Phản ứng miễn dịch của tế bào Treg và Th17 ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn HBEAG dương: Mô tả hàng loạt ca

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019<br /> <br /> <br /> PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO TREG VÀ TH17 Ở BỆNH NHÂN<br /> NHIỄM HBV MẠN HBEAG DƯƠNG:MÔ TẢ HÀNG LOẠT CA<br /> Lê Thị Thúy Hằng*, Phan Vĩnh Thọ**, Lương Bắc An***, Nguyễn Thị Tuyết****,<br /> Đường Thị Hồng Diệp***, Đỗ Thị Thanh Thủy***, Phạm Thị Lệ Hoa*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Hậu quả từng thời điểm và kết cục của nhiễm viêm gan siêu vi B (HBV) mạn là kết quả tương tác<br /> giữa hoạt tính siêu vi và phản ứng miễn dịch của cơ thể. Hiện nay, các nghiên cứu miễn dịch tế bào đã cho thấy<br /> hai phản ứng ngược chiều nhau cùng hiện diện trong quá trình này. Phản ứng ức chế của tế bào Treg được xem<br /> là bảo vệ ký chủ với tổn thương quá mức và gây dung nạp HBV. Phản ứng kích hoạt miễn dịch của tế bào Th17<br /> được xem có vai trò thải trừ siêu vi và chấm dứt nhiễm trùng nhưng có thể gây nguy hiểm khi phản ứng quá đà.<br /> Trong quá trình nhiễm HBV, các phản ứng miễn dịch này diễn ra như thế nào chưa được tìm hiểu nhiều. Nghiên<br /> cứu này nhằm mô tả phản ứng của quần thể tế bào Treg và Th17 ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn có HBeAg<br /> dương với các tình trạng tổn thương gan khác nhau.<br /> Thiết kế: mô tả hàng loạt ca thực hiện trên 57 bệnh nhân nhiễm HBV mạn khám ngoại trú tại phòng viêm<br /> gan BV ĐHYD và điều trị nội trú tại BV Bệnh Nhiệt đới TP. HCM, thuộc ba nhóm ALT (2-5ULN và<br /> >10ULN). Phản ứng tế bào Treg và Th17 được đo bằng kĩ thuật Flowcytometry trên máy FACS, tính bằng đơn<br /> vị tỷ lệ % trong quẩn thể CD4+ tại Trung tâm Y Sinh học Phân Tử ĐHYD TP. HCM.<br /> Kết quả: Tỉ lệ tế bào Treg và Th17 ở 3 nhóm ALT theo tuần tự là 1,12% và 1,13%, 0,65% và 1,08%, 3,52%<br /> và 2,71%. Tỉ lệ Treg/Th17 ở các nhóm tương ứng là 1, 0,95 và 1,75. Nhóm ALT >10ULN có phản ứng tế bào<br /> Treg và Th17 cao hơn nhóm ALT không tăng hay tăng ít; đồng thời phản ứng Treg cũng được ghi nhận tăng<br /> nhiều hơn so với phản ứng Th17.<br /> Nhóm có ALT tăng mạnh luôn kèm theo phản ứng Treg mạnh. ½ số trường hợp có ALT không tăng cũng có<br /> phản ứng Treg mạnh. Vai trò gây dung nạp của Treg với HBV cần được tiếp tục khảo sát.<br /> Kết luận: Phản ứng của quần thể Th17 và Treg cao hơn rõ ở nhóm ALT>10 ULN. Phản ứng tế bào Treg và<br /> Th17 thấp (2 to 5<br /> ULN and >10 ALT). Treg and Th17 proportion were measured using Flow Cytometry at Ho Chi Minh City<br /> Center for Molecular Bio-Medicine.<br /> Results: The proprotion of Treg and Th17 cells among CD4+ counts in patients 3 groups of ALT (PNALT,<br /> >2 to 5 ULN and >10 ULN) were 1.12% and 1.13%; 0.65% and 1.08%; and 3.52% and 2.71% respectively. The<br /> ratio of Treg / Th17 were 1, 0.95 and 1.75. The extreme ALT group (>10ULN) had both of highest Treg and Th17<br /> as compared to other groups with predominately higher on Treg than Th17. All of patients in the group with<br /> extremed ALT had also higher Treg response. Otherwise, half of the PNALT group had high Treg response.<br /> Conclusion: The Treg and Th17 responses were highest in the group with extreme ALT. Cases with<br /> PNALT who had high Treg responses need to be further investigate.<br /> Keyword: Treg, Th17 and immune<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ nhóm hoạt tính này điều khiển quá trình diễn<br /> Mặc dù siêu vi viêm gan siêu vi B (HBV) biến qua các giai đoạn của nhiễm HBV. Sự cân<br /> không gây tổn thương gan trực tiếp nhưng các bằng cần thiết của 2 quá trình kích thích và ức<br /> hậu quả bệnh lý của nhiễm HBV là do phản ứng chế miễn dịch này giúp cho việc thải trừ siêu vi<br /> miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu với sự tồn diễn ra dần mà không gây hậu quả tổn thương<br /> tại của vi rút và các kháng nguyên của vi rút mô quá mức, có thể dẫn đến khỏi bệnh. Khi có<br /> trong gan. Các nghiên cứu về miễn dịch tế bào thay đổi trong cân bằng giữa 2 quá trình, cơ thể<br /> cho thấy quần thể tế bào lympho TCD4 có vai có thể diễn ra các đợt diễn biến cấp, các trạng<br /> trò nhận diện kháng nguyên của vi rút và trợ thái hoặc bùng phát viêm gan hoặc dung nạp<br /> giúp phản ứng miễn dịch. Trong nhiễm HBV HBV kéo dài. Vì vậy nhiều bệnh nhân có thể tự<br /> mạn, các tế bào trong quần thể TCD4 này được khỏi bệnh hay diễn biến nhiễm HBV ổn định lâu<br /> nhìn nhận thành 2 nhóm hoạt tính chính gồm dài mà không cần điều trị.<br /> nhóm tế bào Th17 có hoạt tính kích thích miễn Việc điều trị viêm gan B mạn chỉ cần thiết<br /> dịch các và nhóm tế bào Treg có vai trò ức chế cho bệnh nhân không tự kiểm soát được siêu vi<br /> miễn dịch bởi các tế bào Treg. Hoạt động kích (có hoạt tính sao chép, HBeAg dương, HBVDNA<br /> thích miễn dịch của Th17 dẫn đến tổn thương cao) và có bằng chứng tổn thương gan thể hiện<br /> các tế bào mang kháng nguyên, giúp thải trừ bởi tăng ALT hay có thay đổi mô học(4,7). Thêm<br /> siêu vi và dẫn đến kết cục khỏi bệnh. Tuy nhiên vào đó, ngưỡng bình thường của ALT thay đổi<br /> cá thể có phản ứng Th17 quá mức và không theo từng quốc gia từng khu vực vì vậy không<br /> được kiểm soát kịp bởi các hệ thống kìm hãm phản ánh đầy đủ tổn thương gan(6).<br /> miễn dịch có thể diễn biến gây suy gan cấp và tử Một số nghiên cứu cho rằng sự hiện diện<br /> vong. Hoạt tính ức chế miễn dịch bảo vệ cơ thể kháng nguyên HBeAg cao và kéo dài gây quá tải<br /> tránh tổn thương mô quá mức khi phản ứng kháng nguyên và kiệt quệ phản ứng miễn dịch(1).<br /> viêm thải trừ diễn ra quá mạnh nhưng lại là Tuy vậy, HBeAg dương, HBVDNA cao kéo dài<br /> nguyên nhân quan trọng gây dung nạp miễn gặp ở một số bệnh nhân người lớn nhất là ở<br /> dịch với HBV. người trên 40 tuổi cũng được xem là yếu tố nguy<br /> Trong nhiễm HBV mạn, quan hệ giữa 2 cơ của xơ gan và ung thư gan. Nghiên cứu của<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa 131<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019<br /> <br /> chúng tôi nhằm khảo sát và mô tả ban đầu các Tỷ lệ (%) Th17: Tỷ lệ % của tế bào Th17 trong<br /> phản ứng của hai tiểu quần thể TCD4 Treg và quần thể tế bào TCD4 trong máu.<br /> Th17 ở các bệnh nhân nhiễm HBV mạn có Tỷ số giữa tỷ lệ Treg/Th17.<br /> HBeAg dương có các mức tăng ALT khác nhau. Kỹ thuật<br /> ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU ALT thực hiện trên máy sinh hóa tự động;<br /> Thiết kế xét nghiệm HBeAg định tính (S/CO của HBeAg<br /> Mô tả hàng loạt ca. >1), định lượng HBVDNA thực hiện bằng kỹ<br /> Dân số nghiên cứu thuật in-house real time PCR trên máy Cobas,<br /> (ngưỡng phát hiện >300 cps/ml) tại bệnh viện<br /> Bệnh nhân nhiễm HBV mạn khám ngoại trú<br /> ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh và bệnh viện Bệnh<br /> tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Nhiệt đới TP. HCM.<br /> và bệnh nhân viêm gan B mạn đợt bùng phát<br /> điều trị nội trú tại khoa Nhiễm A, Bệnh viện Phân lập và xác định tỉ lệ % tế bào Treg và<br /> Bệnh Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh. Th17 thực hiện trên máy Flowcytometry FACS<br /> tại Trung Tâm Y Sinh học Phân Tử ĐH Y Dược<br /> Thời gian nghiên cứu<br /> TP. Hồ Chí Minh.<br /> Khoa nhiễm A Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới và<br /> Trình tự thực hiện kỹ thuật<br /> Phòng viêm gan Bệnh viện ĐH Y Dược TP. Hồ<br /> Chí Minh từ 3/2018 đến 11/2018. Phân lập tế bào: Thu nhận 4 ml máu toàn<br /> phần từ bệnh nhân vào ống lấy máu có EDTA,<br /> Tiêu chuẩn chọn bệnh<br /> để ở 40C. Xử lý mẫu trong vòng 4 giờ bằng<br /> Bệnh nhân nhiễm HBV mạn có HBeAg phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với Ficoll<br /> dương kéo dài > 6 tháng chưa điều trị và đồng Paque (Sigma Aldrich, USA). Tóm tắt như sau:<br /> ý tham gia nghiên cứu. Thuộc một trong các pha loãng 4 ml máu với 4 ml PBS (-) 1X, đảo nhẹ<br /> nhóm ALT: ống máu 3 -4 lần, sau đó nhẹ nhàng chuyển toàn<br /> Nhóm ALT bình thường kéo dài > 6 tháng bộ 8ml lên bề mặt 6ml Ficoll trong một fancol<br /> (PNALT). sạch, tránh làm xáo trộn bề mặt. Ly tâm 400g,<br /> Nhóm ALT > 2 đến < 5 ULN. 150C trong 30 phút. Thu nhận lớp tế bào trắng<br /> Nhóm ALT > 10 ULN. đục nằm giữa lớp huyết tương và lớp Ficoll. Pha<br /> Tiêu chuẩn loại trừ loãng lớp tế bào vừa mới thu nhận với PBS (-) 1X<br /> với tỷ lệ 1:1, ly tâm với tốc độ 0,5g trong 5 phút.<br /> Không có bệnh gan khác: viêm gan C, HIV,<br /> Rửa pellet tế bào bằng 3 ml PBS (-) 1X, ly tâm với<br /> bệnh gan chuyển hóa,<br /> tốc độ 0,5g trong 5 phút. Tại giai đoạn này, pellet<br /> Bệnh có bệnh kèm theo khác: xơ gan, K gan,<br /> tế bào có chứa cả quần thể tế bào Th17 và Treg.<br /> tiểu đường, bệnh lí khớp,<br /> Xác định tỷ lệ quần thể tế bào Th17/Treg: Tỷ<br /> Không có bất kỳ bệnh lý liên quan với rối<br /> lệ quần thể tế bào Th17 và Treg được xác định<br /> loạn miễn dịch,<br /> bằng bộ Kit Human Th17/Treg Phenotyping của<br /> Không có bệnh nhiễm trùng cấp gây sốt hay BD PharMingen (San Diego, CA). Bộ Kit BD<br /> phản ứng bạch cầu bất thường, PharMingen ở dạng cocktail chứa cả ba kháng<br /> Phụ nữ có thai, cơ địa dị ứng. thể CD4 PerCP, FoxP3 APC và IL 17A PE. Quần<br /> Biến số thể tế bào Th17 và Treg sau khi thu nhận được ủ<br /> Nhóm ALT: gồm 3 nhóm: 2-5 ULN, với PMA/ Ionomycin (50ng/ml: 1mg/ml đối với<br /> >10 ULN với ULN =40U/L. 106 tế bào) trong môi trường RPMI 1640 có bổ<br /> Tỷ lệ (%) Treg: Tỷ lệ % của Treg trong quần sung 10% FCS, ủ trong tủ nuôi với điều kiện 5%<br /> thể tế bào TCD4 trong máu. CO2 và 370C trong vòng 4 giờ đồng hồ. Sau đó,<br /> <br /> <br /> <br /> 132 Chuyên Đề Nội Khoa<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> rửa tế bào với PBS (-) 1X hai lần và thu nhận<br /> pellet tế bào.<br /> Huyền phù pellet tế bào trong 200 ul PBS (-)<br /> 1X. Cố định tế bào trong paraformaldehyde 10%,<br /> vortex nhẹ, ủ trong vòng 5 - 10 phút ở nhiệt độ<br /> phòng. Rửa tế bào bằng PBS (-) 1X 2 lần. Ủ tế bào<br /> với Buffer B 1X trong 30 phút ở nhiệt độ phòng,<br /> trong tối. Rửa tế bào bằng PBS (-) 1X 2 lần.<br /> Huyền phù nhẹ lớp tế bào trong 150 ul PBS (-)<br /> 1X. Bổ sung 10 ul cocktail BD PharMingen,<br /> huyền phù đều với dung dịch tế bào, ủ ở trong<br /> tối trong 45 phút. Sau đó, rửa tế bào bằng PBS (-)<br /> 1X 2 lần, ly tâm 0,5g trong 5 phút, thực hiện<br /> trong điều kiện tránh sáng. Huyền phù pellet tế Biểu đồ 1: Tỷ lệ tế bào Treg ở các nhóm ALT(n=57)<br /> bào trong 300 ul PBS (-) 1X. Phát hiện quần thể tế<br /> bào Th17 và Treg bằng máy flow cytometry<br /> FACS Calibur (BD biosciences, CA, USA), kết<br /> quả phân tích bằng phần mềm FACS Diva (BD<br /> biosciences, CA, USA).<br /> Phân tích và trình bày số liệu: kết quả được<br /> trình bày bằng bảng và biểu đồ và so sánh bằng<br /> phần mềm SPSS16.0, p2% cho đến 9%) nhưng tỷ lệ Th17 phân bố của Treg sẽ gây dung nạp miễn dịch. Ngược lại,<br /> ở các giá trị trung bình hay không cao. quần thể tế bào Th17 có tác dụng kích thích phản<br /> ứng miễn dịch thải trừ siêu vi, gây tổn thương tế<br /> bào và chấm dứt tình trạng nhiễm bệnh. Trong<br /> nghiên cứu ban đầu này, chúng tôi khảo sát<br /> phản ứng của hai quần thể tế bào TCD4+ gồm<br /> Treg và Th17 ở nhóm 29 bệnh nhân có men gan<br /> bình thường (PNALT), nhóm men gan tăng < 5<br /> ULN (8 bệnh nhân) và nhóm ALT > 10 ULN còn<br /> gọi viêm gan bùng phát (20 bệnh nhân). Kết quả<br /> (hình 1 và 2) cho thấy các phản ứng của 2 quần<br /> thể Treg và Th17 chỉ tăng nhẹ với mức độ phản<br /> ứng của 2 quẩn thể tế bào này tương đương<br /> nhau ở các nhóm không có tổn thương gan hay<br /> tổn thương gan không đáng kể (PNALT và ALT<br /> < 5 ULN, tỷ lệ tương ứng là 1,12% và 0,65%).<br /> Biểu đồ 3: Tỉ lệ của Treg/Th17 ở các nhóm ALT Phản ứng kích thích miễn dịch và ức chế miễn<br /> (n=57) dịch (Treg 3,52% và Th17 2,71%) đều tăng nhiều<br /> hơn ở nhóm ALT >10 ULN.<br /> Về cân bằng giữa 2 quần thể Treg và Th17<br /> trong viêm gan B mạn<br /> Trong công bố của các nghiên cứu trước đây,<br /> phản ứng của tế bào Treg và Th17 cùng được<br /> quan sát thấy tăng nhiều hơn ở nhóm viêm gan<br /> bùng phát so với nhóm men gan bình thường<br /> kéo dài và nhóm viêm gan với men gan tăng < 5<br /> ULN, đồng thời các tác giả đều nhận thấy phản<br /> ứng Th17 trong nhóm viêm gan bùng phát tăng<br /> ưu thế hơn phản ứng của tế bào Treg, tỷ lệ<br /> Treg/Th17 10<br /> Biểu đồ 4: Ma trận phân bố Treg và Th17 theo các<br /> ULN, phản ứng của tế bào Treg cũng được ghi<br /> nhóm ALT (n=57)<br /> nhận tăng nhiều hơn, gấp 1,75 so với Th17, phù<br /> BÀN LUẬN hợp giả định rằng phản ứng ức chế miễn dịch đã<br /> Treg và Th17 đều là các tiểu quần thể của tế được huy động mãnh liệt nhằm hạn chế tổn<br /> bào lympho T trợ giúp TCD4+ trong phản ứng thương gan thêm khi cá thể có tổn thương gan<br /> miễn dịch không đặc hiệu. Trong miễn dịch với nghiêm trọng. Có 2 lý giải cho sự khác biệt này:<br /> viêm gan B, hai quần thể này có vai trò quan (1) ở nhóm tổn thương gan diễn ra rầm rộ (ALT<br /> trọng và tác động nghịch chiều nhau trong việc >10 ULN), phản ứng Treg là đáp ứng thứ phát<br /> <br /> <br /> <br /> 134 Chuyên Đề Nội Khoa<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> và diễn ra sau nhưng cần thiết đủ mạnh để đủ dịch trong nhiễm HBV và có hướng dẫn thích<br /> khống chế phản ứng gây tổn thương quá mức hợp hơn trong trị liệu viêm gan B mạn.<br /> của tế bào Th17 nhằm đạt được hiệu quả bảo vệ KẾT LUẬN<br /> đối với phản ứng viêm nặng nề. Điều này phù<br /> Trong khảo sát ban đầu này, có thể quan sát<br /> hợp với kết cục tất cả 20 bệnh nhân trong nhóm<br /> được nhiều kiểu phản ứng trong cân bằng giữa<br /> viêm gan bùng phát đều hồi phục hoàn toàn. (2)<br /> hai quần thể tế bào miễn dịch Treg và Th17 ở các<br /> Các bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng tôi<br /> nhóm ALT. Phản ứng miễn dịch nhẹ nhàng ở<br /> đều không có xơ gan, trong khi đó bệnh nhân<br /> nhóm ALT 10ULN. Thú vị hơn nữa, ở nhóm<br /> hai quần thể tế bào Treg và Th17 ở cá thể có xơ<br /> men gan không tăng, vẫn có nhiều trường hợp<br /> gan với các mức độ xơ gan khác nhau có khác<br /> có phản ứng Treg và Th17. Các khảo sát tiếp trên<br /> nhau hay không với nhóm khỏe mạnh chưa xơ<br /> nhiều nhóm bệnh sẽ hứa hẹn nhiều hiểu biết<br /> gan, có làm thay đổi các kết cục đo lường cũng<br /> mới về bệnh sinh của bệnh lý viêm gan B mạn.<br /> cần được quan sát tiếp(2,3).<br /> Ngoài ra, Biểu đồ 4 cũng cho thấy có các kiểu TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Bertoletti A, Ferrari C (2016). “Adaptive immunity in HBV<br /> phản ứng miễn dịch của TCD4+ khác nhau: hoặc infection”. J. Hepatol, (64): S71–83.<br /> cả hai phản ứng Treg và Th17 cùng ở mức ôn 2. Chen Y, Fang J, Chen X et al (2015). “Effects of the Treg/Th17<br /> hòa, hoặc phản ứng Treg ưu thế, hoặc phản ứng cell balance and their associated cytokines in patients with<br /> hepatitis B infection”. Exp Ther Med, 9(2): 573-578<br /> Th17 ưu thế hoặc cả hai phản ứng đều ở mức 3. Cuiping W, Xuejun D, Qian Y, Zhaoxia S (2018). “Influence of<br /> cao. Nhóm có tăng ALT>10 ULN (biểu tượng Th17/Treg balance on progression of liver cirrhosis in patients<br /> with chronic hepatitis B”. Int J Clin Exp Med, 11(4): 3793-3799<br /> hình sao) đều có phản ứng Th17 và phản ứng<br /> 4. Guidotti LG, Ishikawa T, Hobbs MV et al (1996). “Intracellular<br /> Treg phân bố ở mức cao (> 2-10%). Khi cả hai inactivation of the hepatitis B virus by cytotoxic T<br /> phản ứng Treg và Th17 cùng ở mức thấp (nhóm lymphocytes”. Immunity, (4): 25–36.<br /> 5. Niu YH, Yin DL, Liu HL et al (2013). “Restoring the Treg cell to<br /> ALT < 5 ULN) cho thấy kiểu phản ứng này an Th17 cell ratio may alleviate HBV- related acute-on-chronic liver<br /> toàn nhưng không hứa hẹn thải trừ tốt siêu vi. failure”. World J Gastroenterol, 19(26): 4146-4154.<br /> Thật vậy, trên lâm sàng kết cục chuyển huyết 6. Prati D, Taioli E, Zanella A, Della Torre E et al (2002). “Updated<br /> definitions of healthy ranges for serum alanine<br /> thanh HBeAg dễ diễn ra sau những đợt bùng aminotransferase levels”. Ann Intern Med, (137): 1–9.<br /> phát viêm gan nặng nhưng rất khó diễn ra ở 7. Seto WK, Lai CL, Ip PPC et al (2012). “A large population<br /> histology study showing the lack of association between ALT<br /> bệnh nhân đợt cấp viêm gan B mạn. Ngoài ra<br /> elevation and significant fibrosis in chronic hepatitis B“. PLoS<br /> gần ½ các trường hợp nhóm PNALT có phản One, 7(2): e32622.<br /> ứng tế bào Treg ở mức cao (2-8%) và tế bào Th17 8. Xue-Song L, Cheng-Zhong L, Ying Z, Mo-Bin W (2012).<br /> “Changes of Treg and Th17 cells balance in the development of<br /> ở mức cao (2-9%). Tiếp tục theo dõi dọc và so acute and chronic hepatitis B virus infection”. BMC<br /> sánh các kết cục dung nạp miễn dịch kéo dài hay Gastroenterol, (12): 43.<br /> thải trừ siêu vi hiệu quả với chuyển huyết thanh<br /> HBeAg ở các nhóm phản ứng Treg ưu thế, Th17 Ngày nhận bài báo: 08/11/2018<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 10/12/2018<br /> ưu thế hay cả hai cùng ưu thế sẽ cho chúng ta<br /> Ngày bài báo được đăng: 10/03/2019<br /> những hiểu biết rất quan trọng về cơ chế miễn<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa 135<br />