Nghiên cứu quy trình chiết xuất Hypoxanthin từ bài thuốc trúng phong

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> <br /> NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT HYPOXANTHIN<br /> TỪ BÀI THUỐC TRÚNG PHONG<br /> Phạm Văn Hiển*, Trịnh Thanh Hùng**, Lê Đức Hùng***<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: khảo sát lựa chọn các điều kiện chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong.<br /> Đối tượng: bài thuốc Trúng phong. Phương pháp: khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất<br /> chiết hypoxanthin, gồm: phương pháp chiết, dung môi, tỷ lệ dung môi, nhiệt độ, thời gian và số<br /> lần chiết; định lượng hypoxanthin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả và kết luận:<br /> đã khảo sát và tìm được các điều kiện cho chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong<br /> gồm: sử dụng phương pháp chiết siêu âm gia nhiệt với dung môi là nước, tỷ lệ dược liệu/dung<br /> 0<br /> môi 1/12, nhiệt độ 60 C, thời gian 60 phút/lần, số lần chiết: 02 lần. Từ các thông số khảo sát<br /> được, đã xây dựng được quy trình chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong quy mô<br /> phòng thí nghiệm. Kết quả đánh giá cho thấy quy trình lặp lại với hiệu suất chiết xuất đạt 97 - 98%.<br /> * Từ khoá: Bài thuốc Trúng phong; Chiết xuất hypoxanthin; Quy trình.<br /> <br /> Process of Extracting Hypoxanthine from Trung phong Remedy<br /> Summary<br /> Objectives: To investigate the conformity condition for extracting hypoxanthine from Trung<br /> phong remedy. Objects: Trung phong remedy. Methods: To evaluate factors of extracting<br /> hypoxanthine from Trung phong remedy including extraction method, solvent of extraction, ratio<br /> of feed per solvent (F/S), temperature, time and frequency of extraction; To determinate<br /> hypoxanthine content by HPLC. Results and conclusions: The optimal condition to extract<br /> hypoxanthine from Trung phong remedy was established including: extraction under ultrasonic<br /> 0<br /> in water at 60 C for 60 minutes/times x 2 times with F/S of 1/12. Under this condition,<br /> hypoxanthine-extraction from Trung phong remedy was 97 - 98%.<br /> * Key words: Trung phong remedy; Hypoxanthine extraction; Process.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hiện nay, thuốc y học cổ truyền (YHCT)<br /> đang ngày càng được quan tâm và là<br /> hướng phát triển tiềm năng trong nghiên<br /> cứu dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm<br /> chức năng. Tuy nhiên, với phương pháp<br /> bào chế truyền thống, thuốc YHCT, đặc<br /> biệt dạng thuốc sắc có nhiều nhược điểm<br /> như: cồng kềnh, khó bảo quản và không<br /> <br /> tiện sử dụng [3, 6]. Trong nghiên cứu<br /> hiện đại hóa YHCT, vấn đề được đặt lên<br /> hàng đầu là chứng minh tác dụng của<br /> hoạt chất, chiết xuất từ hoạt chất đó bằng<br /> phương pháp hiện đại, đánh giá hiệu quả<br /> của các hoạt chất đó (bằng các mô hình<br /> dược lý thực nghiệm) trước khi chuyển<br /> sang dạng bào chế mới (viên nén, viên<br /> nang, thuốc cốm…) [6, 7].<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bộ Khoa học Công nghệ<br /> *** Viện Y học Cổ truyền Quân đội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Phạm Văn Hiển (phamvanhien181288@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/01/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 22/03/2017<br /> <br /> 14<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> Bài thuốc Trúng phong gồm các vị<br /> thuốc Địa long (Pheretima), Đậu đen<br /> (Semen Vignae cylindricae), rau Ngót<br /> (Herba Sauropi androgyni), Trần bì<br /> (Pericarpium Citri reticulatae) được sử<br /> dụng trên lâm sàng cho thấy có tác dụng<br /> tốt trong điều trị đột quỵ, nhồi máu não.<br /> Tuy nhiên, bài thuốc quý này vẫn đang sử<br /> dụng chủ yếu dưới dạng viên hoàn hoặc<br /> thuốc sắc, do đó gặp phải những hạn chế<br /> chung của thuốc YHCT. Vì vậy, để góp<br /> phần nâng cao hiệu quả sử dụng bài<br /> thuốc này, cần có nghiên cứu hiện đại<br /> hóa bào chế thành các chế phẩm tiện sử<br /> dụng như viên nén, viên nang, thuốc<br /> cốm... Bước đầu tiên của quá trình này là<br /> chiết xuất hoạt chất từ bài thuốc. Trong<br /> bài báo này, chúng tôi thông báo kết quả<br /> nghiên cứu chiết xuất hypoxanthin (hoạt<br /> chất có trong Địa long và rau Ngót) từ bài<br /> thuốc Trúng phong.<br /> <br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> - Phương pháp chiết xuất: cân chính<br /> xác 5,0 g bột bài thuốc Trúng phong đã<br /> nghiền mịn vào bình nón chiết xuất với<br /> dung môi nhất định trong khoảng thời<br /> gian, nhiệt độ khảo sát với số lần chiết<br /> phù hợp. Gộp các dịch chiết, ly tâm ở<br /> 3.500 vòng/phút x 5 phút. Lọc qua màng<br /> lọc 0,22 µm được dung dịch tiêm sắc ký.<br /> Định lượng hàm lượng hypoxanthin trong<br /> dịch chiết bằng sắc HPLC theo tài liệu<br /> tham khảo [2] có thẩm định lại.<br /> <br /> NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Trong đó:<br /> mhypoxanthin: khối lượng hypoxanthin chiết<br /> được; mBT: khối lượng hypoxanthin có<br /> trong bài thuốc (2 dược liệu).<br /> <br /> 1. Nguyên liệu hóa chất, thiết bị.<br /> Các vị dược liệu trong bài thuốc Trúng<br /> phong gồm Địa long (Pheretima), Đậu<br /> đen (Semen Vignae cylindricae), rau Ngót<br /> (Herba Sauropi androgyni), Trần bì<br /> (Pericarpium Citri reticulatae) đạt tiêu<br /> chuẩn cơ sở (rau Ngót) và tiêu chuẩn<br /> DĐVN IV [1]. Trong đó, Địa long và rau<br /> Ngót chiếm lần lượt 13,2% và 52,6% tổng<br /> khối lượng bài thuốc.<br /> Hóa chất: hypoxanthin chuẩn (≥ 99,0%)<br /> (Hãng Sigma); các hóa chất, dung môi<br /> đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.<br /> Thiết bị: máy chiết siêu âm gia nhiệt<br /> Sineo Ultrawave 1.000; hệ thống phân<br /> tích HPLC gồm bơm cao áp Waters<br /> 1.525, detector UV Water 2.874 và các<br /> thiết bị khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.<br /> <br /> - Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh<br /> hưởng tới hiệu suất chiết xuất gồm:<br /> phương pháp chiết, loại dung môi, tỷ lệ<br /> dược liệu/dung môi, thời gian chiết, số lần<br /> chiết, nhiệt độ chiết.<br /> - Chỉ tiêu đánh giá: hiệu suất chiết xuất<br /> hypoxanthin từ bài thuốc.<br /> Hiệu suất =<br /> <br /> m hypoxanthin<br /> × 100<br /> m BT<br /> <br /> Trong đó hàm lượng hypoxanthin<br /> trong 2 dược liệu được định lượng bằng<br /> HPLC trong dịch chiết 4 lần (đến khi<br /> không còn phát hiện hoạt chất).<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả thẩm định phương pháp<br /> định lượng hypoxanthin trong bài thuốc<br /> Trúng phong.<br /> Trong công bố trước đây [2], chúng tôi<br /> đã định lượng được hypoxanthin trong<br /> dược liệu Địa long (Pheretima). Ở nghiên<br /> cứu này, chúng tôi nhận thấy có thể áp<br /> dụng phương pháp trên để xác định hàm<br /> lượng hypoxanthin trong bài thuốc Trúng<br /> phong. Chúng tôi tiến hành thẩm định lại<br /> phương pháp.<br /> 15<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> Bảng 1: Kết quả thẩm định phương pháp định lượng hypoxanthin trong bài thuốc<br /> Trúng phong bằng phương pháp HPLC.<br /> Chỉ tiêu thẩm định<br /> <br /> Kết quả thẩm định<br /> <br /> Tính chọn lọc đặc<br /> hiệu<br /> <br /> Thời gian lưu của hypoxanthin trên mẫu thử tương ứng với thời gian lưu của píc<br /> hypoxanthin chuẩn. Píc này cân đối, sắc nét và tách hoàn toàn khỏi píc tạp (hình 1)<br /> <br /> Tính tương thích hệ<br /> thống<br /> <br /> Ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (1 µg/ml):<br /> <br /> Đường chuẩn và<br /> khoảng tuyến tính<br /> <br /> Spic = 220.700 ± 2.983 (µV*s); RSD (%) = 1,35%<br /> 2<br /> <br /> Đường chuẩn: Y = 21.526X + 10.960; R = 0,9999<br /> Khoảng tuyến tính: 1 - 10 µg/ml (hình 2)<br /> Chiết bài thuốc (0,38 g) tương tự như [2]. Sử dụng phương pháp thêm chuẩn ở<br /> 3 mức: thấp (LQC; 1,1 µg), vừa (MQC; 5,5 µg), cao (HQC; 11 µg). Độ thu hồi lần<br /> lượt là (% thu hồi ± SD, n = 3): 93,2 ± 1,9%; 95,2 ± 1,5%; 96,5 ± 1,1%<br /> <br /> Độ đúng<br /> <br /> Độ chính xác<br /> <br /> - Trong ngày: phân tích 6 mẫu thử ở cùng một nồng độ. Hàm lượng hypoxanthin<br /> tính toán (n = 6): 7,35 ± 0,10 µg/ml; RSD (%) = 1,40%<br /> - Khác ngày: phân tích 6 mẫu thử ở 3 ngày liên tiếp. Hàm lượng hypoxanthin<br /> tính toán (n = 18): 7,34 ± 1,42 µg/ml; RSD (%) = 1,93%.<br /> <br /> Hình 1: Kết quả đánh giá tính chọn lọc đặc hiệu của phương pháp.<br /> 16<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> <br /> Hình 2: Đường chuẩn định lượng hypoxanthin trong bài thuốc Trúng phong.<br /> 2. Kết quả xác định hàm lượng<br /> hypoxanthin trong bài thuốc Trúng<br /> phong.<br /> Cân chính xác các dược liệu trong bài<br /> thuốc theo đúng tỷ lệ (mỗi mẻ 5,0 g,<br /> tương đương với Địa long 0,66 g, Đỗ đen<br /> 1,32 g, rau Ngót 2,63 g, Trần bì 0,39 g)<br /> vào bình chiết của thiết bị chiết siêu âm,<br /> thêm 50 ml nước chiết siêu âm trong<br /> 2 giờ ở nhiệt độ 600C, ly tâm với tốc độ<br /> 3.500 vòng/phút trong 5 phút. Gạn riêng<br /> dịch chiết. Bã dược liệu chiết tiếp hai lần<br /> như trên. Tập trung toàn bộ dịch chiết vào<br /> bình định mức 200 ml. Bổ sung vừa đủ<br /> thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm<br /> để thu được dung dịch tiêm sắc ký. Ngoài<br /> ra, bã dược liệu tiếp tục được chiết lần<br /> thứ 4, bổ sung vừa đủ thể tích vào bình<br /> <br /> định mức 100 ml để định lượng riêng<br /> nhằm kiểm tra hoạt chất đã được chiết<br /> kiệt hay chưa. Kết quả cho thấy, sau 3 lần<br /> hoạt chất đã được chiết kiệt. Lần chiết 4<br /> không còn phát hiện hoạt chất hypoxanthin<br /> trong dịch chiết. Kết quả: đã xác định<br /> được hàm lượng hypoxanthin trong bài<br /> thuốc Trúng phong là 195,6 ± 3,0 µg/g<br /> tính theo khối lượng dược liệu khô kiệt.<br /> 3. Khảo sát lựa chọn phương pháp<br /> chiết.<br /> Cân chính xác 5,0 g bài thuốc Trúng<br /> phong đã được nghiền mịn, tiến hành<br /> chiết xuất bằng các phương pháp siêu<br /> âm, vi sóng và chiết nóng ở nhiệt độ<br /> 600C, chiết bằng dung môi nước, tỷ lệ<br /> dược liệu/dung môi là 1/10 (g/ml), thời<br /> gian 30 phút, chiết một lần.<br /> <br /> Bảng 2: Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất (n = 3).<br /> Chỉ tiêu đánh giá<br /> Lượng hypoxanthin chiết được (µg/g)<br /> Hiệu suất chiết (%)<br /> <br /> Chiết siêu âm<br /> <br /> Chiết vi sóng<br /> <br /> Chiết nóng<br /> <br /> 132,27 ± 3,94<br /> <br /> 84,02 ± 1,21<br /> <br /> 87,23 ± 2,51<br /> <br /> 67,63<br /> <br /> 42,96<br /> <br /> 44,64<br /> <br /> Khi chiết bài thuốc bằng phương pháp chiết siêu âm, hiệu suất thu được cao nhất<br /> (67,63%). Do vậy, lựa chọn phương pháp chiết siêu âm để thực hiện các khảo sát<br /> tiếp theo.<br /> 17<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> 4. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết.<br /> Tiến hành chiết suất bằng thiết bị que siêu âm Sineo Ultrawave 1.000 ở nhiệt độ<br /> 60 C, thời gian 30 phút, tỷ lệ dược liệu/dung môi 1/10 (g/ml), chiết một lần với các<br /> dung môi nước, EtOH 30%, EtOH 40%, EtOH 50%, EtOH 60%, EtOH 70%.<br /> 0<br /> <br /> luong hypoxanthin<br /> <br /> 132,27<br /> <br /> 100<br /> <br /> Hieu suat chiet<br /> <br /> 100<br /> <br /> 67,63<br /> 50<br /> <br /> 50<br /> 14,6<br /> <br /> 6,33<br /> <br /> 4,36<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 1,71<br /> <br /> 3,24<br /> <br /> 2,23<br /> <br /> 1,89<br /> <br /> 1,71<br /> <br /> Hiệu suất chiết (%)<br /> <br /> Lượng hypoxanthin chiết được (µg/g)<br /> <br /> 150<br /> <br /> 0<br /> 7,47<br /> nuoc<br /> <br /> 0<br /> <br /> EtOH 30% EtOH 40 % EtOH 50% EtOH 60% EtOH 70%<br /> Dung môi chiết<br /> <br /> Hình 3: Ảnh hưởng của dung môi đến chiết xuất hypoxanthin<br /> từ bài thuốc Trúng phong.<br /> Chiết bài thuốc Trúng phong bằng dung môi nước cho hiệu suất cao nhất (67,63%).<br /> Khi sử dụng EtOH để chiết xuất, độ cồn càng cao, hiệu suất thu được càng giảm, điều<br /> này phù hợp với nghiên cứu của Lu Qiwen và CS (2007) [8]. Do vậy, lựa chọn dung<br /> môi là nước để tiếp tục tiến hành các khảo sát tiếp theo.<br /> 5. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến hiệu suất chiết.<br /> Tiến hành chiết xuất với nước, tỷ lệ dược liệu/dung môi 1/10 (g/ml), nhiệt độ 600C,<br /> thời gian chiết 30 phút. Chiết 3 lần, mỗi lần định lượng riêng.<br /> Bảng 3: Ảnh hưởng số lần chiết đến hiệu suất (n = 3).<br /> Thông số<br /> <br /> Lần 1<br /> <br /> Lần 2<br /> <br /> Lần 3<br /> <br /> 132,27 ± 3,94<br /> <br /> 51,50 ± 0,57<br /> <br /> 7,48 ± 0,08<br /> <br /> Hiệu suất chiết từng lần (%)<br /> <br /> 67,62<br /> <br /> 26,32<br /> <br /> 3,82<br /> <br /> Hiệu suất tổng gộp (%)<br /> <br /> 67,62<br /> <br /> 93,94<br /> <br /> 97,76<br /> <br /> Lượng hypoxanthin chiết được (µg/g)<br /> <br /> Sau 02 lần chiết, hiệu suất chiết đạt 93,94%. Nếu chiết thêm lần 3, hiệu suất cũng<br /> chỉ tăng thêm 3,82%, hơn nữa gây tốn kém về thời gian cũng như dung môi, năng<br /> lượng. Vì vậy, lựa chọn chiết xuất 02 lần cho các khảo sát tiếp theo.<br /> 18<br /> <br />