Nghiên cứu sự phát triển phôi sau sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015<br /> <br /> NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN PHÔI SAU SINH THIẾT<br /> ĐỂ CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN TRƢỚC CHUYỂN PHÔI<br /> Nguyễn Thanh Tùng*; Nguyễn Ngọc Diệp*; Dương Đình Hiếu*<br /> Nguyễn Đình Tảo*; Quản Hoàng Lâm*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: khảo sát sự phát triển phôi sau sinh thiết. Đ i tượng: 50 phôi ngày 3 và 20 phôi túi<br /> đƣợc sinh thiết. Phương pháp: nghiên cứu tiến cứu mô tả. Kết quả: 32/50 phôi ngày 3 sau sinh<br /> thiết phát triển thành phôi túi (64%). Tỷ lệ sống sau rã đông của 20 phôi túi sinh thiết đƣợc đông<br /> lạnh bằng phƣơng pháp thuỷ tinh hoá đạt 95%. Kết luận: sinh thiết một phôi bào của phôi giai<br /> đoạn phân chia ngày 3 không ảnh hƣởng đến sự phát triển phôi tại ngày 4 và 5. Phôi túi sinh<br /> thiết đƣợc đông lạnh bằng phƣơng pháp thuỷ tinh hoá có tỷ lệ sống cao sau rã đông.<br /> * Từ khóa: Phôi túi; Phôi ngày 3; Sinh thiết; Tỷ lệ sống sau rã đông; Chuyển phôi; Chẩn đoán<br /> di truyền.<br /> <br /> Study on Embryo Development after Biopsy for Genetic Diagnosis<br /> prior Embryo Transfer<br /> Summary<br /> Objective: To investigate the invitro development of embryos after biopsy. Subjects: 50 embryos<br /> on day 3 and 20 blastocysts were biopsied. Research method: Description progressive<br /> research. Result: At day 5, 32 of 50 embryos after biopsy reached the blastocyst stage (64%).<br /> The survival rate of post-thawing 20 biopsied blastocysts was 95%. Conclusion: The one-cell<br /> biopsy from cleavage embryo at day 3 did not affect the embryo development on day 4 and day<br /> 5. By vitrification, the post - thawing survival rate of the biopsied blastocyst was high.<br /> * Key words: Blastocyst; Day 3 embryo; Biopsy; Post-thawing survival rate; Embryo transfer;<br /> Genetic diagnosis.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm<br /> đóng một vai trò quan trọng trong lĩnh vực<br /> hỗ trợ sinh sản và ngày càng đƣợc phát<br /> triển rộng khắp trên thế giới. Tuy nhiên, tỷ<br /> lệ thành công trong hỗ trợ sinh sản mới<br /> chỉ đạt khoảng 30 - 40%, lĩnh vực này còn<br /> <br /> nhiều vấn đề cần đƣợc tiếp tục nghiên cứu.<br /> Hiện nay, hầu nhƣ việc lựa chọn phôi<br /> đều dựa trên những tiêu chuẩn về hình<br /> thái của phôi. Tuy nhiên, việc đánh giá về<br /> hình thái chƣa phản ánh đầy đủ chất<br /> lƣợng thực của phôi, nếu chỉ dựa vào<br /> các thông số về hình thái thì kết quả thụ<br /> tinh ống nghiệm vẫn còn những hạn chế.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thanh Tùng (tung_ttcnp@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 06/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/06/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 08/07/2015<br /> <br /> 45<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015<br /> <br /> Để nâng cao tỷ lệ thành công và trẻ sinh<br /> sống khoẻ mạnh khi thụ tinh trong ống<br /> nghiệm, việc chẩn đoán di truyền trƣớc<br /> chuyển phôi (Preimplantation Genetic<br /> Diagnosis - PGD) và sàng lọc di truyền<br /> trƣớc chuyển phôi (Preimplantation Genetic<br /> Screening - PGS) là một trong những yêu<br /> cầu quan trọng, cấp thiết và thực tiễn. Để<br /> thực hiện kỹ thuật này, trƣớc tiên cần<br /> sinh thiết phôi, cung cấp vật liệu di truyền<br /> cho chẩn đoán. Đây là kỹ thuật xâm lấn<br /> phôi có thể ảnh hƣởng đến sự phát triển<br /> của phôi sau sinh thiết. Do vậy, chúng tôi<br /> tiến hành nghiên cứu này nhằm: Khảo sát<br /> sự phát tri n phôi sau sinh thiết.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 70 phôi ngƣời còn dƣ khi thụ tinh trong<br /> ống nghiệm, chia thành 2 nhóm:<br /> - Nhóm I: 50 phôi ngày 3.<br /> - Nhóm II: 20 phôi ngày 5.<br /> * Tiêu chuẩn lựa chọn phôi đ sinh thiết:<br /> - Phôi ngày 3 có ít nhất 6 phôi bào, tỷ lệ<br /> mảnh vỡ bào tƣơng < 10%.<br /> - Phôi ngày 5 đạt tiêu chuẩn 3AA, 3AB [1].<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang.<br /> * K thuật sinh thiết phôi:<br /> - Chuẩn bị:<br /> + Kính hiển vi soi ngƣợc trang bị bộ vi<br /> thao tác có gắn hệ thống laser.<br /> <br /> trong 30 phút. Các phôi sinh thiết sẽ để<br /> trong giọt sinh thiết trong 10 phút trƣớc<br /> khi sinh thiểt.<br /> - Quy trình sinh thiết phôi ngày 3:<br /> + Lựa chọn phôi bào nhỏ, nhìn rõ nhân<br /> để sinh thiết.<br /> + Xoay phôi để đƣa phôi bào sinh thiết<br /> về vị trí 3 giờ và giữ cố định phôi bằng<br /> kim giữ tại vị trí 9 giờ.<br /> + Dùng laser tạo lỗ thủng trên màng<br /> trong suốt của phôi tại vị trí 3 giờ, kích<br /> thƣớc lỗ khoảng một nửa kính thƣớc phôi<br /> bào có hình chữ V hoặc hình chêm.<br /> + Đƣa kim sinh thiết đƣờng kính 30<br /> µm qua lỗ thủng, vừa hút vừa kéo phôi<br /> bào sinh thiết (tránh làm vỡ phôi bào).<br /> + Röa phôi bào sinh thiết bằng môi<br /> trƣờng PBS, chuyển vào tuýp eppendorf<br /> cùng với thể tích PBS 2 - 3 µm.<br /> - Quy trình sinh thiết phôi ngày 5:<br /> + Phôi ngày 5 đƣợc tạo lỗ thủng 10 µm<br /> trên màng trong suốt khi phôi đƣợc 3 ngày.<br /> + Khi phôi túi hình thành, chờ khi có 6<br /> - 10 tế bào lá nuôi chui qua lỗ thủng màng<br /> trong suốt tiến hành sinh thiết.<br /> + Xoay phôi túi để đƣa các tế bào lá<br /> nuôi chui qua lỗ thủng ở vị trí 3 giờ.<br /> + Cố định phôi bằng kim giữ tại vị trí<br /> 9 giờ.<br /> + Dùng kim sinh thiết đƣờng kính 20 µm<br /> vừa hút vừa kéo tế bào lá nuôi, khi không<br /> đứt thì dùng laser cắt rời khỏi phôi túi.<br /> <br /> + Kim sinh thiết có đƣờng kính trong<br /> 30 µm và 20 µm.<br /> <br /> + Rửa các tế bào lá nuôi sinh thiết<br /> bằng môi trƣờng PBS, chuyển vào tuýp<br /> eppendorf cùng với thể tích PBS 2 - 3 µm.<br /> <br /> + Đĩa sinh thiết phôi tạo giọt môi trƣờng<br /> sinh thiết, mỗi giọt có thể tích 5 µl, phủ<br /> dầu khoáng và ổn định trong tủ ấm 37oC,<br /> <br /> * Đông lạnh phôi ngày 5 sau sinh thiết<br /> bằng phương pháp thuỷ tinh hoá, s dụng<br /> môi trường đông và rã đông c a Kitazato:<br /> <br /> 46<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015<br /> <br /> * Nuôi cấy phôi ngày 3 sau sinh thiết:<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Sau sinh thiết, rửa phôi ngày 3 bằng<br /> môi trƣờng G-IVF và tiếp tục nuôi cấy<br /> trong giọt môi trƣờng 20 µl G2 plus đƣợc<br /> phủ dầu khoáng Ovoil trong hộp cấy<br /> Nunc, nuôi trong tủ Cook 37oC sử dụng<br /> khí trộn CO2 6%, O2 5%.<br /> <br /> Bảng 3: Sự phát triển của phôi ngày 3<br /> sau sinh thiết.<br /> THỜI ĐIỂM ĐÁNH GIÁ PHÔI<br /> Ngày 3<br /> <br /> Phôi không<br /> Phôi phát triển:<br /> phát triển:<br /> 45 (90%)<br /> 5 (10%)<br /> <br /> * Thời đi m đánh giá chất lượng phôi<br /> sau sinh thiết:<br /> Phôi ngày 3 sau sinh thiết: đánh giá<br /> hình thái phôi vào ngày 4 và ngày 5 theo<br /> đồng thuận Alpha của ESHRE (2011) về<br /> chất lƣợng noãn và phôi [1].<br /> Bảng 1: Phân loại phôi nuôi cấy ngày 4.<br /> PHÂN LOẠI<br /> <br /> MÔ TẢ<br /> <br /> Tốt<br /> <br /> Hiện tƣợng nén đã diễn ra ở toàn bộ<br /> thể tích phôi<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> Hiện tƣợng nén đã diễn ra ở phần<br /> lớn của phôi<br /> <br /> Xấu<br /> <br /> Hiện tƣợng nén xảy ra ít hơn 1/2 thể<br /> tích phôi, với sự hiện diện của 2 - 3<br /> phôi bào còn rõ màng tế bào, hoặc<br /> hiện tƣợng nén xảy ra ở phôi trƣớc<br /> khi phôi đạt đến 8 phôi bào<br /> <br /> Bảng 2: Phân loại phôi nuôi cấy ngày 5.<br /> PHÂN LOẠI<br /> <br /> MÔ TẢ<br /> <br /> Tốt<br /> <br /> Phôi có mức độ giãn rộng ≥ 3, phân<br /> loại nụ phôi và tế bào lá nuôi: AA,<br /> AB, BA<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> Phôi có mức độ giãn rộng ≥ 3, phân<br /> loại nụ phôi và tế bào lá nuôi: BB,<br /> BC<br /> <br /> Xấu<br /> <br /> Phôi có mức độ giãn rộng < 3 hoặc<br /> ≥ 3, phân loại nụ phôi và tế bào lá<br /> nuôi: AC, CB, CC<br /> <br /> Ngày 4<br /> <br /> 50 phôi<br /> <br /> 45 phôi đang<br /> giai đoạn kết<br /> dính<br /> <br /> Ngày 5<br /> Hình thành phôi<br /> túi: 32 (64%)<br /> - 6 phôi túi giai<br /> đoạn sớm<br /> <br /> Số phôi bào<br /> - 22 phôi túi<br /> không thay<br /> đang nở rộng<br /> đổi<br /> - 4 phôi túi đã<br /> nở rộng<br /> <br /> Tiếp tục nuôi cấy phôi ngày 3 sau sinh<br /> thiết, kết quả cho thấy phôi nuôi cấy ngày<br /> 4 có 45 phôi (90%) phát triển, các phôi<br /> này đang ở giai đoạn kết dính và 5 phôi<br /> (10%) không phát triển với số phôi bào<br /> trong phôi giống nhƣ ngày 3 sau sinh<br /> thiết. Trong số các phôi nuôi cấy đến<br /> ngày 5, 32 phôi (64%) phát triển thành<br /> phôi túi. Phôi túi đang ở giai đoạn phát<br /> triển khác nhau: 6 phôi túi giai đoạn sớm,<br /> 22 phôi túi đang nở rộng và 4 phôi túi<br /> nở rộng.<br /> * Phân loại chất lượng phôi ngày 4:<br /> Tốt: 30 (66,7%); trung bình: 10 (22,2%);<br /> xấu: 5 (11,1%).<br /> * Phân loại chất lượng phôi ngày 5:<br /> 6 phôi túi giai đoạn sớm nên không thể<br /> đánh giá chất lƣợng, chỉ có 26 phôi giai<br /> <br /> Phôi ngày 5 sau rã đông: đánh giá hình<br /> thái sau 2 giờ.<br /> <br /> đoạn đang nở rộng và đã nở rộng nên có<br /> <br /> * Phân tích và x lý s liệu: dựa trên<br /> chƣơng trình SPSS 13.0.<br /> <br /> loại tốt 16 (61,5%), phôi túi loại trung bình<br /> <br /> thể đánh giá chất lƣợng trong đó phôi túi<br /> 6 (23,1%) và phôi loại xấu 4 (15,4%).<br /> <br /> 47<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015<br /> <br /> Bảng 4: Tình trạng phôi ngày 5 sinh thiết<br /> sau rã đông.<br /> THỜI GIAN<br /> <br /> PHÔI TÚI<br /> <br /> PHÔI TÚI<br /> <br /> SINH THIẾT<br /> SAU RÃ ĐÔNG<br /> <br /> SỐNG SAU<br /> RÃ ĐÔNG<br /> <br /> PHÔI TÚI<br /> THOÁI<br /> HÓA<br /> <br /> n = 20<br /> <br /> 19 (95%)<br /> <br /> 1 (5%)<br /> <br /> PHÔI TÖI TRỞ<br /> VỀ HÌNH THÁI<br /> BAN ĐẦU (giờ)<br /> <br /> 1,96 ± 0,15<br /> <br /> Phôi túi sinh thiết sau rã đông có tỷ lệ<br /> phôi sống 19/20 (95%), chỉ có 1 phôi thoái<br /> hoá (5%). Thời gian phôi túi còn sống trở<br /> về trạng thái ban đầu trƣớc sinh thiết là<br /> 1,96 ± 0,15 giờ.<br /> <br /> Hình 1: Sinh thiết phôi ngày 3.<br /> <br /> Hình 2: Sinh thiết phôi ngày 5.<br /> 48<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Trong thập niên 1990 và đầu thập niên<br /> 2000, sinh thiết phôi ngày 3 đƣợc sử<br /> dụng tại đa số các trung tâm hỗ trợ sinh<br /> sản. Tiềm năng của tế bào trong phôi giai<br /> đoạn phân chia là cân bằng. Do vậy, sinh<br /> thiết 1 - 2 tế bào của phôi ngày 3 có số<br /> lƣợng 6 - 8 tế bào hầu nhƣ không ảnh<br /> hƣởng đến sự phát triển phôi sau đó.<br /> Sinh thiết phôi giai đoạn phân chia sẽ kịp<br /> thời gian để PGD/PGS và có thể chuyển<br /> phôi tƣơi vào ngày 4 hoặc 5 [3, 5]. Geber<br /> và Sampaio (1999) sinh thiết 66 phôi<br /> ngày 3, tiếp tục theo dõi thấy có 33 phôi<br /> phát triển đến giai đoạn phôi túi đạt tỷ lệ<br /> 50% [2]. Nghiên cứu của chúng tôi có kết<br /> quả đáng khả quan với 32/50 (64%) đạt<br /> đến phôi túi sau khi sinh thiết phôi ngày 3.<br /> Gần đây, nhiều trung tâm đã bỏ sinh<br /> thiết phôi giai đoạn phân chia do vấn đề<br /> thể khảm dao động 40 - 60%, nên kết quả<br /> chẩn đoán sẽ không chính xác. Sinh thiết<br /> 6 - 10 tế bào lá nuôi từ phôi túi có số<br /> lƣợng xấp xỉ 100 tế bào không ảnh<br /> hƣởng đến sự phát triển phôi và thai mà<br /> còn hạn chế vấn đề thể khảm, cho kết<br /> quả chính xác hơn [4]. Tuy nhiên, do phôi<br /> túi phát triển không cùng thời gian, nên<br /> việc sinh thiết không thể thực hiện cùng<br /> một thời điểm. Cần cân nhắc tạo lỗ thủng<br /> trên màng trong suôt để sinh thiết phôi túi<br /> tại thời điểm phôi ngày 3 hoặc sáng ngày<br /> 5. Việc sử dụng laser để tạo lỗ thủng trên<br /> màng trong suốt của phôi ngày 3 ảnh<br /> hƣởng ít đến phôi bào và tạo thuận lợi<br /> sinh thiết tế bào lá nuôi [3]. Tuy nhiên, vị<br /> trí lỗ thủng của màng trong suốt cũng có<br /> thể trùng với vị trí khôi tế bào trong phôi<br /> túi, do vậy quá trình sinh thiết có thể ảnh<br /> hƣởng đến phôi túi.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015<br /> <br /> Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp thuỷ<br /> tinh hoá để đông lạnh phôi túi ngay sau<br /> sinh thiết. Sau sinh thiết, phôi túi sẽ làm<br /> cho phôi túi xẹp xuống do dịch trong<br /> xoang phôi túi thoát ra ngoài. Do vậy, sẽ<br /> làm cho phôi túi sau rã đông có tỷ lệ phôi<br /> túi sống tƣơng đối cao (95%), kết quả này<br /> cũng tƣơng tự nghiên cứu của Zhang<br /> (2009) với tỷ lệ phôi túi sinh thiết sống<br /> sau rã đông 95,6% [6].<br /> <br /> assessment proceedings of an expert meeting.<br /> Human Reproduction. 2011, 26 (6), pp.1270-1283.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> 4. Harton GL, Magli MC, Lundin K, Montag<br /> M, Lemmen J, Harper JC. ESHRE PGD<br /> Consortium/Embryology Special Interest Group best practice guidelines for polar body and<br /> embryo biopsy for preimplantation gennetic<br /> diagnosis/screening (PGD/PGS). Human<br /> Reproduction. 2011, 26 (1), pp.41-46.<br /> <br /> Qua nghiên cứu cho thấy phát triển<br /> của 50 phôi ngày 3 sau sinh thiết một<br /> phôi bào không ảnh hƣởng đến phát triển<br /> phôi tại các ngày 4 và 5. 20 phôi túi sau<br /> sinh thiết đƣợc đông lạnh bằng phƣơng<br /> pháp thuỷ tinh hoá có tỷ lệ sống cao sau<br /> rã đông.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Alpha Scientists in Reproductive Medicine<br /> and ESHRE Special Interest Group of Embryo.<br /> The Istabul consensus workshop on embryo<br /> <br /> 2. Geber S, Sampaio M. Blastomere<br /> development after embryo biopsy: a new<br /> model to predict embryo development and to<br /> select for transfer. Human Reproduction. 1999,<br /> 14 (2), pp.782-786.<br /> 3. Gardner D, Veissman A, Howles C.M,<br /> Shoham Z. Textbook of Assisted Reproductive<br /> Technologies: laboratory and clinical perspectives.<br /> Third edition on the United Kingdom. 2004.<br /> <br /> 5. Kahraman S, Candan ZN. Outcomes<br /> of vitrified - warmed day-4 embryos after-3<br /> cleavage-stage biopsy. Reprod Biomed Online.<br /> 2010, 21, pp.636-641.<br /> 6. Zhang X, Trokoudes KM, Pavlides.<br /> Vitrification of biopsied embryos at cleavage,<br /> morula and blastocyst stage. Reprod Biomed<br /> online. 2009, 19, pp.526-531.<br /> <br /> 49<br /> <br />