intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Nghiên cứu xây dựng thư viện chứng dương cho xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán bệnh alpha thalassemia

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST
Báo xấu
16
lượt xem 3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Nghiên cứu xây dựng thư viện chứng dương cho xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán bệnh alpha thalassemia được nghiên cứu nhằm tạo ra thư viện gồm các mẫu đối chứng dương cho 6 loại đột biến trên gen alphaglobin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu xây dựng thư viện chứng dương cho xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán bệnh alpha thalassemia

  1. C«ng tr×nh nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG THƯ VIỆN CHỨNG DƯƠNG CHO XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA THALASSEMIA Bạch Thị Như Quỳnh1, Nguyễn Hải Bằng1, Hà Thị Thu2 Nguyễn Văn Thảnh, Vũ Thị Thu Trang1, Dương Quốc Chính3 TÓM TẮT 2 trong xét nghiệm chẩn đoán bệnh alpha- Mục tiêu: tạo thư viện chứng dương cho 6 thalassemia. đột biến trên gen alpha-globin. Đối tượng và Từ khóa: Alpha-thalassemia, Thư viện chứng phương pháp: từ 200 bệnh nhân được chẩn đoán dương, Công nghệ DNA tái tổ hợp. mang gen bệnh Thalassemia tiến hành sàng lọc nhằm phát hiện các đột biến SEA, THAI, α-4.2, SUMMARY α-3.7, HbCs và C.2delT bằng kỹ thuật Multiplex- CREATING THE POSITIVE CONTROL PCR. Các gen đột biến được tạo dòng trong tế LIBRARY FOR MOLECULAR bào E. Coli với chủng DH5α, nuôi cấy tăng sinh BIOLOGY TECHNIQUES TO để tạo thư viện chứng dương. Các dòng tế bào tái DIAGNOSE OF ALPHA tổ hợp được tiến hành đánh giá ngoại kiểm tại THALASSEMIA Viện Huyết Học và Truyền máu Trung ương trên Objective: create a positive control library for quy trình phát hiện đột biến gen gây bệnh alpha 6 mutations on the alpha-globin gene. Subject thalassemia bằng kỹ thuật multiplex PCR. Kết and method: 200 patients diagnosed with quả: Từ các mẫu DNA của bệnh nhân dương tính Thalassemia genes were screened to detect với alpha-thalassemia, nghiên cứu đã tạo ra mutations SEA, THAI, α-4.2, α-3.7, HbCs and nguồn thư viện gồm các mẫu chứng dương tính C.2delT using Multiplex-PCR technique. The của 6 đột biến trên gen alpha-globin bao gồm: mutation genes were developed in E. coli cells SEA, THAI, α-4.2, α-3.7, HbCs, C.2delT. Kết with DH5α strain, cultured and proliferated to quả ngoại kiểm cho thấy nguồn chứng dương create the positive control library. Positive được tạo ra bằng con đường tái tổ hợp ổn định và controls were externally assessed at the National đặc hiệu hơn khi so sánh với đối chứng dương là Institute of Hematology and Blood Transfusion mẫu máu người mang gen bệnh. Kết luận: Các using detection protocol for gene mutations chứng dương tái tổ hợp đủ tiêu chuẩn sử dụng causing alpha thalassemia with multiplex PCR technique. Result: From the available DNA of alpha-thalassemia-positive patients, a library of 1 Trường Đại học Y Dược Hải Phòng positive controls of 6 mutations in the alpha- 2 Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm khoa globin gene was created, including SEA, THAI, học và công nghệ Việt Nam α-4.2, α-3.7, HbCs, C.2delT. External quality 3 Viện Huyết học và truyền máu Trung ương. assessment results showed that the positive Chịu trách nhiệm chính: Bạch Thị Như Quỳnh controls generated by recombinant pathway are Email: btnquynh@hpmu.edu.vn more stable and specific comparing with the Ngày nhận bài: 11.1.2022 positive controls derived from human blood Ngày phản biện khoa học: 19.3.2022 samples from genes carriers. Conclusion: The Ngày duyệt bài: 25.5.2022 12
  2. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 recombinant positive controls can be applied in dương tính đặc biệt là những mẫu đột biến diagnostic tests for alpha-thalassemia. hiếm do những chứng dương được sử dụng Keywords: Alpha-thalassemia, positive tại Việt Nam hiện nay đều được tách chiết từ control material, recombinant DNA technology. máu của các bệnh nhân mang đột biến gen alpha thalassemia [2]. Xuất phát từ lý do trên I. ĐẶT VẤN ĐỀ chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu Alpha-thalassemia là một bệnh lý di nhằm tạo ra thư viện gồm các mẫu đối chứng truyền liên quan đến sự bất thường của dương cho 6 loại đột biến trên gen alpha- protein cấu trúc có chức năng vận chuyển globin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. oxy của hồng cầu – Hemoglobin. Nguyên nhân của bệnh là do bất thường về cấu trúc II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU và số lượng gen alpha-globin nằm trên cánh 1. Đối tượng nghiên cứu ngắn nhiễm sắc thể số 16 [4]. Tùy thuộc vào Sáu loại đột biến: SEA, THAI, α-4.2, α- số gen alpha-globin bị bất thường dẫn tới các 3.7, HbCs và C.2delT sàng lọc từ 200 bệnh kiểu hình thiếu máu từ nhẹ đến nặng hoặc tử nhân được chẩn đoán mang gen bệnh vong [5]. Những bệnh nhân alpha- Thalassemia. thalassemia không có triệu chứng thường chỉ 2. Địa điểm và thời gian: Nghiên cứu được phát hiện khi làm xét nghiệm sinh học được tiến hành tại Labo trung tâm - Trường phân tử về bất thường gen alpha-globin, do Đại học Y Dược Hải Phòng – Số 72A đó tiềm ẩn nguy cơ di truyền gen bệnh cho Nguyễn Bỉnh Khiêm - Ngô Quyền - Hải thế hệ sau. Việc phát hiện người lành mang Phòng. Thời gian nghiên cứu từ tháng gen bệnh có ý nghĩa vô cùng to lớn trong tư 12/2019 đến tháng 3/2021. vấn di truyền nhằm hướng tới loại bỏ hoàn 3. Phương pháp nghiên cứu toàn gen bệnh ra khỏi cộng đồng. Thành phố 3.1. Thiết kế nghiên cứu Hải Phòng, từ năm 2018 đến nay, đã áp dụng - Nghiên cứu thực nghiệm quy trình multiplex PCR trong chẩn đoán đột 3.2. Các phương pháp sử dụng trong biến gen gây bệnh thalassemia với 6 loại đột nghiên biến phổ biến liên quan đến bệnh alpha- - Phương pháp thu mẫu thalassemia tại khu vực Đông Nam Á cũng Phương pháp lấy mẫu thuận tiện, 2 mL như Việt Nam bao gồm: SEA, THAI, α-4.2, máu ngoại vi của bệnh nhân được thu thập α-3.7, HbCs, C.2delT [1]. vào ống chống đông EDTA. Các mẫu được Theo tiêu chuẩn của xét nghiệm đột biến thu thập dựa trên các dấu hiệu lâm sàng, chỉ gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử, chứng số hóa sinh, huyết học, điện di huyết sắc tố dương (positive control) chạy kèm trong mỗi điển hình của bệnh thalassemia. Loại trừ xét nghiệm là yếu tố bắt buộc phải có để những mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nhũ kiểm soát độ tin cậy của kết quả. Nguồn nhi dưới 6 tháng tuổi và những mẫu bệnh chứng dương sẽ được thu thập từ đâu và phẩm có chỉ số hoá sinh, huyết học cũng như bằng cách nào luôn là một vấn đề mà những điện di huyết sắc tố không điển hình; bệnh người làm xét nghiệm chẩn đoán thực sự nhân không đồng ý chấp thuận tham gia quan tâm. Những yêu cầu này đã dẫn đến sự nghiên cứu. thiếu hụt nghiêm trọng về các mẫu DNA 13
  3. C«ng tr×nh nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG - Phương pháp tách chiết DNA DNA là mẫu máu của các bệnh nhân mang DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn các đột biến trên gen alpha-globin tương ứng phần theo kit Blood DNA Mini Kit với 6 loại đột biến trên để đối sánh. Kết quả (OMEGA). Tất cả các mẫu sau tách chiết được phân tích so sánh giữa nguồn chứng được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch dương từ mẫu máu bệnh nhân và nguồn bằng máy đo quang phổ Nanodrop. chứng dương tái tổ hợp về độ đặc hiệu và - Phương pháp khuếch đại gen nồng độ sản phẩm PCR sau khi thực hiện Phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu phản ứng multiplex PCR. Nồng độ DNA được thừa hưởng từ nghiên cứu: “Xây dựng được đo bằng phương pháp quang phổ kế. quy trình phát hiện đột biến gen Thalassemia Độ đặc hiệu của phản ứng được kiểm tra tại Hải Phòng dựa trên kỹ thuật multiplex bằng kỹ thuật điện di trên gel Agarose. PCR”. Thành phần phản ứng PCR (tổng thể 4. Đạo đức trong nghiên cứu tích 25µL) gồm: GoTaq Hot Start Master Nghiên cứu tuân thủ các quy định về đạo Mix 2x, 5 pmol primer, 100 - 150 ng DNA đức trong nghiên cứu y sinh được sự thông khuôn. Chu trình nhiệt: 95°C/3 phút, 35 chu qua của Hội đồng đạo đức Trường Đại học Y kỳ [94°C/1 phút – 65°C /1 phút - 72°C/1 dược Hải Phòng. Bệnh nhân hoàn toàn tự phút 30 giây], 72°C/8 phút, bảo quản 4°C. nguyện tham gia vào nghiên cứu và hoàn Sản phẩm sau phản ứng được tiến hành điện toàn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi di trên gel agarose 1,5%, 100 Vol trong vòng không đồng ý tiếp tục tham gia. Bệnh nhân 30 phút [1]. được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để - Tạo dòng gen giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa Sản phẩm gen đột biến được gắn vào chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin vector tách dòng PCR2.1 biến nạp vào tế bào cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật. E.coli chủng DH5 - . Các dòng tế bào được sàng lọc bằng kỹ thuật enzyme cắt giới hạn; III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU kỹ thuật PCR và thực hiện giải trình tự gen 1. Sàng lọc 6 đột biến trên gen alpha- trên hệ thống ABI 3500 để khẳng định dòng globin bằng kỹ thuật Multiplex-PCR tế bào tái tổ hợp chứa các đột biến gen mong Từ 200 mẫu DNA thu được trên 200 bệnh muốn. Thực hiện kỹ thuật cấy chuyển sau 10 nhân được chẩn đoán mang gen bệnh lần nuôi cấy và sau 3 tháng lưu giữ tại nhiệt thalassemia tại bệnh viện Trường Đại học độ -800 để kiểm tra tính bảo toàn của gen học Y dược Hải Phòng và bệnh viện Phụ sản trong dòng tế bào tái tổ hợp. Kết quả giải Hải Phòng, chúng tôi thực hiện phản ứng trình tự được so sánh với trình tự tham chiếu multiplex PCR. Kết quả có 86 bệnh nhân trên ngân hàng gen bằng phần mềm BioEdit. mang gen α-thalassemia gồm 6 loại đột biến. - Ngoại kiểm Trong số các đột biến, đột biến SEA chiếm tỉ Các dòng tế bào tái tổ hợp đại diện cho 6 lệ cao nhất: 73%, kế tiếp là các đột biến 3.7, loại đột biến được tiến hành ngoại kiểm trên THAI, HbCs, c2delT và 4.2 với tỉ lệ tương quy trình phát hiện đột biến gen gây bệnh ứng lần lượt là: 19.3%, 3,3%, 2,2%, 1.1% và alpha thalassemia bằng kỹ thuật multiplex 1.1%. PCR tại Viện Huyết học và Truyền máu 2. Kết quả tổng hợp đoạn gen chứa đột Trung Ương. Quy trình có sử dụng các mẫu biến gây bệnh bằng kỹ thuật PCR 14
  4. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 Bằng phản ứng PCR sử dụng 6 cặp mồi của bệnh nhân mang đột biến. Kết quả PCR đặc hiệu tương ứng cho đột biến SEA, THAI, khuếch đại một số loại đột biến alpha- 3.7, 4.2, HbCs và c2delT để khuếch đại DNA thalassemia được minh họa ở Hình 1. Hình 1. Hình ảnh minh họa kết quả PCR khuếch đại các đột biến trên gel Alpha-globin M 1kb: marker 1 kilobase, Pos: dương 3. Kết quả tạo dòng các plasmid tái tổ tính, NC: âm tính, 3.7: đột biến mất đoạn 3.7 hợp mang các đột biến kilobase, 4.2: đột biến mất đoạn 4.2 kilobase, Sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu SEA: đột biến SEA, Cs: đột biến HbCs, C2: tương ứng của 6 loại đột biến trên gen alpha đột biến C2DelT. globin được gắn vào vector tách dòng pCR Kết quả diện di trên gel agarose 1.5% cho 2.1/TA cloning (Invitrogen) và biến nạp vào thấy sản phẩm PCR thu được (tương ứng với tế bào E. coli–DH5α. Tế bào E. coli–DH5α mỗi loại đột biến) là một băng sáng duy nhất, sau biến nạp phát triển trên môi trường LB rõ nét, kích thước đúng với kích thước giữa 2 lỏng. Dịch nuôi cấy được cấy trải trên môi mồi khuếch đại; mẫu chứng âm không có LB agar (100 μl/đĩa) có bổ sung Amp; Xgal vạch chứng tỏ phản ứng không bị nhiễm và IPTG (Hình 2) DNA ngoại lai. Hình 2. Kết quả cấy chọn lọc trên môi trường LB Amp=Xgal = IPTG 15
  5. C«ng tr×nh nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG Khuẩn lạc xanh: các tế bào không nhận biến gen mong muốn. Sản phẩm sau đó được được gen đột biến; điện di trên gel agarose 1.5% (Hình 3). Khuẩn lạc trắng: những tế bào có khả Quan sát ảnh điện di chúng ta thấy rằng, năng nhận được gen đột biến DNA plasmid sau khi cắt tại đường chạy: T2, Lựa chọn các khuẩn lạc màu trắng và một T3, S3, S5, CS1, CS2, DEL1, 42.2. 37.1 xuất khuẩn lạc màu xanh trên mỗi đĩa môi trường hiện 1 băng rõ rệt có kích thước tương ứng tương ứng với mỗi loại đột biến để tiến hành với kích thước của đoạn gen đích được gắn tách DNA plasmid và sử dụng enzyme cắt vào vecto. giới hạn để chọn lọc các plasmid mang đột Hình 3. Kết quả cắt chọn lọc DNA plasmid bằng enzyme giới hạn Đường chạy M: thang ADN chuẩn; X: DNA. Nồng độ ADN plasmid được đo bằng plasmid dòng khuẩn lạc xanh; T2-T3: các quang phổ kế. Nồng độ ADN plasmid sau dòng tế bào mang plasmid pA/THAI; S3-S5: tách chiết của tất cả các dòng đều từ 119,2 các dòng tế bào mang plasmid pA/SEA; ng/ μl trở lên. Kết quả tỷ số A260/280 của CS1-CS2: các dòng tế bào mang plasmid 100% mẫu đều thỏa mãn trong khoảng giá trị HbCs; DEL1-DEL2: các dòng tế bào mang 1,8-2. ADN sau tách chiết có độ tinh khiết plasmid C2DELT; 42.2: dòng tế bào mang cao và đảm bảo chất lượng để tiến hành kỹ plasmid pA/4.2; 3.7: dòng tế bào mang thuật giải trình tự gen. Kết quả giải trình tự plasmid 3.7. bằng máy ABI 3500 cho thấy tín hiệu giải 3. Giải trình tự các dòng tế bào mang trình tự gen đặc hiệu, rõ nét, không xuất hiện đột biến. tín hiệu nhiễu. Từ các trình tự gen thu nhận Lựa chọn Các dòng plasmid tái tổ hợp được, tiến hành phân tích bằng phần mềm tương ứng với 6 loại đột biến t để tách chiết BioEdit. (Hình 4) 16
  6. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 Hình 4. Đại diện kết quả phân tích trình tự gen đột biến Thai trên phần mềm Bio Edit 5. Kết quả kiểm tra tính bảo toàn của khoảng 5.9-6.3 sau thời gian 2,5h-3h. Và sau gen đột biến mỗi lần cấy chuyển, tế bào được thu lại để Chọn ngẫu nhiên một dòng tế bào tái tổ tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật PCR. Các tế hợp cho mỗi loại đột biến để tiến hành hoạt bào sau 10 lần nuôi cấy đều chứa những đột hóa trong môi trường nghèo dinh dưỡng. Sau biến tương ứng đưa vào ban đầu. đó thực hiện cấy chuyển các dòng tế bào 6. Kết quả ngoại kiểm các chứng dương trong môi trường LB lỏng đến lần thứ 10. tái tổ hợp Sau mỗi lần cấy chuyển sẽ tiến hành đo mật Các dòng tế bào tái tổ hợp sau đó được độ phát triển tế bào tại bước sóng 600 nm để chuyển đến Viện Huyết học và Truyền máu đánh giá khả năng phát triển của tế bào sau Trung Ương để đánh giá. Kết quả ngoại kiểm mỗi lần nuôi cấy. Kết quả sau mỗi lần cấy được thể hiện tại Bảng 1. chuyển, mật độ tế bào đạt OD600 trong 17
  7. C«ng tr×nh nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG Bảng 1. Kết quả ngoại kiểm các chứng dương tái tổ hợp bằng kỹ thuật Multiplex-PCR Nồng độ DNA (ng/L) Độ đặc hiệu của Trước phản ứng Sau phản ứng phản ứng (ng/l) (ng/l) STT Mã số Tế bào Tế bào Mẫu Mẫu Tế bào Mẫu tái tổ tái tổ máu BN máu BN tái tổ hợp máu BN hợp hợp 1 SEA-R 60 1,8 812 1250 ++++ +++++ 2 THAI-R 75 1,8 822 1211 +++ +++++ 3 3.7-R 102 1,8 709 1210 ++ +++++ 4 4.2-R 123 1,8 789 1234 ++ +++++ 5 HbCs-R 97 1,8 806 1300 ++ +++++ 6 C2DELT-R 64l 1,8 864 1321 + +++++ (“+”, “++”, “+++”, “++++”: mức độ đặc hiệu của phản ứng multiplex-PCR) Có sự đồng nhất về kết quả xác định đột biến giữa DNA tách chiết từ mẫu máu của bệnh nhân và DNA tái tổ hợp, DNA tái tổ hợp cho kết quả ổn định và đặc hiệu hơn. IV. BÀN LUẬN Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung Nghiên cứu phát hiện được 86/200 mẫu Amp chỉ những tế bào nhận được plasmid dương tính với 6 loại đột biến trên gen alpha biến nạp vào mới có thể phát triển do đó giúp globin được sàng lọc, chiếm 43%. Trong số loại bỏ những tế bào không nhận plasmid. các đột biến, đột biến SEA chiếm tỉ lệ cao Sàng lọc các dòng tế bào mang plasmid gắn nhất: 73%, các đột biến 3,7, THAI, HbCs, gen đột biến alpha-thalassemia bằng X-gal C2DelT và -4.2 với tỉ lệ tương ứng lần lượt và IPTG dựa trên nguyên lý: những tế bào là: 19,3 %, 3,3%, 2,2%, 1.1% và 1.1%. Kết nhận vector pCR®2.1 tự đóng vòng sẽ có gen quả nghiên cứu phù hợp với kết quả nghiên lac-Z hoạt động thường tạo ra enzyme - cứu của tác giả Đ T Q Mai (2021) trên 85 galactosidase chuyển hóa X-gal thành hợp bệnh nhi Thalassemia điều trị tại bệnh viện chất có màu xanh nên khuẩn lạc có màu Trẻ em Hải Phòng [3]. Kết quả nghiên cứu xanh. Những tế bào nhận được plasmid tái tổ cũng chỉ ra tỷ lệ mang đột biến C.2delT và - hợp có đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa lac 4.2 là tương đối thấp trong cộng đồng (1.1%) promoter và gen cấu trúc Lac-Z của operon chứng tỏ sự cần thiết của việc tạo ra nguồn Lac nên lac promoter không thể điều khiển thư viện chứng dương. Các quy trình PCR gen cấu trúc phiên mã do đó không có sự tạo phát hiện 6 loại đột biến sử dụng cặp mồi đặc thành enzyme β-galactosidase để phân hủy hiệu tương ứng đã được nhóm tác giả tối ưu X-gal tạo ra những khuẩn lạc màu trắng. trong nghiên cứu trước đây, do đó đảm bảo IPTG được sử dụng với tư cách là chất cảm độ nhạy và độ đặc hiệu [1]. ứng cho operon lac gắn trong vector pCR®2.1 [6]. 18
  8. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 Những dòng tế bào có khả năng mang gen hạn, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR với đột biến, được tiến hành cắt với enzyme cắt các cặp mồi đặc hiệu để sàng lọc các dòng tế giới hạn cùng một vài khuẩn lạc từ dòng tế bào mang đột biến. Kết quả cho thấy có sự bào màu xanh làm đối chứng. Kết quả điện tương đồng 100% giữa hai phương pháp. di (Hình 3) đã chỉ ra 20 dòng tế bào mang Kết quả giải trình tự được phân tích bằng đột biến SEA, 17 dòng tế bào mang đột biến phần mềm BioEdit, trình tự sau phân tích HbCs, 15 dòng tế bào mang đột biến THAI, được so sánh với trình tự chuẩn tương ứng 6 dòng tế bào mang đột biến -4.2 và 5 dòng trên phần mềm Genebank. Kết quả cho thấy tế bào mang đột biến -3.7. Song song với các trình tự có độ tương đồng cao (99%) việc chọn lọc các dòng tế bào mang đột biến (Bảng 2). bằng phương pháp sử dụng enzyme cắt giới Bảng 2. So sánh trình tự gen của 6 đột biến trên gen Alpha-Globin Độ tương đồng với gene STT Tên đột biến Mã số trên Genbank nghiên cứu 1 SEA KX4581114 99% 2 THAI AP023476 99% 3 -3.7 NG0000006 99% 4 -4.2 AF221717 99% 5 HbCs HQ156224 99% 6 C.2delT SAF271160 99% Các dòng tế bào tái tổ hợp khi thực hiện Các dòng tế bào tái tổ hợp mang 6 loại đột tăng sinh 10 lần liên tục và không xảy ra hiện biến trên gen alpha globin được đánh giá thử tượng đào thải gen nhận đã khẳng định sự nghiệm tại Labo xét nghiệm Di truyền - Sinh thành công của nghiên cứu. Phương pháp cấy học Phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu chuyển để đánh giá tính ổn định của tế bào Trung ương – đơn vị đầu nghành trong việc tái tổ hợp đã được Bernacki S. H. và cộng sự chẩn đoán phát hiện các bệnh về máu tại Việt khẳng định giá trị trong nghiên cứu công bố Nam. Kết quả cho thấy nguồn chứng dương năm 2005 cho thấy cơ sở khoa học của được tạo ra bằng con đường tái tổ hợp ổn phương pháp [7]. Để khẳng định thêm tính định và đặc hiệu hơn khi so sánh với đối ổn định của tế bào tái tổ hợp chứa gen đột chứng dương là mẫu máu người mang gen biến, nghiên cứu tiến hành kiểm tra tính bảo bệnh. Khi thực hiện phản ứng multiplex toàn của gen sau 3 tháng bảo quản ở nhiệt độ PCR, nồng độ DNA khuôn từ dòng tế bào tái -800 C. Kết quả cho thấy tất cả các dòng tế tổ hợp đều rất thấp (1,8 ng/L) so với nồng bào không xảy ra hiện tượng đào thải gen độ DNA khuôn tách chiết từ mẫu máu toàn nhận. phần của người mang gen bệnh (SEA- 60 19
  9. C«ng tr×nh nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG ng/l). Đặc biệt hơn là việc sử dụng các 2017, 461(2), 7-10. chứng dương tạo ra theo kỹ thuật tái tổ hợp 2. Quỳnh B.T.N., Bằng N.H., Thu H.T. và cộng sự. (2022). Tạo thư viện chứng dương đã loại bỏ được những sản phẩm không đặc cho xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán hiệu thường xuất hiện từ các chứng dương là bệnh Beta Thalassemia. TCNCYH, 151(3), 9– mẫu máu của người mang đột biến. 17. 3. Mai Đ.T.Q, Sáng N.N, Quỳnh B.T.N. Xác V. KẾT LUẬN định đột biến gen gây bệnh Thalassemia ở trẻ Chúng tôi đã thành công trong việc tạo em tại bệnh viện Trẻ em Hải Phòng. Y học thư viện chứng dương của 06 loại đột biến Việt Nam, 2021, 509(1), 361-365. trên gen alpha globin: SEA, THAI, -3.7, -4.2, 4. Raja Z.A.M, Ainoon O., Hafiza al et al. HbCs và C.2delT. Đây là nguồn chứng (2014), Molecular characteristic of alpha dương ổn định, cần thiết để thay thế cho thalassaemia among patients diagnosed in UKM Medical Centre, Malaysian J Pathol; nguồn chứng dương từ các mẫu bệnh phẩm 36(1):27 – 32. trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán phân 5. Galanello R. và Cao A. (2011). Alpha- tử. Sản phẩm này cũng đưa ra một giải pháp thalassemia. Genet Med, 13(2), 83–88. thay thế nhanh chóng, chi phí thấp, cho các 6. Sambrook, J., Fritsch, E. R., & Maniatis, T. đột biến di truyển khác mà chưa được tạo bởi Molecular Cloning: A Laboratory Manual các dòng tế bào bất tử. (2nd ed.). Cold Spring Harbor.1989., NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. TÀI LIỆU THAM KHẢO 7. Bernacki S. H. et al,. Genetically 1. Quỳnh B.T.N., Thu L.H., Hường V.T.B. và characterized positive control cell lines cộng sự. Áp dụng kỹ thuật PCR phát hiện đột derived from residual clinical blood sample, biến gen trên bệnh nhân nghi ngờ alpha- Clinical Chemistry. 2005 , 51:11: pp. 2013- Thalassemia tại Hải phòng. Y học Việt Nam, 2024. 20
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
19=>1