc và niêm mạc má tự thân điều trị bệnh lý biểu mô giác mạc

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC VÙNG RÌA GIÁC MẠC<br /> VÀ NIÊM MẠC MÁ TỰ THÂN ĐIỀU TRỊ BỆNH LÝ BIỂU MÔ GIÁC MẠC<br /> Trần Công Toại*, Trần Thị Thanh Thủy*, Phan Kim Ngọc**, Diệp Hữu Thắng***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Một số bệnh lý khiếm khuyết tế bào vùng rìa giác mạc bẩm sinh hoặc mắc phải bởi các nguyên<br /> nhân như hội chứng Steven Johnson, phẫu thuật giác mạc nhiều lần, bỏng nhiệt hoặc hóa chất tạo sẹo giác mạc,<br /> nhiễm trùng, đeo contact lens…dẫn đến phá hủy lớp biểu mô giác mạc gây giảm thị lực của bệnh nhân. Để điều<br /> trị hiệu quả, bệnh nhân cần phải tạo được lớp biểu mô giác mạc thay thế.<br /> Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu loạt ca. Phương pháp nghiên<br /> cứu: Bệnh nhân được chia làm 2 nhóm dựa theo chỉ định để tiến hành ghép tế bào gốc. Nhóm 1: ghép “tấm biểu<br /> mô” được tạo thành từ niêm mạc má. Nhóm: ghép “tấm biểu mô” được tạo thành từ tế bào gốc vùng rìa giác<br /> mạc. Tế bào rìa giác mạc và niêm mạc má được thu nhận theo đúng tiêu chuẩn chọn mẫu và tạo tấm biểu mô theo<br /> qui trình. Đánh giá: Tế bào nuôi cấy được theo dõi dưới kính hiển vi đảo ngược pha, nhuộm mô học HE và<br /> nhuộm hóa mô miễn dịch với marker p63. Kết quả ghép tấm biểu mô trên bệnh nhân được theo dõi và dựa trên<br /> khám bề mặt giác mạc, đánh giá thị lực và kết quả tạo tân mạch giác mạc.<br /> Kết quả và bàn luận: Sau khi tiến hành nghiên cứu, chúng tôi đạt được một số kết quả như sau: - Nhóm 1:<br /> bề mặt nhãn cầu ổn định 6/7 mắt. Thị lực cải thiện nhưng không quá 1 hàng. - Nhóm 2: bề mặt nhãn cầu ổn định<br /> 22/23 ca. Thị lực cải thiện lớn hơn 2 hàng 20/23 ca. Kết quả này cho thấy tính hiệu quả của phương pháp điều trị<br /> như các tác giả khác trên thế giới.<br /> Kết luận: Chúng tôi đã sử dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc an toàn và hữu dụng, đặc biệt điều<br /> trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu ở chuyên khoa mắt.<br /> Từ khóa: ghép tế bào gốc, niêm mạc má, rìa giác mạc.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> CULTURE OF AUTOGRAFT LIMBAL CELLS AND CHEEK EPITHELIAL CELLS TO TREAT<br /> CORNEAL EPITHELIUM DISEASE<br /> Tran Cong Toai, Tran Thi Thu Thuy, Phan Kim Ngoc, Diep Huu Thang<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 24 - 30<br /> Introduction: Some pathologies of corneal cell edge region may be of congenital origin such as Steven<br /> Johnson syndrome, or can be caused by mechanical or environment condition such as corneal multiple surgeries,<br /> chemicals that eventually generate infection due to different auto-immune reaction. All these condition may<br /> eventually lead to the destruction of cornea epithelial layer causing either a decrease or a total loss of vision. For an<br /> effective treatment, patients need to be regenerated the corneal epithelial layer.<br /> Materials and methods: Research design: Case series study<br /> Methods: Patients were divided into 2 groups to conduct stem cell transplantation: Group 1: graft<br /> “epithelial sheets” are made up of oral mucosa. Group 2: graft “epithelial sheets” are formed from stem cell of<br /> Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, **Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên- ĐH Quốc Gia Tp.HCM<br /> Bệnh viện Mắt Tp.HCM<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS. BS Trần Công Toại<br /> ĐT: 0913.914.672<br /> *<br /> <br /> ***<br /> <br /> 24<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> corneal area (limbal stem cell). Corneal cell edge and oral mucosa were included as standard sample and generate<br /> epithelial sheets in the protocol.<br /> Evaluation: Cells were monitored by inverted phase microscopy, HE staining and immune-histochemical<br /> staining by p63 marker. Results of the epithelial sheet transplant are monitored and evaluated by the corneal<br /> surface examination, vision and corneal new vessels.<br /> Results and discussion: After conducting research, we obtained the results as follows: - Group 1: Stable<br /> surface eyeball 6/7 eyes. Vision improved, but not more than 1 row. - Group 2: Stable surface eyeball 22/23 eyes.<br /> Vision improved, but not more than 2 row. This result shows the effectiveness of treatment in line with other<br /> international studies.<br /> Conclusion: We used a successfully technique which confirmed that cultured stem cells are safe and useful<br /> in the treatment of few eye pathological condition.<br /> Key words: stem cell transplantation, oral mucosa, of corneal area (limbal stem cell).<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Nghiên cứu tế bào gốc là một lĩnh vực mang<br /> tính thời sự hiện nay trên thế giới vì những tiềm<br /> năng ứng dụng to lớn của chúng trong lĩnh vực<br /> Y Sinh học(18,19,21,32). Tuy nhiên, tùy theo định<br /> hướng nghiên cứu của mỗi nhóm nghiên cứu,<br /> mỗi vùng miền và mỗi quốc gia mà khả năng<br /> nghiên cứu được tiến hành trên những quy mô<br /> nghiên cứu khác nhau. Ở nước ta nghiên cứu tế<br /> bào gốc đang từng bước được quan tâm bởi các<br /> nhà khoa học, các nhà nghiên cứu, các bác sĩ lâm<br /> sàng cũng như các nhà đầu tư chiến lược khoa<br /> học của nhà nước và đang được đầu tư vào lĩnh<br /> vực mới mẽ nhưng đầy triển vọng này(8). So với<br /> các nước trong khu vực, Việt Nam chúng ta bắt<br /> đầu xây dựng chiến lược, đào tạo đội ngũ<br /> chuyên gia, cơ sở hạ tầng và mức độ đầu tư<br /> cũng như những sản phẩm công nghệ tế bào<br /> gốc như quy trình công nghệ, công trình công<br /> bố khoa học chuyên ngành …tuy nhiên vẫn chỉ<br /> ở điểm xuất phát.<br /> Nhờ vào sự giúp đỡ, chuyển giao kỹ thuật<br /> từ phòng thí nghiệm tiên tiến tại Nhật(21,22,23)<br /> chúng tôi có thể tiếp cận, triển khai các qui trình<br /> mới mẻ nhưng có giá trị vô cùng to lớn, thực<br /> hiện nghiên cứu ứng dụng tế bào vùng rìa giác<br /> mạc và niêm mạc má người tạo tấm biểu mô<br /> điều trị các bệnh lý tổn thương biểu mô giác<br /> mạc tự thân qua nuôi cấy(23,25,28).<br /> Thực hiện đề tài chúng tôi cần đạt các mục<br /> tiêu sau:<br /> <br /> Tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc<br /> vùng rìa và tế bào niêm mạc má.<br /> Đánh giá kết quả điều trị bệnh nhân tổn<br /> thương biểu mô giác mạc bằng ghép tấm biểu<br /> mô tự thân qua nuôi cấy tế bào gốc.<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Thiết kết nghiên cứu: nghiên cứu loạt ca.<br /> Các phương pháp nghiên cứu:<br /> Tạo màng collagen từ màng ối người(2,4,10,11,16,17,20,30).<br /> - Sản phụ phải được xét nghiệm âm tính với<br /> HIV, HBV, HCV, VDRL… Mẫu được lấy ngay<br /> sau sanh, trữ trong lọ vô trùng có chứa dung<br /> dịch PBS (Phosphat Buffer Salin), kháng sinh,<br /> chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.<br /> - Rửa màng ối trong dung dịch PBS cho đến<br /> khi sạch máu, sạch các mô sống không cần thiết.<br /> - Cắt màng ối thành từng mảnh khoảng<br /> 50cm2 và xử lý với dung dịch trypsin 0,25% EDTA 0,02% trong 30 phút ở 37oC.<br /> - Cạo bỏ lớp tế bào biểu mô màng ối, tránh<br /> làm vỡ màng đáy.<br /> - Đánh giá hiệu quả bóc tách lớp tế bào biểu<br /> mô màng ối bằng phương pháp nhuộm<br /> hematoxylin và eosin (nhuộm H&E).<br /> - Màng collagen được bảo quản 12 tháng sau<br /> khi để khô tự nhiên và khử trùng bằng tia<br /> gamma.<br /> - Trải mẫu màng ối trên đĩa insert, để khô tự<br /> nhiên 2 giờ trong buồng cấy, ở nhiệt độ phòng.<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> 25<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> - Khảo sát màng ối sau xử lý bằng cách<br /> quan sát mô học và phân tích độc chất.<br /> <br /> Phương pháp trải màng collagen trên đĩa<br /> nuôi(1,14,26,31)<br /> Cắt màng collagen thành những mảnh có<br /> diện tích tương ứng bề mặt đĩa nuôi.<br /> Trải căng và áp sát màng collagen trên bề<br /> mặt đĩa nuôi (đĩa lồng - insert) sao cho mặt biểu<br /> mô hướng lên trên.<br /> Để khô tự nhiên trong tủ cấy.<br /> Đóng gói và khử trùng bằng chiếu xạ tia  từ<br /> nguồn Co60, suất liều 25 kGy(3,8,15).<br /> Các phương pháp nuôi cấy tế bào 3T3, tế<br /> bào vùng rìa giác mạc và tế bào niêm mạc má<br /> theo đúng qui trình ĐH Tokyo Dental College<br /> Ichikawa(5,7,23).<br /> Tạo tấm biểu mô giác mạc từ TBG vùng rìa<br /> giác mạc.<br /> Thu nhận mẫu tế bào vùng rìa giác mạc tại<br /> phòng mổ (Bệnh viện Mắt TP.HCM), cho vào<br /> dung dịch bảo quản Optisol GS, đặt trong hộp<br /> bảo quản lạnh 2-80C, chuyển nhanh về phòng<br /> thí nghiệm.<br /> Rửa 2 lần bằng dung dịch PBS.<br /> Cắt lọc mẫu mô.<br /> Nuôi trên đĩa insert đã trảii màng collagen<br /> từ màng ối và có feeder tế bào 3T3 trong môi<br /> trường<br /> SHEM<br /> (DEMEM/F12,<br /> 100µ/ml<br /> Streptomycine, 100U/ml Penicillin, 10ng/ml<br /> EGF, 5 µ/ml Insulin, 0,1 µ/ml Cholera toxin, 5%<br /> FBS).<br /> Mẫu mô có bờ biểu mô áp trên màng, nhỏ 2<br /> giọt môi trường SHEM, ngày tiếp theo thêm<br /> 0,5ml môi trường, 2 ngày tiếp theo thay môi<br /> trường 1ml/đĩa insert và 1,5ml/đĩa 3T3.<br /> Từ 14-21 ngày tạo được tấm biểu mô có<br /> nhiều lớp tế bào có thể ghép lại cho bệnh nhân.<br /> Một phần mẫu giữ lại sau ghép đánh giá mô<br /> học và thực hiện hóa miễn dịch mô.<br /> <br /> 26<br /> <br /> Tạo tấm biểu mô giác mạc từ TBG niêm mạc<br /> má.<br /> Niêm mạc má được lấy từ BV. Mắt trên<br /> người tình nguyện d=0,8 cm đựng trong<br /> dung dịch Optisol GS giữ 40C mang về phòng<br /> thí nghiệm.<br /> Cắt lọc mẫu bớt phần mô dưới niêm mạc.<br /> Tạo ra thành các phần 2mm.<br /> Ủ trong dung dịch Dipase ở 40C trong 5 giờ<br /> sao cho Dipase có nồng độ 0,8UI/ml.<br /> Tách tế bào,đếm tế bào sống cấy trên đĩa<br /> insert (0,1 – 1 x 105 cells/ml).<br /> Thay môi trường SHEM mỗi 2 ngày, 1ml/đĩa<br /> insert và 1,5ml/đĩa tế bào 3T3. Mẫu được tiếp<br /> xúc không khí (airlifting) 3 ngày trước khi ghép.<br /> Từ 14-21 ngày tạo được tấm biểu mô có<br /> nhiều lớp tế bào có thể chuyển lại ghép cho<br /> bệnh nhân.<br /> Một phần mẫu giữ lại sau ghép đánh giá mô<br /> học và hóa miễn dịch mô.<br /> Điều trị bệnh lý biểu mô giác mạc và kết quả<br /> ghép điều trị 30 bệnh nhân tình nguyện(24,27,29,33).<br /> Bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Mắt TP.<br /> HCM có chỉ định ghép TBG sẽ được chuyển đến<br /> khoa Giác mạc.<br /> Bác sỹ chuyên khoa Giác mạc sẽ khám, hội<br /> chẩn để ra quyết định điều trị. Bệnh nhân<br /> được bác sĩ chuyên khoa giải thích đầy đủ các<br /> nhu cầu và phương pháp điều trị bằng giải<br /> pháp nuôi cây tế bào sau nuôi cấy, cam kết<br /> đồng ý theo mẫu.<br /> Nếu bệnh nhân bị tổn thương một mắt và<br /> mắt còn lại tốt sẽ được điều trị ghép TBG vùng<br /> rìa giác mạc.<br /> Nếu bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt và<br /> niêm mạc má còn tốt sẽ được điều trị ghép tấm<br /> biểu mô được nuôi cấy từ tế bào niêm mạc má.<br /> Bệnh nhân sẽ được làm các xét nghiệm tiền<br /> phẫu, khám nội khoa tổng quát, khám mắt (đặc<br /> biệt đánh giá tình trạng viêm, tân mạch và phim<br /> nước mắt).<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Lấy mẫu tế bào chuyển về phòng thí<br /> nghiệm xử lý và nuôi cấy tạo tấm biểu mô,<br /> hẹn trở lại ghép.<br /> <br /> Hình 1: Xử lý mẫu tế<br /> bào niêm mạc má<br /> <br /> Hình 3.15: Màng ối trước cấy<br /> tế bào, nhuộm HE x 400<br /> <br /> Hình 3.16: Màng ối sau nuôi<br /> cấy, nhuộm HE x400<br /> <br /> Hình 3.17: Màng ối sau<br /> nuôi cấy, nhuộm P63 x 400<br /> <br /> Hình 3.18: Tấm tế bào từ<br /> Y.Hori (Osaka, Nhật)<br /> <br /> Hình2: Đĩa insert dùng<br /> để nuôi cấy tế bào<br /> <br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi:<br /> - Đánh giá bước đầu việc ứng dụng ghép<br /> tấm biểu mô điều trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu.<br /> Hình 3.9: Tế bào niêm mạc<br /> <br /> má sau nuôi cấy 6 ngày<br /> <br /> Hình 3.10: Tế bào niêm mạc<br /> má sau nuôi cấy 10 ngày<br /> <br /> - Đánh giá chất lượng tấm biểu mô được tạo<br /> thành từ nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc<br /> hoặc từ tế bào niêm mạc má trên màng ối.<br /> <br /> Phân loại<br /> Bệnh nhân được chia làm 2 nhóm dựa theo<br /> chỉ định:<br /> - Nhóm 1: ghép “tấm biểu mô” được tạo<br /> thành từ tế bào niêm mạc má.<br /> - Nhóm 2: ghép “tấm biểu mô” được tạo<br /> thành từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc.<br /> <br /> Quy trình chọn lọc bệnh nhân<br /> Tế bào gốc vùng rìa giác mạc: lấy từ kết mạc<br /> rìa cực trên 4x2 mm.<br /> Tế bào niêm mạc má: lấy từ niêm mạc má,<br /> đường kính 8mm.<br /> Mẫu được đặt trong môi trường chuyên chở<br /> và gửi đến bộ Phòng thí nghiệm Vật liệu Sinh<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> 27<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> học, Bộ môn Mô - Phôi, Trường Đại học Y khoa<br /> Phạm Ngọc Thạch thực hiện qui trình nuôi cấy.<br /> - Bệnh nhân sẽ được phẫu thuật ghép tấm<br /> biểu mô.<br /> <br /> - Tân mạch độ 1: 5/7 mắt, độ 2: 1/7 mắt, độ 3:<br /> 1/7 mắt.<br /> - Thị lực có cải thiện nhưng không quá 1 hàng.<br /> <br /> - Bệnh nhân được điều trị ngoại trú, không<br /> phải nằm viện.<br /> Đánh giá: Đánh giá kết quả dựa trên khám<br /> bề mặt giác mạc, thị lực và tân mạch giác mạc<br /> (tân mạch được chia làm 4 độ: độ 1 là tân mạch<br /> vùng rìa, độ 2 là tân mạch vào giác mạc 3mm,<br /> độ 3 là tân mạch vào toàn bộ giác mạc, độ 4 vào<br /> toàn bộ giác mạc và thành bó tân mạch).<br /> Nhóm 1: Tấm biểu mô được tạo thành từ tế<br /> bào gốc vùng rìa giác mạc của 23 bệnh nhân (16<br /> bệnh nhân mộng thịt tái phát, 4 bệnh nhân bỏng<br /> kiềm,1 bệnh nhân Stevens Johnson,1 bệnh nhân<br /> suy yếu tế bào gốc chưa rõ nguyên nhân và 1<br /> bệnh nhân bị ong chích). Thời gian theo dõi<br /> trung bình 6,34 tháng.<br /> Nhóm 2: Tấm biểu mô từ tế bào niêm mạc<br /> má được nuôi cấy trên màng ối của 6 bệnh nhân<br /> (6 mắt) với hội chứng Stevens Johnson và một<br /> bệnh nhân bỏng hóa chất. Tổng cộng 7 mắt, thời<br /> gian theo dõi trung bình 18,4 tháng.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> <br /> Hình 3.25: Điều trị tổn thương<br /> sẹo giác mạc trước ghép<br /> <br /> Hình 3.26:Tế bào rìa giác mạc<br /> sau nuôi cấy, trước ghép<br /> <br /> Hình 3.27: Điều trị tổn thương<br /> sẹo giác mạc trước ghép<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Ghép tấm biểu mô được nuôi cấy từ tế bào<br /> <br /> Nhóm 1:<br /> <br /> gốc đã giúp giải quyết được những bệnh lý bề<br /> <br /> - Ghép tế bào gốc vùng rìa.<br /> - Thời gian theo dõi trung bình 6,34 tháng.<br /> - Bề mặt nhãn cầu ổn định 22/23 ca. Một ca bi<br /> nhiễm trùng sau mổ 07 ngày trên bệnh nhân<br /> nhiễm HIV (nhiễm trùng sau đó được điều trị ổn).<br /> - Thị lực cải thiện lớn hơn 2 hàng 20/23 ca<br /> (87%).<br /> <br /> mặt nhãn cầu do suy yếu tế bào gốc vùng rìa<br /> giác mạc(6,9,12,13,34).<br /> Phối hợp với ghép giác mạc sẽ đem lại thị<br /> lực cho bệnh nhân tốt hơn và góp phần mang lại<br /> thành công của phẫu thuật ghép giác mạc.<br /> Cần điều trị tình trạng viêm bề mặt, tình<br /> <br /> - Tân mạch chưa phát triển 18/23 ca.<br /> <br /> trạng khô mắt thật tốt sẽ giúp mang lại kết<br /> <br /> - Độ 1: 3/23 ca, độ 2: 1/23 ca và độ: 4 1/23<br /> <br /> quả tốt.<br /> <br /> Nhóm 2:<br /> <br /> Bệnh nhân cần được làm xét nghiệm tiền<br /> <br /> - Ghép tế bào niêm mạc má.<br /> <br /> phẫu kiểm tra các bệnh liên quan miễn dịch ví<br /> <br /> - Thời gian theo dõi trung bình 18,4 tháng.<br /> - Bề mặt nhãn cầu ổn định 6/7 mắt.<br /> <br /> 28<br /> <br /> Hình 3.24: Mắt tổn thương<br /> sẹo giác mạc trước ghép<br /> <br /> dụ HIV, tiểu đường, viêm khớp,... nhằm tiên<br /> lượng và hướng điều trị.<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br />