Phân lập, xác định cấu trúc các Aporphine alkaloid từ cây Tơ xanh (Cassytha filiformis L.)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 6 * 2016<br /> <br /> <br /> PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC APORPHINE ALKALOID<br /> TỪ CÂY TƠ XANH (CASSYTHA FILIFORMIS L.)<br /> Bùi Thế Vinh*, Đoàn Nam Trung*, Trần Công Luận**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu tơ xanh, chống nhầm lẫn với tơ hồng; nghiên cứu<br /> này tiến hành khảo sát đặc điểm vi học và hóa học, đặc biệt là nhóm aporphinoid của tơ xanh.<br /> Đối tượng nghiên cứu: Cây tơ xanh được thu hái tại tỉnh Long An, được định danh bởi phòng Tài nguyên<br /> và Dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh. Phân lập và xác định cấu trúc bằng kỹ thuật sắc<br /> ký và kỹ thuật phổ.<br /> Kết quả: Qua sắc ký cột silicagel pha thuận đã phân lập và xác định được cấu trúc của 2 aporphine alkaloid.<br /> Kết luận: Phân lập và xác định được cấu trúc của 2 aporphine alkaloid là Cassythidine và Thalicminine.<br /> Từ khóa: Tơ xanh, aporphine alkaloid, cassythidine, thalicminine<br /> ABSTRACT<br /> ISOLATION AND STRUCTURE IDENTIFICATION OF APORPHINOID ALKALOID FROM<br /> CASSYTHA FILIFORMIS L.<br /> Bui The Vinh, Đoan Nam Trung, Tran Cong Luan* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - No 6 - 2016: 186 - 190<br /> <br /> Objectives: This study was made to develope the marker compound contributing a standardization of this<br /> plant.<br /> Materials and methods: Isolation and structural elucidation based on chromathography and spectrum<br /> technique.<br /> Results: By using chromathography and spectrum technique, two aporphine alkaloid were isolated and<br /> elucidated.<br /> Conclusions: Two novel aporphinoid alkaloid from Cassytha filiformis L. named Cassythidine and<br /> Thalicminine were isolated by using the repeated column chromatography on total alkaloid residue. Their<br /> structure was elucidated based on the NMR – spectroscopic data.<br /> Key words: Cassytha filiformis L., cassythidine, thalicminine, aporphinoid alkaloid.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ nhóm hợp chất alkaloid với cấu tạo là khung<br /> aporphine. Trên thế giới, nhóm aporphine<br /> Tơ xanh (Cassytha filiformis L.) thuộc chi alkaloid của tơ xanh đã được nghiên cứu về hoạt<br /> Cassytha, họ Long não (Lauraceae). Chi Cassytha tính sinh học, chúng thể hiện hoạt tính độc tế<br /> dị biệt trong họ vì là dây leo bán ký sinh có lá bào ung thư, kháng ký sinh trùng trypanosoma,<br /> tiêu giảm thành vảy. Trong chi gồm khoảng 20 chống kết tập tiểu cầu(2,3). Ở Việt Nam, chưa tìm<br /> loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, nhất là thấy nghiên cứu nào về nhóm aporphine<br /> Australia có 15 loài. Ở Việt Nam, chi này có 2 loài alkaloid của tơ xanh, nghiên cứu này tiến hành<br /> là tơ xanh (Cassytha filiformis L.) và tơ xanh chỉ chiết tách, tinh sạch và xác định cấu trúc của<br /> Cassytha capillaris Meissn.)(5,6) aporphine alkaloid từ tơ xanh, góp phần định<br /> Thành phần hóa học chính của tơ xanh là<br /> <br /> Trung tâm Sâm và Dược liệu ** Đại học Tây Đô.<br /> Tác giả liên lạc: DS. Bùi Thế Vinh ĐT: 0918 0918 64 Email: buithe_vinh@yahoo.com.vn<br /> <br /> 186<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 6 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> hướng cho những nghiên cứu sâu hơn về hóa KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> học và hoạt tính sinh học trên đối tượng này.<br /> Chất V2 (thalicminine)<br /> VẬTLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Chất V2 được cô lập dưới dạng tinh thể màu<br /> Vật liệu nghiên cứu vàng cam, tan trong CHCl3, MeOH, SKLM bằng<br /> Tơ xanh được thu hái ở tỉnh Long An, mẫu hệ dung môi CHCl3 : MeOH : NH4OH đđ (9 : 1 :<br /> thu trong thời kỳ ra hoa, quả khoảng tháng 7-8. 0,2) cho vết tắt quang ở UV 254 nm, hiện hình<br /> Mẫu được định danh bởi phòng Tài nguyên bằng thuốc thử Dragendorff xuất hiện vết tròn<br /> Dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.Hồ màu cam đậm với Rf = 0.4.<br /> Chí Minh. Mẫu thu hái được rửa sạch, cắt nhỏ, Biện giải kết quả phổ chất V2 (thalicminine)<br /> phơi khô và xay thành bột để nghiên cứu. Phổ 1H-NMR cho tín hiệu cộng hưởng ứng<br /> Phương pháp với sự hiện diện ba nhóm proton methoxy H<br /> Phương pháp chung: Phổ MS ghi trên máy [3,814 (3H; s; 3-OMe); 4,026 (3H; s; 10-OMe);<br /> HR-MS micrOTOF-Q II 10187. Phổ 1H, 13C 4,284 (3H; s; 11-OMe)], một proton methylen ở<br /> NMR được ghi trên máy Bruker AM500 FT- vùng trường thấp [H 6,223; (2H; O-CH2-O)], bốn<br /> NMR, đo trong MeOH. Sắc ký lớp mỏng được proton methine của nhân thơm H [8,123 (H-4);<br /> thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 8,855 (H-5); 8,35 (d; J=8,5 Hz; H-8); 7,181 (d; J=8,5<br /> 60F254 (Merck), hệ dung môi khai triển CHCl3 : Hz; H-9)].<br /> MeOH : NH4OH đđ (9 : 1 : 1 giọt). Silica gel 60 Các dữ liệu phổ 13C-NMR, DEPT cho thấy V2<br /> F254 (0,063-0,200 mm) (Merck) được dùng trong có tổng số 20 carbon cho tín hiệu phổ từ 20 ppm<br /> sắc ký cột. đến 180 ppm. Trong đó có 12 carbon bậc IV (C)<br /> Chiết xuất: 4,2 kg bột tơ xanh được kiềm trong đó 1 tín hiệu 181,48 là nhóm ceton (C-7), 4<br /> hóa bằng dung dịch NH4OH 15% đến pH 10. carbon bậc III (CH), 1 carbon bậc II (CH2) và 3<br /> Thêm CH2Cl2 đến khi ngập bề mặt bột tơ carbon bậc I (CH3). Tất cả 12 carbon bậc IV và 4<br /> xanh. Ngâm trong khoảng 12 h, thỉnh thoảng carbon bậc III đều dịch chuyển ở vùng trường<br /> có khuấy trộn, lọc thu dịch chiết. Kiểm tra sự thấp (δC từ 110 ppm đến 180 ppm).<br /> hiện diện của alkaloid trong dịch chiết bằng Có 1 carbon bậc II [δC 101,75 ppm] đặc trưng<br /> phương pháp sắc ký lớp mỏng, sau đó tiến của carbon methylen dioxid O-CH2-O của khung<br /> hành cô quay giảm áp thu cao chiết, dung môi aporphine.<br /> CH2Cl2 thu hồi được sử dụng để chiết tiếp bã Trong nhóm methyl, có 3 nhóm có độ dời<br /> dược liệu. Quy trình lặp lại cho đến khi dịch hóa học đặc trưng của nhóm methoxy [δC 61,15<br /> chiết không còn alkaloid. Cao alkaloid tổng ppm; δH 3,814; 3H; 3-OMe], [δC 56,10 ppm; δH<br /> thu được là 380 g. 100 g cao được phân đoạn 4,02; 3H; 10-OMe] và [δC 60,21 ppm; δH 4,28; 3H;<br /> qua sắc ký cột (SKC) pha tĩnh là diaion HP-20, 11-OMe].<br /> rửa giải với dumg môi nước, MeOH nước Với các dữ liệu phổ NMR như trên ta có thể<br /> 20%, 40%, 60%, 80%, 100% thu những phân dự đoán V2 là một alkaloid có một nhóm thế -O-<br /> đoạn sạch hơn. Phân đoạn tập trung nhiều CH2-O-, ba nhóm -OMe, một nhóm C=O một<br /> alkaloid nhất (MeOH 100%, 67 g) được tiến nhóm –N=. Tham khảo các tài liệu công bố đặc<br /> hành nhiều lần SKC silica gel với hệ dung môi điểm phổ NMR có thể dự đoán được V2 là<br /> CH2Cl2 : MeOH với độ phân cực tăng dần khung oxoaporphine.<br /> (100:0; 99:1; 98:2 đến 95:5) thu được khoảng 10<br /> Dựa vào phổ HMBC, hai proton của nhóm<br /> mg chất V2 và 80 mg chất V4 tinh sạch.<br /> methylen dioxid (δH 6,22) có tương tác với hai<br /> carbon bậc IV δC (137,38 và 149,73; là C-1 và C-2).<br /> <br /> <br /> 187<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 6 * 2016<br /> <br /> Proton methoxy (δH 4,284; 3-OMe) cho tương hiệu proton methine của nhân thơm (δH 8,35) cho<br /> quan với carbon bậc IV (δC 136,21), nên carbon tương quan với C-7 nên tín hiệu này là của H-8;<br /> này là C-3, tương tự hai carbon methoxy còn lại H-8 cho tương quan với một carbon bậc IV (δC<br /> 10-OMe và 11-OMe cho tương quan với 2 carbon 126,85) nên carbon này được đề nghị là C-7ª.<br /> bậc IV (δC 145,85 và δC 157,91) nên 2 carbon này Đồng thời H-8 ghép với một proton methine<br /> lần lượt là C-10 và C-11, trong cấu trúc khung nhân thơm (δH 7,181; J=8,5 Hz) nên proton này là<br /> oxoaporphine có 2 proton methine nhân thơm H-9, ghép cặp vị trí orto. H-9 cho tương quan với<br /> tại vi trí 4 và 5; dựa trên phổ 1H-NMR cho 2 tín C-10 và C-11 (δC 145,85 và δC 157,91).<br /> hiệu (δH 8,12 và δH 8,85), hai tín hiệu này được đề Từ kết quả phổ NMR 1 và 2 chiều, kết hợp<br /> nghị là của H-4 và H-5, trên phổ COSY cũng cho đối chiếu với các tài liệu tham khảo, chúng tôi<br /> thấy tín hiệu tương quan của 2 proton này. Chức nhận định V2 là thalicminine, một alkaloid cấu<br /> C=O của khung oxoaporphine được đề nghị tại tạo khung oxoaporphine.<br /> vị trí C-7 (δC 181,48). Trên phổ HMBC, một tín<br /> Bảng 1. Kết quả phổ NMR của chất V2 δ (ppm), J (Hz), CDCl3, 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz).<br /> 13 1 13<br /> Carbon C-NMR DEPT H-NMR COSY HMBC C-NMR Thalicminine [5]<br /> 1 149,50 C - 148,6<br /> 1a 100,32 C - 102,9<br /> 1b 123,36 C - 122,2<br /> 2 137,38 C - 136,4<br /> 3 136,21 C - 135,9<br /> 3a 126,85 C - 130,6<br /> 4 118,41 CH 8,123 (br) H-5 118,9<br /> 5 143,82 CH 8,855 (br) H-4 144,2<br /> 6 144,50 C - 145,2<br /> 7 181,48 C - 181,2<br /> 7a 126,85 C - 125,1<br /> 8 126,13 CH 8,35 (d, J=8,5 Hz) H-9 C-11; C-10; C-9; C-7a 109,4<br /> 9 111,68 CH 7,181 (d, J=8,5 Hz) H-8 C-11; C-10; C-8 108,1<br /> 10 145,85 C - 153,9<br /> 11 157,91 C - 148,9<br /> 11a 128,81 C - 128,2<br /> 3-OMe 61,15 CH3 4,284 (s) C-3 60,2<br /> 10-OMe 56,10 CH3 3,814 (s) C-10 56,2<br /> 11-OMe 60,21 CH3 4,026 (s) C-11 56,1<br /> O-CH2-O 101,75 CH2 6,223 (s) C-1; C-2 102,2<br /> <br /> Chất V4 (cassythidine)<br /> Chất V4 được cô lập dưới dạng tinh thể màu<br /> cam đậm, tan trong CHCl3, MeOH, SKLM bằng<br /> hệ dung môi CHCl3 : MeOH : NH4OH đđ (9 : 1 :<br /> 0,2) cho vết tắt quang ở UV 254 nm, hiện hình<br /> bằng thuốc thử Dragendorff xuất hiện vết tròn<br /> màu cam đậm với Rf = 0.5.<br /> Biện giải kết quả phổ chất V4 (cassythidine)<br /> Phổ 1H-NMR cho tín hiệu cộng hưởng ứng<br /> với sự hiện diện hai nhóm proton methoxy H<br /> Hình 1. Công thức cấu tạo của V2 (thalicminine) [4,003 (3H; s; 3-OMe)], năm nhóm proton<br /> <br /> <br /> <br /> 188<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 6 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> methylen trong đó có 2 nhóm ở vùng trường tác với cả hai carbon bậc IV δC (143,357 và<br /> thấp [H 6,037; H 5,952 (O-CH2-O, A; O-CH2-O, 135,125, có thể là C-1 và C-2). Proton của<br /> B)] và [H 5,933; H 5,910 (O-CH2-O, A; O-CH2-O, nhóm methoxy δH (4,003) tương quan với một<br /> B)], số nhóm còn lại ở vùng trường cao [2,630; carbon bậc IV (δC 139,930) do đó carbon bậc IV<br /> 2,697 (H-4A; H-4B); 3,401; 2,925 (H-5A, H-5B); này là C-3 và nhóm methoxy gắn tại vị trí C-3.<br /> 2,763; 2,674 (H-7A, H-7B)], ba nhóm proton Cả hai proton methylen (δH 2,630; δH 2,697) và<br /> methine H [3,853 (1H;H-6), 6,707 (1H; H-8), 7,564 hai proton methylen (δH 2,925; δH 3,401) đều<br /> (1H; H-11)]. cho tương tác với một carbon bậc IV (δC<br /> Các dữ liệu phổ 13C-NMR, DEPT cho thấy A1 119,158) nên dự đoán carbon bậc IV (δC<br /> có tổng số 19 carbon cho tín hiệu phổ từ 20 ppm 119,158) là C-3a. Hơn nữa, hai proton<br /> đến 150 ppm. Trong đó có 10 carbon bậc IV (C), 3 methylen (δH 2,630; δH 2,697) có tương tác một<br /> carbon bậc III (CH), 5 carbon bậc II (CH2) và 1 carbon bậc IV (δC 128,505) và hai proton<br /> carbon bậc I (CH3). Tất cả 10 carbon bậc IV đều methylen (δH 2,925; δH 3,401) tương tác với một<br /> dịch chuyển ở vùng trường thấp (δC từ 115 ppm carbon methine (δC 53,692), nên carbon bậc IV<br /> đến 150 ppm). Trong đó có 5 carbon mang dị tố (δC 128,505) phải là vị trí C-1b, carbon<br /> oxy (δC 143,357; 135,125; 139,930; 146,511; 146,058 methylen (δC 53,692) là vị trí C-6 và hai proton<br /> ppm), các carbon còn lại đều là của nối đôi. methylen (δH 2,630; δH 2,697; H-4) gắn với<br /> carbon (δC 23,814) là ở vị trí C-4 và hai proton<br /> Trong số 3 carbon bậc III có 1 carbon ở<br /> methylen (δH 2,925; δH 3,401; H-5) gắn với<br /> vùng trường cao (δC 53,692 ppm; δH 3,853<br /> carbon (δC 43,048) là ở vị trí C-5. Phổ COSY<br /> ppm), 2 carbon còn lại ở vùng trường thấp<br /> cũng cho tương quan giữa H-4 và H-5.<br /> (105 – 115 ppm).<br /> Dựa vào phổ COSY, H-6 ghép cặp với hai<br /> Có 5 carbon bậc II, trong đó có 2 carbon bậc<br /> proton methylen (δH 2,674; δH 2,801), nên hai<br /> II xuất hiện vùng trường thấp [δC 100,875 ppm,<br /> proton này là H-7a, H-7b. Hai proton H-7a, H-<br /> δH (6,037; 5,952) ppm] và [δC 100,600 ppm, δH<br /> 7b lại gắn với carbon (δC 37,087) do đó carbon<br /> (5,933; 5,910) ppm] . Đây là đặc trưng của nhóm<br /> này là C-7.<br /> methylendioxid thường gặp trong các alkaloid<br /> của chi Stephania. Các carbon bậc II còn lại là các HMBC cho thấy, H-6 có tương quan với<br /> carbon mang nối đơn xuất hiện ở vùng trường carbon bậc IV (δC 128,505) nên carbon bậc IV (δC<br /> cao [δC 43,048 ppm; δH (3,401; 2,925) ppm], [δC 128,505) này là vị trí C-1b. Tương tự H-7 tương<br /> 37,087 ppm; δH(2,763; 2,674) ppm] và [δC 23,814 quan với carbon bậc IV (δC 124,829); (δC 110,924);<br /> ppm; δC (2,630; 2,697) ppm]. (δC 108,467) và (δC 128,742) nên các carbon này<br /> lần lượt là các vị trí C-7a; C-1a; C-8 và C-11a. Một<br /> Có 1 nhóm có độ dời hóa học đặc trưng<br /> proton methine của C-8 (δC 108,467; δH 6,707) cho<br /> của nhóm methoxy [δC 59,469 ppm; δH (4,003;<br /> tương tác với C-7; C-7a và một carbon bậc IV (δC<br /> 3H) ppm].<br /> 146,511) nên carbon bậc 4 này là C-9. Một proton<br /> Với các dữ liệu phổ NMR như trên ta có<br /> methine (δH 7,564) cho tương quan với C-1a và<br /> thể dự đoán V4 là một alkaloid có hai nhóm<br /> C-11a và một carbon bậc IV (δC 146,058) nên<br /> thế methylen dioxid, một nhóm methoxy, ba<br /> proton này là H-11, của carbon vị trí C-11 (δC<br /> nhóm methylen, một nhóm NH và một nhóm<br /> 107,103) và carbon bậc IV (δC 146,058) là C-10.<br /> -OH. Tham khảo các tài liệu công bố đặc điểm<br /> Dựa trên kết quả phổ kết hợp so sánh tài liệu<br /> phổ NMR có thể dự đoán được V4 là khung<br /> tham khảo một cấu trúc tương tự nhưng khác ở<br /> aporphine.<br /> nhóm methylendioxid tại vị trí C-9 và C-10 là<br /> Dựa vào phổ HMBC, hai proton của nhóm<br /> cassythine, có thể nhận định chất V4 là một<br /> methylen dioxid δH (6,037 và 5,952) có tương<br /> aporphine alkaloid có tên cassythidine.<br /> <br /> <br /> 189<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 6 * 2016<br /> <br /> <br /> Bảng 2. Kết quả phổ NMR của V4. δ (ppm), J (Hz), CDCl3 : MeOD (9:1), 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125<br /> MHz).<br /> 1 13<br /> Vị trí H (a) C (a) HMBC COSY<br /> 1 C - 143,357<br /> 1a C - 110,924<br /> 1b C - 128,505<br /> 2 C - 135,125<br /> 3 C - 139,930<br /> 3a C - 119,158<br /> 4 CH2 2,630-2,697 (m) 23,814 C-3a; C-1b H-5<br /> 5 CH2 3,401 (m) 43,048 C-3a; C-6 H-4<br /> 2,925 (td)<br /> 6 CH 3,853 (dd) 53,692 C-1b; C-7 H-7<br /> 7 CH2 2,763-2,801 (dd) 37,087 C-1a; C-6; C-7a; C-8; C-11a H-6<br /> 2,674 m<br /> 7a - 124,829<br /> 8 CH 6,707 (s) 108,467 C-7; C-7a; C-8; C-9<br /> 9 C - 146,511<br /> 10 C - 146,058<br /> 11 CH 7,564 (s) 107,103 C-1a; C-10; C-11a<br /> 11a C - 128,742<br /> 3-OMe 4,003 59,469 C-3<br /> O-CH2-O A 6,037 (d; 3 Hz) 100,875 C-1; C-2<br /> B 5,952 (d; 3 Hz)<br /> O-CH2-O A 5,933 (d; 3Hz) 100,600 C-9; C-10<br /> B 5,910 (d; 2 Hz)<br /> 2. Hoet S, Stevigny C, Block S, Opperdoes S, Colson P,<br /> Baldeyrou B, Lansiaux A, Bailly C and Quetin-Leclercq J<br /> (2004). Alkaloid from Cassytha filiformis and Related<br /> Aporphines: Antitrypanosomal Activity, Cytotocixicity, and<br /> Interaction with DNA and Topoisomerases. Planta Med, 70,<br /> 407-413.<br /> 3. Maekh SKh, Gorovoi PG and Yunusov SY (1976)., Alkaloids of<br /> Thalictrum strictum Vol. III. Khimiya Prirodnykh Soedinenii,<br /> Vol. 4, p. 560, July-August.<br /> 4. Stevigny C, Block S, De Pauw-Gillet MC, De Hoffmann E,<br /> Liabres G, Adjakidje V and Quetin-Leclercq J (2002). Cytotoxic<br /> Aporphine Alkaloid from cassytha filiformis. Planta Med, 68,<br /> 1042-1044.<br /> 5. Viện dược liệu (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt<br /> Nam tập 2. NXB Khoa học kỹ thuật, tr.978.<br /> Hình 2. Cấu trúc của V4 (Cassythidine)<br /> 6. Võ Văn Chi (1997). Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học,<br /> KẾT LUẬN tr.1236.<br /> 7. Wu YC, Chao YC, Chang FR and Chen YY (1997) Alkaloids<br /> Từ cao chiết alkaloid tổng, sử dụng kỹ thuật From Cassytha filiformis Phytochemistry, Vol 46, No, l, pp. 181-<br /> 184.<br /> sắc ký cột diaion HP-20 và silica gel pha thuận<br /> kết hợp kỹ thuật phổ, chúng tôi đã phân lập và<br /> xác định được cấu trúc của 2 hợp chất aporphine Ngày nhận bài báo: 30/08/2016<br /> alkaloid là thalicminine và cassythidine. Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/09/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 25/11/2016<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Chang FR, Chao YC, Teng CM and Wu YC (1998). Chemical<br /> constituents from Cassytha filiformis II. Journal of natural<br /> products, 61, number 7, 863-866.<br /> <br /> <br /> <br /> 190<br />