SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

152
lượt xem 29
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ngày nay cùng với sự phát triển của đời sống, kinh tế, xã hội, nhiều sản phẩm làm từ các chất liệu nhƣ nhựa, nhôm, hợp kim,…,đã ra đời với nhiều công dụng tiện lợi phục vụ cho đời sống tất bật của xã hội loài ngƣời trong giai đoạn phát triển vũ bão. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn không thể nào thay thế đƣợc hoàn toàn sự hiện diện của các sản phẩm đƣợc làm từ gỗ nhƣ: bàn ghế, cửa, kệ, tủ, hàng thủ công mỹ nghệ, tập sách vở…trong các gia đình, công sở, nhà...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên:Trần Thị Thanh Hƣơng Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. VƢƠNG ĐÌNH TUẤN TRẦN THỊ THANH HƢƠNG Niên khóa: 2003-2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007
1 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn Ba Má cùng các anh chị trong gia đình đã nuôi dạy con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài.  Chân thành cảm ơn! Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam bộ Trung Tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh. Đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án tốt nghiệp đúng tiến độ.  Chân thành cảm ơn! Tất cả các Thầy Cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức cho lớp chúng tôi trong thời gian học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Chân thành cảm ơn! TS.Vƣơng Đình Tuấn TS. Nguyễn Quốc Bình Đã luôn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài.  Chân thành cảm ơn! Chị Ngô Huỳnh Phƣơng Thảo và tất cả các anh, chị và các bạn lớp Công nghệ sinh học 29, đã không ngừng động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiên đề tài. Xin chân thành tri ân! Sv: TRẦN THỊ THANH HƢƠNG
2 TÓM TẮT TRẦN THỊ THANH HƢƠNG, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)”. Hƣớng dẫn khoa học: TS.Vƣơng Đình Tuấn  Thời gian nghiên cứu Từ tháng 3/2007 đến 8/2007.  Địa điểm nghiên cứu Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ . Trung tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh.  Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Từ đó xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao.  Yêu cầu - Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm. - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam.  Phƣơng pháp nghiên cứu - Sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA ly trích từ mẫu lá của 100dòng Keo lá tràm thu đƣợc với 9cặp mồi.  Kết quả - Bƣớc đầu thanh lọc đƣợc một số cặp mồi SSR đƣợc sử dụng cho phân tích đa dạng di truyền. Và có sự khác nhau về trọng lƣợng các bands của các cá thể phân tích và có sự biến động di truyền giữa các cá thể.  Kết luận
3 - Thí nghiệm đã thanh lọc đƣợc một số cặp mồi (Am 341, Am 326 và Am 770) có thể cho hiệu quả phân tích đa dạng di truyền Keo lá tràm khá tốt.
4 MỤC LỤC ĐỀ MỤC ...................................................................................................... TRANG TRANG TỰA ........................................................................................................... ii LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................... iv MỤC LỤC ................................................................................................................ v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ................................................................. x Phần 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Yêu cầu và mục đích nghiên cứu của đề tài ....................................................... 2 1.4 Giới hạn của đề tài ............................................................................................. 2 Phần 2. TỔNG QUAN ............................................................................................. 4 2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học ........................................................................... 4 2.1.1 Định nghĩa ....................................................................................................... 4 2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học ......................................................................... 4 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học ................................................................. 4 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái............................................................................ 4 2.1.3.2 Đa dạng loài ................................................................................................. 5 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền .................................................................................... 6 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền ........................ 7 2.2.1 Phân loại .......................................................................................................... 7 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ..................................... 8 2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) ..................................... 9 2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) ........................ 10 2.2.5 SSR (Microsatellite) ...................................................................................... 10
5 2.3 Kỹ thuật Microsatellite ..................................................................................... 11 2.3.1 Khái niệm về Microsatellite .......................................................................... 11 2.3.2 Tính chất ........................................................................................................ 12 2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite ......................................................... 13 2.3.4 Giới hạn của Microsatellite ........................................................................... 14 2.3.5 Các loại Microsatellite .................................................................................. 15 2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite ........................................... 15 2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite .............................................................. 15 2.3.6.2 Vai trò của Microsatellite ........................................................................... 17 2.3.7 Các phƣơng pháp phát hiện Microsatellite ................................................. 18 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai ......................................................................................... 18 2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR ...................................................................................... 19 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................. 19 2.4.1 Khái niệm ...................................................................................................... 19 2.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR ............................. 20 2.4.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR.......................................................................... 23 2.4.5 Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR ............................................................ 23 2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật ...................................................................... 23 2.5.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .......................................... 25 2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di ...................................... 26 2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) .................................. 28 2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) .......................................................................... 28 2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các loài Keo .......................................................... 28 2.6.1.2 Công dụng của các loài Keo (Acacia) ........................................................ 30 2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) ........ 32 2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái ............................................................ 33 2.6.2.2 Công dụng và tiềm năng gây trồng ............................................................ 35 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................... 36
6 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện....................................................................... 36 3.1.1 Thời gian thực hiện ....................................................................................... 36 3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 36 3.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................... 36 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .................................................................................. 36 3.4 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 37 3.5 Ly trích DNA ................................................................................................... 37 3.5.1 Hóa chất ....................................................................................................... 37 3.5.2 Quy trình ly trích DNA ................................................................................. 38 3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích ................................................................. 40 3.6.1 Qui trình phản ứng PCR ................................................................................ 40 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR .................................................................................. 42 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 44 4.1 Quá trình ly trích ............................................................................................. 44 4.2 Phản ứng PCR .................................................................................................. 44 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 48 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 48 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 50 PHỤ LỤC
7 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  µg: microgram  µM: micromol/lite  Al: Allele  bp: base pair  M:mét  cm: centimét  CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid  dNTP: Deoxynucleotide triphosphate  EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid  EtBt: Ethidium bromide  Kb: kilobases  mM: milimolar (milimol/lite).  PCR: Polymerase chain reaction  RNA: Ribonucleic acid  RNase: Ribonuclease  SSR: Single sequence repeat  Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)  TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)  Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính của Taq  UV: Ultra Violet
8 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ..................................................... 16 Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã ................................................. 16 Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR ................................................... 20 Hình 2.4: Hình thái lá các loài Keo(Acacia) .......................................................... 29 Hình2.5:Hình thái một số loài Keo ........................................................................ 30 Hình 2.6. Keo lá tràm ............................................................................................. 33
9 DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005) ......... 8 Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose ..................................... 27 Bảng 2.3: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide ........................ 27 Bảng 2.4:Các ancaloit trong các loài Keo (Alexander Shulgin. TiHKAL) ............ 32 Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA .............................. 38 Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ........................................................ 41 Bảng 3.3: Trình tự các SSR’Primer sử dụng .......................................................... 41 Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA ................................................................. 39
10 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay cùng với sự phát triển của đời sống, kinh tế, xã hội, nhiều sản phẩm làm từ các chất liệu nhƣ nhựa, nhôm, hợp kim,…,đã ra đời với nhiều công dụng tiện lợi phục vụ cho đời sống tất bật của xã hội loài ngƣời trong giai đoạn phát triển vũ bão. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn không thể nào thay thế đƣợc hoàn toàn sự hiện diện của các sản phẩm đƣợc làm từ gỗ nhƣ: bàn ghế, cửa, kệ, tủ, hàng thủ công mỹ nghệ, tập sách vở…trong các gia đình, công sở, nhà hàng, khách sạn, phòng triển lãm, khu trƣng bày, trƣờng học,…Do các sản phẩm làm từ gỗ mang lại sang trọng, ấm cúng, gần gũi với thiên nhiên cho không gian sử dụng, và chúng còn có thể tái chế. Vậy mà thực tế cho thấy nguồn nguyên liệu gỗ ngày càng suy kiệt, giảm chất lƣợng do sự khai thác bừa bãi, nạn phá rừng của con ngƣời, thiên tai lũ lụt, hạn hán, cháy rừng, sự ô nhiễm môi trƣờng... Keo lá tràm hay còn gọi Keo bông vàng, là loại cây mọc nhanh có xuất xứ từ Australia, Papua, New Guinea và Indonesia,…(Turnbull,1986). Đƣợc du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60 của thế kỉ XX, với mục đích chủ yếu là cung cấp nguồn nguyên liệu cho sản xuất giấy, làm đồ trang trí nội thất, làm than củi,... (http://snnptnt.thanhhoa.gov.vn). Tại Việt Nam hiện nay, Keo lá tràm đƣợc trồng phổ biến ở nhiều địa phƣơng, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Trung và vùng Đông Nam Bộ. Keo lá tràm đóng góp một cách có ý nghĩa trong ngành công nghiệp sản xuất giấy, nghề chế tác hàng thủ công mỹ nghệ và cũng nhƣ đời sống của nông dân trồng rừng (Bùi Việt Hải,1998). Vì vậy việc chọn và tạo giống Keo lá tràm chất lƣợng cao với năng suất cao, chống chịu sâu bệnh là một nhu cầu hết sức cấp thiết đặt ra cho ngành lâm nghiệp. Việc nghiên cứu chọn giống Keo cũng đã đƣợc triển khai từ hàng chục năm nay ở Viện Khoa học lâm nghiệp nhƣng biện pháp chủ yếu là nhập hạt giống chất lƣợng cao, khảo nghiệm và chọn giống theo phƣơng pháp cổ điển của các dòng cây trội. Việc nghiên cứu chọn giống Keo sử dụng chỉ thị phân tử
11 hoặc trên các cơ sở kỹ thuật cao hầu nhƣ chƣa có nhiều. Các phƣơng pháp chọn giống cổ điển tuy đã góp phần hình thành nên những giống vật nuôi đa dạng, nhƣng do chỉ tiêu chọn thuộc về hình thái, chủ yếu về kiểu hình và chỉ tiêu sinh hóa thƣờng không ổn định và chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi môi trƣờng. Sử dụng chỉ thị phân tử (DNA marker) để chọn giống sẽ bỏ qua các biến động không di truyền đồng thời theo dõi đƣợc các biến động di truyền không thể hiện ra kiểu hình. Hiểu biết về cấu trúc di truyền phân tử sẽ giúp chúng ta có cơ sở vững chắc trong việc sử dụng nguồn tài nguyên thực vật một cách có hiệu quả hơn để cải thiện giống cây trồng, phục vụ tốt hơn công tác quản lí và bảo tồn đa dạng sinh học, rút ngắn thời gian của quá trình chọn, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng. Nhằm góp phần đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) ở Việt Nam, đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis)” đƣợc thực hiện do sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học và sự hƣớng dẫn chính của TS. Vƣơng Đình Tuấn. 1.2 Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Tƣd đó xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao. 1.3 Yêu cầu - Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm. - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam. 1.4 Giới hạn của đề tài Do quỹ thời gian và kinh phí còn hạn chế nên chúng tôi mới chỉ dừng lại ở việc thanh lọc các cặp mồi SSR để tìm ra những cặp mồi thích hợp cho những nghiên cứu tiếp theo trong việc hoàn thiện đánh giá đa dạng di truyền Keo lá tràm. Và đề tài chỉ thực hiện trên một số mẫu nghiên cứu thu thập đƣợc ở Trạm thực
12 nghiệm lâm nghiệp Bàu Bàng(Bình Dƣơng) của Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam.
13 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học 2.1.1 Định nghĩa Thuật ngữ "đa dạng sinh học" lần đầu tiên đƣợc Norse và McManus (1980) định nghĩa, bao hàm hai khái niệm có liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính đa dạng về mặt di truyền trong một loài) và đa dạng sinh thái (số lƣợng các loài trong một quần xã sinh vật). Đa dạng sinh học (Biodiversity) là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002). Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất định nghĩa: “ Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”. 2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học Sự đa dạng của sinh vật trong thiên nhiên chứa dựng vẻ đẹp vô tận, đó chính là nguồn cảm hứng sáng tạo và cũng là nguồn kiến thức phong phú của nhân loại. Sự đa dạng sinh học cung cấp cho con ngƣời nguồn thức ăn phong phú và đa dạng chủng loại; cung cấp nguồn hàng hoá và nguyên vật liệu phong phú và cần thiết cho nông nghiệp, cho dƣợc học, cho khoa học công nghệ. Đa dạng sinh học là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp. Ngoài ra đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng từ đó tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta. 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái Đây là sự đa dạng bao trùm và cao nhất của đa dạng sinh học.
14 Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều kiện nhất định và mối quan hệ tƣơng hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi trƣờng. Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh. Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau giữa các quần xã sinh vật. Quần xã này đƣợc tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với nhau và với các điều kiện sống (đất, nƣớc, khí hậu, địa hình) (OTA, 1987; FAO, 1990). Vậy hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao. Điều kiện môi trƣờng càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đó càng đa dạng. 2.1.3.2 Đa dạng loài Sự đa dạng loài đƣợc thể hiện bằng số lƣợng loài khác nhau cùng sống trong một vùng nhất định. Loài đƣợc xác định theo cấu tạo hình thái của loài hoặc theo phân loại sinh học(http://www.nea.gov.vn). Theo cấu tạo hình thái của loài: sự đa dạng loài xác định theo nhóm cá thể có những hình thái, sinh lý hoặc hoá sinh đặc trƣng, khác biệt với các nhóm khác. Thƣờng đƣợc vận dụng để định danh loài, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới. Phân loại sinh học loài: sự đa dạng loài xác định theo nhóm cá thể có khả năng giao phối với nhau tạo con lai hữu thụ, không giao phối sinh sản với các nhóm khác. Cách này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hoá khảo sát mối quan hệ về gene. Theo Rojas và Stanley (1992), những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và định loại các loài trên thực tế thƣờng phức tạp hơn nhiều so với lý thuyết. Một loài có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt dựa theo đặc điểm cấu tạo và hình thái. Nhƣng, đôi khi các phân loài giống nhau đến mức tƣởng nhƣ là chúng cùng một loài.
15 Vì vậy nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới chƣa đƣợc biết đến, nhằm tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết. 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền Đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học. Đa dạng di truyền thể hiện qua sự khác nhau của tất cả các gen di truyền của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật. Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể tồn tại trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau (http://www.nea.gov.vn/html/DDDT). Đa dạng di truyền tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể.Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền. Nghiên cứu về đa dạng di truyền là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài. Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài chịu ảnh hƣởng bởi tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể. Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gene khác nhau. Sự đa dạng về bộ gene này là do các cá thể có các gene khác nhau, dù chỉ là rất ít (Lâm Vỹ Nguyên, 2006). Những hình thái khác nhau của gene đƣợc thể hiện bằng những alleles và những khác biệt do sự đột biến. Những alleles khác nhau của một gene có thể ảnh hƣởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau. Những sự khác biệt về gene trong di truyền học tăng dần khi con cái nhận đầy đủ tổ hợp gene và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các gene trong quá trình sinh sản. Các gene trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp mới đƣợc thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống nhất mới cho con cái. Tổng các gene và alleles trong một quần thể là vốn gene của quần thể và những tổ hợp của các alleles mà mỗi cá thể có đƣợc gọi là kiểu gen – kiểu di truyền (genotype). Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể đƣợc biểu hiện bởi các đặc điểm
16 về hình thái, sinh lý, hoá sinh và đƣợc đặc trƣng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trƣờng nhất định. Số lƣợng khác biệt nhau về gene trong một quần thể đƣợc xác định bởi số gene trong vốn gene đó, thƣờng mỗi gene có nhiều hơn một allele (các gene đa hình) và số các alleles cho mỗi một gene đa hình. Sự tồn tại của các gene đa hình cho phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gene dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận đƣợc những alleles khác nhau từ các gene của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gene cho phép các loài thích ứng đƣợc với sự thay đổi của môi trƣờng. 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền 2.2.1 Phân loại Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào đƣợc dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể xem nhƣ một DNA marker. Những marker có tính chất nhƣ vậy rất cần thiết vì số lƣợng của chúng lớn hơn rất nhiều so với các marker hình thái, marker ở dạng protein (isoenzyme) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005). Dựa vào kỹ thuật thực hiện các DNA marker có thể chia làm hai nhóm (Bài giảng CNSH cây trồng, Phạm Thành Hổ): - Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP. - Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD. Dựa trên kiểu hình có thể chia DNA marker thành hai nhóm (CNSH cây trồng, Phạm Thành Hổ): - Marker đồng trội: Những marker có thể phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Bao gồm marker allozyme, Microsatellite, RFLP. - Marker trội: Những marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử. Bao gồm RAPD, AFLP.
17 Bảng 2.1 : Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005) Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ RAPD Random Amplified Polymorphic DNA AP-PCR Arbitrary Primer-PCR DAF DNA Amplification Fingerprinting AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ALP Amplicon Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite) SSCP Single Strand Conformation Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single Nucleotide Polymorphism STS Sequence-Tagged Sites 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền. RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn đƣợc tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác (Wayne Powell và ctv,1996). Ngày nay, RFLP là kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gene. DNA bộ gene sẽ đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (đƣợc đánh dấu phóng xạ) liên kết với một
18 locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau (Wayne Powell và ctv,1996). RFLP có ƣu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thƣớc DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lƣợng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ ngƣời nghiên cứu (do phải sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lƣợng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này. Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA đƣợc khuếch đại đƣợc cắt bằng các restriction enzyme, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bƣớc lai phóng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phƣơng pháp RFLP. 2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt ( Powell et al, 1996; Winfield et al, 1998) Thông thƣờng, trong AFLP sử dụng một cặp restriction enzyme gồm một enzyme cắt thƣờng xuyên và một enzyme cắt không thƣờng xuyên. Enzyme cắt thƣờng xuyên tạo ra những trình tự nhỏ và enzyme cắt không thƣờng xuyên sẽ nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt. Cặp enzyme thƣờng đƣợc dùng nhất là EcoRI - MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản