NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) GIAI ĐOẠN GIỐNG

Chia sẻ: Nhu Chau | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:41

Thêm vào BST

Báo xấu

148
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài ”Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống” được thực hiện từ tháng 03/2006 đến 06/2006 nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu của Malachite Green và một số biến đổi sinh hóa trên cá tra. Thí nghiệm gồm hai nồng độ MG gây nhiễm: 0,1mg/l trong 12 giờ và 1mg/l trong 60 phút. Kết quả cho thấy hoạt tính của các men trong não, gan của cá Tra đều bị biến đổi và khả năng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) GIAI ĐOẠN GIỐNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG HẢI TOÀN NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) GIAI ĐOẠN GIỐNG Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN 2006
TÓM TẮT Đề tài ”Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống” được thực hiện từ tháng 03/2006 đến 06/2006 nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu của Malachite Green và một số biến đổi sinh hóa trên cá tra. Thí nghiệm gồm hai nồng độ MG gây nhiễm: 0,1mg/l trong 12 giờ và 1mg/l trong 60 phút. Kết quả cho thấy hoạt tính của các men trong não, gan của cá Tra đều bị biến đổi và khả năng phục hồi lại trạng thái bình thường tuỳ thuộc vào nồng độ và thời gian gây nhiễm MG. Sau 60 ngày thí nghiệm MG vẫn còn tồn lưu trên cá tra (2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii
ABSTRACT “Studying the effect of Malachite Green on some biomarkers and residues in the fingerling stages of catfish (Pangasius hypophthalmus) “ was implemented from March to July 2006. The aim of the study was to determine the changes of some biomarkers and the residues of MG on catfish. The experiment included two treatments, 0.1 mg MG/l in 12 hours and 1 mg MG/l in 1 hours, each applied in 3 replicates. The results showed that the biomarkers activity in brain and liver tissues were changed and restored ability depending on the treatment. After 60 days of decontamination, MG still contaminated on catfish (2.01 ± 1.88 ppb and 1.50 ± 2.59 ppb). Keywords: Malachite Green, biomarker, residue. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iii
MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH CÁC TỪ VIẾT TẮT CHƯƠNG 1 .................................................................................................. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2 .......................................................................................................... 3 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................................... 3 2.1 Sơ lược về Malachite Green............................................................................. 3 2.1.1 Sơ lược về Malachite Green ....................................................................... 3 2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của Malachite Green................................................................................................. 3 2.1.3 Độc tính của Malachite Green .................................................................... 4 2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green ................................................................. 5 2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite Green trên thế giới........................................ 5 Trung tâm HọcTính hình sử dụng Malachite Green ở liệuNam ........................................ 6 2.2.2 liệu ĐH Cần Thơ @ Tài Việt học tập và nghiên cứu 2.3 Ảnh hưởng của Malachite Green...................................................................... 6 2.4 Một số nghiên cứu về chỉ tiêu sinh hóa LPO, ACHE, GST, CAT,G6PD ...................................................................... 7 CHƯƠNG 3: ......................................................................................................... 9 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................. 9 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................... 9 3.1.1 Địa điểm .................................................................................................... 9 3.1.2 Thời gian thực hiện .................................................................................... 9 3.2 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 9 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm..................................................................................... 9 3.2.2 Cá thí nghiệm............................................................................................. 9 3.2.3 Bố trí thí nghiện ...................................................................................... 10 3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu ............................................................ 10 3.2.5 Chuẩn bị mẫu ........................................................................................... 11 3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu ..................................................................... 11 3.3. Xử lí số liệu .................................................................................................. 16 iv
CHƯƠNG 4 ........................................................................................................ 17 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 17 4.1 Biến động nhiệt độ, oxy hoà tan (DO) và pH trong thời gian gây nhiễm Malachite Green ........................................................................................... 17 4.2 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống ..................................................... 19 4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green .............................. 20 4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green ...................................................................... 21 4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green ........................................................... 22 4.3 Sự biến đổi của các chỉ tiêu sinh hoá trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm................................................................................. 23 4.3.1 Hoạt tính của Acethylcholine (AchE) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ............................................................................... 23 4.3.2 Hàm lượng của Lipid peroxidation (LPO) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ................................................................................ 25 4.3.3 Hoạt tính của men Gutatehion-S-transferas (GST) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ...................................................................... 26 Trung tâm HọcHoạt tính củaCầnGlucose-6-phosphate dehydrogenase và nghiên cứu 4.3.4 liệu ĐH men Thơ @ Tài liệu học tập (G6PD) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ..................................... 27 4.3.5 Hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ................................................................................ 28 CHƯƠNG 5 ........................................................................................................ 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................ 30 5.1 Kết luận ......................................................................................................... 30 5.2 Đề xuất ......................................................................................................... 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 31 PHỤ LỤC............................................................................................................ 34 v
DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn .................................................................................... 4 Bảng 2: Quá trình phân tích AchE ................................................................. 12 Bảng 3: Cách pha đường chuẩn MDA ........................................................... 13 Bảng 4: Quá trình phân tích GST................................................................... 14 Bảng 5: Quá trình phân tích G6PDH.............................................................. 14 Bảng 6: Quá trình phân tích CAT .................................................................. 15 Bảng 7: Quá trình phân tích Prôtêin............................................................... 16 Bảng 8: Nhiệt độ trong quá trình gây nhiễm MG .......................................... 17 Bảng 9: pH trong quá trình gây nhiễm MG ................................................... 18 Bảng 10: Oxy hoà tan trong quá trình gây nhi ễm MG ................................... 18 Trung tâm Học liệu ĐH Cần LMG theo thời gian thí nghiệm ........................... 19 cứu Bảng 11: Sự tồn lưu MG + Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên Bảng 12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm........................................ 21 Bảng 13: Sự tồn lưu LMG theo thời gian thí nghiệm ..................................... 22 Bảng 14: Biến đổi hoạt tính của AchE trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 23 Bảng 15: Biến đổi hàm lượng của LPO trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu ........................................................................ 25 Bảng 16: Biến đổi hoạt tính của GST trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 26 Bảng 17: Biến đổi hoạt tính của G6PD trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 27 Bảng 18: Biến đổi hoạt tính của CAT trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 28 vi
DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Sự tồn lưu MG và LMG theo thời gian thí nghiệm.................................. 20 Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm .................................. 22 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vii
CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long LMG Leucomalachite green MG Malachite Green AchE Acethylcholine LPO lipid peroxidase GST Glutathione S-transferase G6PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase CAT Catalase UBND Ủy ban nhân dân EU Thị trường chung Châu Âu BTS Bộ Thủy Sản HAE 4- hydroxyalkenals Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu MDA malondialdehyde DCP 2,4-dichlorphenol MC-RR micocystin-RR TCA Trichloroacetic acid DMSO Dimethyl sulfoxide TBA Thiobarbituric acid minimum DTNB 5,5 dithiobis 2nitrobenzoic acid CDNB 50 mM 1-chloro 2,4-dinitro benzene GSH Glutathione 50mM G-6-P D-glucose 6 phosphat NADP nicotin amiđe adenine đinucleotide phosphate LOOP lipid hydrerxdes viii
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 600.000 ha diện tích mặt nước ngọt, là nơi có tiềm năng rất lớn cho việc nuôi các loài cá nước ngọt như: Cá tra, basa, vồ đém, hú, tra bần…trong đó cá tra (Pangasius hypophthalmus) là đối tượng được nuôi chính và truyền thống. Đối tượng này được người nuôi ưa chuộng vì có những ưu điểm như: dễ nuôi, tăng trọng nhanh, kích cở lớn dễ thích nghi với môi trường khắc nghiệt, dễ sử dụng thức ăn, có thể nuôi ở mức độ thâm canh cao. Trong những năm gần đây, do việc quảng bá, thúc đẩy xuất khẩu mặt hàng cá tra của ngành thuỷ sản nên uy tín, số lượng và thị trường của mặt hàng cá Tra Việt Nam được nâng cao rất nhiều. Theo số liệu thống kê của 2 tỉnh An Giang, Cần Thơ năm 2005, tình hình nuôi cá tra ở khu vực đã có bước phát triển đáng kể, sản lượng loài cá này trong khu vực An Giang và Cần Thơ năm 2004 là trên 160.000 tấn (Cục thống kê An Giang và Cục thống kê Cần Thơ, 2005). Từ đó kỹ thuật nuôi phát triển rất nhanh, năng suất sản lượng gia tăng đáng kể, tăng cường nuôi thâm canh, mật độ thả nuôi tăng (120-130 con/m3 trong nuôi bè và 25-35con /m2 trong nuôi ao đất (Nguyễn Chính, 2005). Tuy nhiên vì muốn gia tăng năng suất, sản lượng mà người nuôi đã thả mật độ dày Trung tâm Học liệu thừa dẫn đến Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên dẫn đặc, cho thức ăn ĐH Cần môi trường bị ô nhiễm, dịch bệnh thường xảy ra cứu đến việc sử dụng các loại thuốc, hoá chất trong phòng trị bệnh cho thuỷ sản nuôi là vấn đề cần thiết và hợp lý và được sử dụng nhiều dẫn đến lạm dụng (Nguyễn Thị Phương Nga, 2004). Đặc biệt là thường xuyên sử dụng một số hóa chất cấm sử dụng như là Malachite Green. Chất Malachite Green được dùng rất phổ biến trên thế giới trị các bệnh nấm bên ngoài và kí sinh trùng trong ương nuôi cá và các loài sò hến (nhuyễn thể). Đó là một loại thuốc trị nấm rất công hiệu và thường xuyên dùng để tẩy trùng các bể ương cá giống. Chất Leucomalachite green (LMG) là chất được tạo thành trong quá trình chuyển hóa của Malachite Green và thường tồn dư trong cá một thời gian dài, ngay Malachite Green không còn tồn lưu nữa (CFIA, 2005). Chính vì sự tồn lưu này ảnh hưởng đáng kể đến ngành xuất khẩu thủy sản sang các nước Châu Âu, Mỹ, Canada, Nhật,…Cụ thể là cuối năm 2004 hàng chục container cá da trơn, cá rô phi và cá trê xuất khẩu của các doanh nghiệp An Giang, Đồng Tháp,…bị trả về do phát hiện nhiễm chất Malachite Green (www.vietnam.net, 28/2/2005). Ngoài ra việc sử dụng hoá chất còn ảnh hưởng đến một số biến đổi sinh hoá gây ức chế đến hoạt động sống của cá. Do đó đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống” được thực hiên là rất cần thiết, nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu và 1
đào thải của Malachite Green trên cá tra và một số biến đổi sinh hóa. Từ đó đề xuất giải pháp hợp lý để sản xuất sản phẩm có chất lượng và an toàn. Nội dung nghiên cứu: • Ảnh hưởng của sử dụng Malachite Green lên sự biến đổi Acetylcholine, lipid peroxidation, Glutathione S-transferase, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Catalase trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở giai đoạn giống. • Phân tích sự tồn lưu Malachite Green trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở giai đoạn giống. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 SƠ LƯỢC VỀ MALACHITE GREEN 2.1.1 Sơ lược về Malachite green Malachite Green ( MG) có tên hóa học là Triphenylmethane. MG là một loại bột rất mịn có màu xanh được dùng để nhuộm tơ, vải, giấy, da. MG cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn và bào tử của nó. Từ lâu MG được xem là chất diệt nấm ( loại saprolegnia ssp ) và diệt ký sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa). MG khác với sulfate đồng copper sulfate (CuS04) mà còn gọi là phèn xanh dùng để diệt ốc, diệt nấm và rong rêu trong nông nghiệp. MG đã được giới nuôi trồng thủy sản trên thế giới sử dụng một cách rộng rãi từ lâu để phòng và trị bệnh cho cá tôm và hến. Tại Canada trước 1992 các trại sản xuất cá giống cũng thường sử dụng MG để ngăn ngừa trứng cá bị nhiễm nấm. Ngày nay Canada cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới trong đó có Trung Quốc và Việt Nam đều nghiêm cấm việc sử dụng chất MG trong việc nuôi trồng thủy sản. Chloramphenicol, Nitrofurans , xanh Malachite được liệt kê trong danh mục các chất cấm sử dụng của Bộ Thủy Sản Việt Nam. Tại VN, MG vẫn còn được các hộ nuôi trồng thủy sản sử dụng để vệ sinh ao hồ, tắm cá trước khi thả chúng vào Trung tâm Học liệuđích ngừa cá bị nhiễm nấm hoặc nhiễm ký tập trùng. Khi vào cơ lồng nhằm mục ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học sinh và nghiên cứu thể cá, MG sẽ bị phân hủy ra thành chất chuyển hóa (metabolite) là Leucomalachite Green (LMG). Thời gian đào thải của MG nhanh, ngược lại chất LMG có thể tồn tại trong 1 thời gian rất lâu dài trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm MG.( www.khoahoc.net,22/12/2005) 2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của Malachite green. 3
Công thức cấu tạo [ __ ] [ / \__N(CH2)2 ] [ __ / \__/ ] _ [ / \__C __ + ] Cl [ \__/ \ / \__N (CH2)2 ] [ \__/ ] [ ] Công thức phân tử : C23H25N2.CL Một số tên thường gọi: • Malachite green chloride • C.i. Basic green 4 • Benzaldehyde green • n-(4-((4-(dimethylamino)phenyl) phenylmethylene)-2,5-cyclohexadiene- 1- ylidene) -n-methyl-chloride • Acryl brilliant green • Aniline green Trung tâm•Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Aizen malachite green 2.1.3 Độc tính Malachite green. Độc tính của MG có liên hệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá tôm có thể chịu đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng sẽ dẫn đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng MG vào lúc sáng sớm khi nhiệt độ nước chưa tăng cao là tốt nhất. Đặc biệt trong các tháng mùa hè nóng bức, thời gian tiếp xúc khi xử lý MG nên giảm xuống. (Lê Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004). Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn (Ictarulus punctatus) của Bills và ctv (1997) được trình bày ở bảng sau: Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn LC50 (mg/l) pH Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) 0,4 7,5 22 6 1,72 8 12 6 1,3 8 12 6 0,286 8 12 24 0,238 7,5 22 6 0,519 9,5 12 6 Kết qủa này cho thấy nhiệt độ càng tăng thì độc tính của MG càng tăng. pH càng cao thì độc tính của MG càng cao. 4
Một nghiên cứu về độc tính của MG và LMG được tiến hành trong thời gian 2 năm của Trung tâm Nghiên cứu Độc tố Quốc gia Hoa kỳ cho thấy MG và LMG làm hại gan, làm biến đổi tuyến giáp trạng, gây ra tình trạng mất máu, làm đột biến thay đổi gene (mutagenic) và gây ung thư (carcinogenic) trên loài chuột thí nghiệm. Qua việc thẩm định các kết quả trên, giới khoa học đưa ra kết luận rằng MG và LMG là 2 chất nguy hại có tiềm năng gây ung thư cho người. (Sở Nông Nghiệp An Giang, 2/2/2005). Năm 2002 Canada cũng như nhiều quốc gia khác đã nhận thấy chất Malachite Green có thể là một mối đe dọa cho sức khỏe nên bắt đầu đề ra những chương trình kiểm nghiệm MG ở một số loại cá tôm bán ở thị trường. Các quốc gia trong khối Liên minh Châu Âu và Châu Úc ấn định giới hạn tồn lưu tối đa của MG và LMG trong sản phẩm thủy sản là 2 ng/g (ppb). Hoa kỳ và Canada thì cho áp dụng nguyên tắc zero tolerance, nghĩa là không chấp nhận sự hiện diện của bất kỳ 1 dư lượng nào dù là thật thấp của MG và LMG. (www.khoahoc.net,22/12/2005). Trước những tác hại có thể gây ra đối với sức khỏe con người và nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm, đáp ứng yêu cầu khắt khe của thị trường xuất khẩu thủy sản, theo chỉ thị của Bộ Thủy Sản 7/3/2005 về việc ngừng sản xuất, tiêu thụ và sử dụng MG trong nuôi trồng thủy sản và đề nghị tất cả các hộ nuôi thủy sản không được sử dụng MG để phòng và trị bệnh cho thủy sản. 2.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG MALACHITE GREEN Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite green trên thế giới Trong các thập niên vừa qua ngành nuôi trồng thủy sản thế giới đã có những bước tiến bộ vượt bậc. Do việc áp dụng kỹ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm cho thủy sản nuôi chết hàng loạt, đòi hỏi người nuôi phải tìm biện pháp khắc phục, trong đó việc sử dụng thuốc, hóa chất trong việc phòng và trị bệnh là biện pháp hữu hiệu. Tháng 6/2005, các cơ quan chức năng Trung Quốc đã phát hiện thấy một vài tỉnh vẫn còn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay MG vẫn được sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi như một chất diệt nấm. Nguyên nhân là do loại chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dễ mua. ( www.vietnam.net). Theo Bộ Nghề Cá và hàng hải Hàn Quốc (MMAF), MG đã được tìm thấy trong các trại nuôi cá hồi và cá chép ở tám vùng của Hàn Quốc. Trong các ngày từ 15/9/2005 đến 3/10/2005, Cục thanh tra chất lượng thủy sản quốc gia Hàn Quốc (NEPQIS) đã tiến hành kiểm tra khắp các trại nuôi cá nước ngọt và nước lợ trên cả nước và đây là lần đầu tiên Hàn Quốc phát hiện thấy MG trong các trại nuôi cá ở nước này. Lượng hóa chất tìm thấy dao động từ 0,1-3 ppm (www.Intrafish.com, 6/10/2005). 5
2.2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green ở Việt Nam. Sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm đã gây thiệt hại lớn về tài chính cũng như uy tín hàng thủy sản Việt Nam. Nhà nước và các cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt Nam đã đưa ra và thường xuyên có rà soát, bổ sung các quy định tương đối chặt chẽ về việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng, ổn định và phát triển xuất khẩu, đảm bảo nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững. Tuy nhiên việc chấp hành các quy định của nhà nước là chưa triệt để vì thỉnh thoảng vẫn còn một số lô hàng thủy sản Việt Nam nhập khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm hoặc hoặc vượt quá giới hạn đối với những kháng sinh cho phép sử dụng có giới hạn, trong chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc hại trong thủy sản nuôi do Nafiqaved thực hiện năm 2003 và 2004 thỉnh thoảng vẫn phát hiện mẫu thủy sản, mẫu nước môi trường nuôi nhiễm thuốc, hóa chất bị cấm sử dụng như Choramphenicol, các dẫn xuất Nitrofuran, gần đây và theo diện rộng là tồn lưu Green Malachite (NAFIQAVED, 2004). Về tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra công nghiệp ở Đồng Tháp (Phạm Thanh Tuấn, 2004) ghi nhận được có 90 loại thuốc, hóa chất được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản với các mục đích: diệt tạp, xử lý nước, trộn vào thức ăn để phòng và trị bệnh. Riêng kháng sinh trị bệnh cho cá có 58 loại thì hầu hết nằm trong danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại ở dạng nguyên liệu và nguồn gốc không rõ ràng, riêng chất MG là chất nằm trong danh mục cấm nhưng vẫn được người nuôi Trung tâmdụng ở đây. ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu sử Học liệu Theo một số hộ nuôi cá tra ở khu vực Thốt Nốt, Cần Thơ, An Giang thì cho biết không sử dụng MG trong quá trình nuôi nhưng qua phân tích thì hiện hiện đến 10/64 mẫu trong cá thương phẩm, và nồng độ tồn lưu là 2 - 4,9 ppb. Đối với cá đang nuôi thì hiện diện 9/30 mẫu được kiểm tra, nồng độ tồn lưu là 2,4 - 4,18 ppb. (Nguyễn Chính, 2005). 2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN Theo quy định của Bộ Thủy Sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên. Viện nghiên cứu và phát triển thủy sản Hàn Quốc –NFRDI (2002) thử nghiệm tồn lưu của 2 chất Oxytetracyline HCl và Sulfadimethoxine trên đối tượng cá catfish cho kết quả thời gian đào thải là sau 30 ngày, đối với lươn sự đào thải của Ciprofloxacin và Ofloxacin là sau 35 ngày. Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu trong cá chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới 100 ngày, với cá hồi chấm là không dưới 10 tháng (Raoul và ctv, 2002). Theo quá trình theo dõi và phân tích sự tồn lưu MG trên cá tra để trị bệnh kí sinh trùng cho thấy (vietlinh.com.vn): Sau 1 tháng sử dụng MG : tồn lưu 35ppb Sau 2 tháng : mức phát hiện còn 10ppb 6
Sau 3 tháng : MG = 0. Nhưng dẫn xuất của MG là LMG thì vẫn còn. Vậy thời gian có thể làm MG không tồn lưu trong thịt cá là rõ ràng. Việc tích lủy MG mang tính cộng dồn. Sau khi cá nhiễm MG sẽ tích lủy dần trong thịt và tế bào mỡ, đặc biệt trong mỡ luôn tích lủy hàm lượng MG cao gấp nhiều lần so với trong thịt. Như vậy nếu tích lủy ở mức độ cao có thể ảnh hưởng xấu đến người tiêu dùng sau khi ăn cá bị nhiễm. 2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ CHỈ TIÊU SINH HÓA Lipid peroxidase (LPO), Acetylcholinestrease (AChE), Catalase (CAT), Glutathione S- transferease (GST), Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). Acelthylcholine là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân dẫn truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv, 1961) Lipid peroxidation chất có liên quan đến các tác nhân oxy hóa trong cơ thể thường góp phân vào các tiến trình phát sinh bệnh. Khi oxy hóa lipid nó liên quan đến sự hấp thụ allylic hydrogen bằng việc tạo ra gốc hydroperoxyl để hình thành nên lipid hydroperoxides (LOOPs). LOOPs tạo ra malondialdehyde (MDA) và 4- hydroxyalkenals (HAE) khi phân hủy (Amad và ctv, 2000) Trung tâm nghiên liệucủa Bhavan và GeraldineTài liệu nồng độ thấp 10.6 - 32.0 ng/l Từ Học cứu ĐH Cần Thơ @ (2000) ở học tập và nghiên cứu Endosulfan có thể làm thay đổi về sinh hoá và sinh lý bên trong cơ thể của Macrochrachium malcolmsonii giai đoạn giống, làm sụt giảm hoạt tính của enzyme Acetylcholinesterase (AChE), hàm lượng protein trong máu. Theo Pandey và ctv (2000) nghiên cứu về cơ chế gây độc của endosulfan làm gia tăng LPO. Tác giả tiến hành thí nghiệm trên cá Channa punctatus (23 – 50g/con), khi cho tiếp xúc với endosulfan nồng độ thấp 5ug/l, kết quả LPO gia tăng có ý nghĩa so với đối chứng ở các cơ quan gan, thận, mang. Sự gia tăng của LPO kéo theo các nhân tố chống oxy hoá cũng tăng theo. Theo tác giả, sự thay đổi hoạt tính của các nhân tố chống oxy hóa và chỉ số của LPO có thể là chỉ thị sinh học. Như vậy, có thể dựa và sự thay đổi của LPO để đánh giá sự tác động của endosulfan lên các đối tượng khác. Elif Ozan Oruc (2000) tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của 2,4D và azinphosmethyl lên các men chống oxy hoá và lipid peroxidase ở gan cá rô phi (Oreochromis niloticus). Khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp 2,4-D ở nồng độ 27ppm và 0,03ppm azinphosmethyl trong các khoảng thời gian 24, 48, 72 và 96 giờ. Kết quả cho thấy cá rô phi có khả năng chống lại stress oxy hoá bằng các cơ chế kháng oxy hoá và chống lại sự gia tăng của hàm lượng lipid peroxydase. Hoạt tính G6PD tăng so với đối chứng khi sử dụng riêng lẻ 2,4-D sau 24 giờ, ở 96 giờ không ảnh hưởng đến hoạt tính G6PD, trong khi đó khi sử dụng kết hợp làm tăng G6PD đáng kể. 7
Theo Horsberg và ctv.(1989) thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ (Dichlorvos) gây ức chế men AchE trong não cá hồi (Salmon) mạnh nhất ở nồng độ tồn lưu trong cơ thể cao nhất. Ông cũng cho biết việc xác định hoạt tính của men AchE có thể tin cậy hơn việc phân tích lượng thuốc tồn lưu khi chẩn đoán việc cá hồi có bị nhiễm độc thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ hay không. Theo Zinkl và ctv. (1980) và Fleing à Grue (1981) thì nếu như hoạt tính của men AchE trong não giảm 20% so với đối chứng thì cơ thể xem như là cá có tiếp xúc với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ. Chính do sự rất nhạy cảm về hoạt tính của men AchE đối với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ mà có thể dùng đo hoạt tính của men như là một công cụ trong việc đánh giá môi trường có bị nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ (FanCey và ctv. 1987, Morgan và ctv. 1990) Alexander và ctv. 19..) dã nghiên cứu và đề nghị một phương phát đơn giản và cho kết quả nhanh qua việc do tỉ lệ hoạt tính của men AchE để biết cá nhiễm độc thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ như parathion, malathin,.. Weiss ( 1958) nghiên cứu sự ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên cá và thấy rằng mức độ hoạt hóa của AchE trong não bị ức chế tùy thuộc vào nồng độ thuốc. Ở nồng độ 500mg/kg của Folidol 600 (Methyl parathino làm AchE trong huyết tương của cá bị ức chế 90% sau 4h thí nghiệm duy trì mức ức chế này trong 4 ngày vài hồi phục 80- 90% múc bình thường sau 8-10 ngày và đạt được mức bình thường sau 35 ngày Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu (Silva và ctv 1993). Hiran M. Dutta và Dane. A. Arends (2003). Thí nghiệm ảnh hưởng của endosufan lên hoạt động AchE trên não của cá bluegill sunfish (Lepomis macrochius). Thí nghiệm được tiến hành gây nhiễm trong các khoảng thời gian là 0, 24, 48, 72, 96 giờ và 1 tuần ở nồng độ 1.0 µg/l (dựa vào LC50 của endosulfan đối với cá bluegill sunfish là 1,2 µg/l ). Kết quả cho thấy hoạt động của AchE trong não giảm tương ứng là 0%, 3,57%, 12,65%, 14,23%, 16,31% và 23,11%. J. Zhang và ctv (2004) nghiên cứu sự ảnh hưởng của độc tính 2,4-dichlorphenol (DCP) trên gan của cá Carassius auratus ở nồng độ 0,005mg/l 2,4-DCP sau 40 ngày hoạt động của CAT không có sự biến đổi, nhưng ở nồng độ 0,01- 1,0mg/l hoạt dộng của CTA tăng cao hơn so với đối chứng. Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghiệm sự ảnh hưởng của micocystin-RR (MC- RR) đến hoạt động của các men trên gan, mang, não của cá Corydoras paleatus. Tiến hành gây nhiễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µgL-1 sau 24 giờ. Kết quả cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µgL-1 thì LPO trong não có sự thay đổi trong khi đó ở gan, mang vẫn bình thường. Đối với hoạt tính GST ở gan, não giảm ở nồng độ 0,5µgL-1 và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm. 8
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu : 3.1.1 Địa điểm: Khoa Thủy Sản -Trường Đại Học Cần Thơ 3.1.2 Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2006 đến 06/2006 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm Bể thí nghiệm có thể tích 0,5 m3 Xô nhựa, cân tiểu ly Bộ đồ giải phẩu (kéo, nhíp, dao) Pipet, ống đong Máy ly tâm, máy so màu quang phổ (Thermo, Anh sản xuất) Dụng cụ, thiết bị, phương tiện dùng trong thí nghiệm được sử dụng từ phòng thí nghiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ. Trung tâm Họcthí nghiệm: Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hóa chất liệu ĐH Malachite Green 80% hoạt chất (Merck) Từ kết quả khảo sát thực tế tại Thốt Nốt, Cần thơ, người nuôi cá thường sử dụng MG nồng độ 0,05-0,1ppm tắm cá trong thời gian 12 giờ hoặc tắm ở nồng độ cao 1- 2ppm trong thời gian 30-60 phút mục đích trị bệnh nấm thủy mi cho cá Tra. Ngoài ra, một số hộ dân tắm cá bằng MG nồng độ 0,1-0,2ppm trong thời gian 30-60 phút hoặc kết hợp với CuSO 4 0,5ppm và MG 0,01-0,02ppm trong thời gian 15-30 phút. Căn cứ vào thực tế trên, sử dụng nồng độ 1ppm tắm cá trong 60 phút và nồng độ 0,1 ppm tắm cá trong 12 giờ được chọn thí nghiệm. Phương pháp pha Malachite Green thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1g MG cho vào 1lít nước cất, khuấy đều bằng khuấy từ. Sau đó định lượng lượng nước trong mỗi bể. Mỗi bể chứa 410 lít nước. - Nồng độ 0,1 mg/l (0,1 ppm): lấy 41 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít nước - Nồng độ 1,0 mg/l (1,0 ppm): lấy 410 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít nước. 3.2.2 Cá thí nghiệm Cá được mua tại trại cá giống tại Cần Thơ kích cỡ từ 20 - 30g. Cá có màu sắc sáng, khỏe mạnh, không bị dị tật, không có dấu hiệu bệnh tật . 9
3.2.3 Bố trí thí nghiện Nguồn nước ngọt sử dụng cho thí nghiệm cấp từ nước máy và nước giếng đã được lọc tại Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức. Hai nghiệm thức có nồng độ gây nhiễm MG là 0,1ppm và 1 ppm và 1 nghiệm thức đối chứng. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm gồm 9 bể (thể tích 500 lít) chứa 410 lít nước, mỗi bể bố trí 50 con. Nghiệm thức 1: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 0,1ppm trong thời gian 12 giờ. Nghiệm thức 2: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 1ppm trong thời gian 1 giờ. Nghiệm thức 3: (đối chứng): không gây nhiễm Malachite green. 3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu Hệ thống thí nghiệm được sục khí liên tục. Thức ăn: Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn viên có hàm lượng đạm là 28%, mỗi ngày cá được cho ăn 2 lần (8h, 16h) . Các yếu tố nhiệt độ, oxy hòa tan, pH được theo dõi 2 giờ 1 lần trong 2 ngày đầu thí nghiệm để xem ảnh hưởng của các yếu tố này đến độc tính của MG. Trung tâmThu mẫu phânĐH sự tồn lưu của MG Tài liệu họcthời gian nghiên cứu ü Học liệu tích Cần Thơ @ trong cá tra theo tập và Nhiễm Không nhiễm Ngày 0 Ngày7 Ngày 30 Ngày 60 Tiến trình thí nghiệm và thu mẫu Ngày 0: mẫu cá thu ngay sau khi kết thúc gây nghiễm Ngày 7: mẫu cá thu 7 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước Ngày 30: mẫu cá thu 30 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước Ngày 60: mẫu cá thu 60 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước ü Thu mẫu phân tích sự biến đổi thành phần sinh hoá trên não, gan cá tra dưới tác động của MG theo thời gian. Nhiễm Không nhiễm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 1: mẫu cá trước khi gây nhiễm MG Lần 2: mẫu cá sau khi kết thúc gây nhiễm MG 10
Lần 3: mẫu cá 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm MG Lần 4: mẫu cá 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm MG Mẫu nước sau khi thu được trữ đông -20 độ cho đến khi phân tích. Mẫu cá được giải phẩu lấy gan và não sử dụng cho phân tích sinh hóa, giữ nhiệt độ -80 độ đến khi phân tích, phần còn lại được xây nhuyễn và giữa nhiệt độ -20 độ đến khi phân tích Mẫu phân tích Malachite green được phân tích tại Trung Tâm Quản Lý Chất Lượng và Thú Y Thuỷ Sản – Vùng 6. Phương pháp phân tích MG (Tav.Chim.aliment.hyg. 88,293-304, 1997 AOAC Vol 78, No.6, 1997) dựa trên hệ thống sắc kí HPLC với đầu dò huỳnh quang với giới hạn phát hiện (LOD) là 1ppb. 3.2.5 Chuẩn bị mẫu Mẫu não, gan giải đông và trử lạnh trong nước đá Cân trọng lượng mẫu (A) Nghiền mẫu trong dung dịch phosphate 50mM KH 2PO4/K2HPO4 50mM (pH=7.5) (1:5 w/v) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Cân mẫu (bao gồm mẫu và dung dịch đệm) (B) Mẫu phân tích (AchE, CAT, GST, G6PD ) (D) Mẫu phân tích LPO(C) Ly tâm 10.000 g (10 phút, 4 oC) Trữ -80oC đến khi phân tích Lấy phần nổi (trữ -80oC đến khi phân tích ) 3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu: Phân tích Acetylcholinestrease (AchE) Nguyên tắc: Hoạt tính của AchE được xác định theo phương pháp của Ellman và ctv (1961). Phương pháp này sử dụng acetylthiocholine iodide (ATChI) như là cơ chất của AchE. ATChI bị phân hủy tạo thành thiocholine và acetate bởi AchE và thiocholine phản ứng với dithiobisnitrobenzoate (DTNB) tạo ra sản phẩm có màu vàng. Cường độ màu dần đậm theo thời gian và hoạt tính của AchE được đo bằng máy so màu quang phổ. 11
Phương trình phản ứng minh họa AchE Acetylthiocholine iodide thiocholine + acetae Thiocholine + dithiobisnitrobenzoate sản phẩm có màu vàng Quá trình phân tích: Chuẩn bị hóa chất: - DTNB 167µM: 66.1mg/ml sodium phosphate 50mM, pH = 7.5 - Acetylthiocholine iodine (cơ chất) 30mM: 8,67mg Acetylthiocholine iodine/1ml sodium phosphate, pH = 7.5 Bảng 2: Quá trình phân tích AchE Hóa chất Mẫu trắng (µl) Mẫu (µl) DTNB ( 150 µM nồng độ cuối) 800 800 Sodium phosphate 150 100 Mẫu / 50 Cơ chất (1.5mM nồng độ cuối) 50 50 Hoạt tính AchE được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 412 nm trong 5 phút Công thức tính Abs * pha loãng Trung tâm Học= liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu R ---------------------------------------------------- (thể tích mẫu (ml) * 0.0136)/protein (mg/ml) R = số mole cơ chất thủy phân/phút/mg protein 0.0136 là hệ số Acetylthiocholine iodide chuyển thành thiocholine và acetate. Lipid peroxidation Nguyên tắc LPO được xác định thông qua lượng thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) trong mẫu nghiền theo phương pháp của Fatima và ctv (2000), có bổ sung. Sử dụng, 500 µl mẫu nghiền với 500µl trichloroacetic acid (TCA, Sigma) 5% và 500µl 0.67% thiobarbituric acid (TBA, Sigma). Sau khi ủ hỗn hợp trong 15 phút, đem ly tâm ở 3000 rpm trong 10 phút ở 4°C, lấy phần nổi. Sau đó cho phần nổi vào ống thuỷ tinh đun trong nước sôi 10 phút. Tiếp đến lấy ống thuỷ tinh ra, làm mát ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ được xác định ở 535nm bằng máy so màu quang phổ. 12