SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:40

Thêm vào BST

Báo xấu

114
lượt xem 17
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Công nghệ sinh học đang ngày càng thể hiện tầm quan trọng trong rất nhiều ngành khoa học nhƣ chăn nuôi, thực vật, thực phẩm...Áp dụng kỹ thuật gen trong nghiên cứu di truyền đã làm tăng cấp độ và hiệu quả của việc cải thiện cây trồng và chăn nuôi. Một điều kiện tiên quyết để đạt ƣu điểm của những phƣơng pháp này là khả năng tách chiết và tinh sạch DNA đạt yêu cầu số lƣợng và giữ nguyên cấu trúc. Sự phát triển của những phƣơng pháp tinh sạch DNA hiệu quả từ nhiều nguồn mẫu...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** BÙI THỊ NGỌC BÍCH SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN BÙI THỊ NGỌC BÍCH KS. NGUYỄN VĂN ÚT Khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** USE SOME CHEMICALS TO ENHANCE ABILITY OF EXTRACTING DNA FROM HAIR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: Ph. D. TRAN THI DAN BUI THI NGOC BICH Ba. NGUYEN VAN UT Term: 2002 – 2006 HCMC 9/2006
LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: * Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng Quý thầy cô đã tạo điều kiện tốt đẹp cũng nhƣ truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. * Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. * Tập thể cán bộ thú y và các cô chú tại lò mổ tập trung huyện Dĩ An – Bình Dƣơng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình lấy mẫu. * PGS. TS. Trần Thị Dân, KS. Nguyễn Văn Út đã hƣớng dẫn tận tình, để tôi hoàn thành tốt đề tài. * Bạn Lƣơng Quý Phƣơng đã giúp tôi lấy mẫu lông để thí nghiệm. * Các anh chị tại Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP HCM đã tạo mọi điều kiện cơ sở vật chất, kỹ thuật để tôi làm tốt đề tài. * Xin cảm ơn bạn bè ở lớp CNSH 28 đã giúp đỡ tôi và cùng học tập trong suốt 4 năm đại học. Sinh viên thực hiện Bùi Thị Ngọc Bích iii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN BÙI THỊ NGỌC BÍCH, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9/2006, “SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG”. Hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Trần Thị Dân 2. KS. Nguyễn Văn Út Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 14 – 02 – 2006 đến ngày 30 – 07 – 2006 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Trong các thí nghiệm sinh học phân tử, ngƣời ta thƣờng sử dụng mẫu máu, da, cơ để ly trích DNA. Tuy nhiên, nhiều khi ta không thể có những loại mẫu đó, ví dụ trong khoa học hình sự hay khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm. Ngoài ra, thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác trên thú sống. Với mục đích tìm một quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lông, đề tài đƣợc tiến hành trên lông bò và lông heo. Kết quả ly trích đƣợc đánh giá dựa vào tỷ số OD của mẫu DNA và hiệu suất thành công của PCR với đoạn mồi phân biệt giới tính và đoạn mồi phát hiện gen halothane. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1. Dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K và Ca2+ ở các nồng độ 2 mM, 6 mM và 10 mM cho DNA với tỷ số OD đạt khoảng 1,6 – 1,69. Trong đó, sản phẩm PCR từ DNA của gốc lông bò khi ly trích với dung dịch đệm có 10 mM Ca2+ cho 1 băng dài 370 bp của gen giới tính. 2. DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và gốc lông bò không có sự khác biệt nhau về tỷ số OD và hàm lƣợng . 3. DNA từ gốc lông bò (tỷ số OD trung bình 1,76) tinh sạch và có hàm lƣợng cao hơn DNA từ ngọn lông (1,2). 4. DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh sạch hơn DNA từ dung dịch đệm không có DTT (1,58). iv
5. Nồng độ CTAB trong quá trình ly trích có ảnh hƣởng đến độ tinh sạch của DNA. Không bổ sung CTAB cho tỷ số OD cao nhất (1,84 ); 0,06% CTAB cho OD = 1,6; 0,2% CTAB cho OD = 1,3. 6. Sử dụng BSA cũng không có tác dụng trong việc cải thiện kết quả PCR vì không nhân đƣợc đoạn DNA 655 bp của gen giới tính. Nhìn chung, các hoá chất đƣợc bổ sung vào quy trình ly trích DNA và hỗn hợp PCR chỉ cho đoạn sản phẩm PCR ngắn (370 bp) mà không có đoạn DNA dài (655 bp) của gen giới tính. Đồng thời, các thí nghiệm đều không cho kết quả mong muốn khi PCR phát hiện gen halothane trên 5 mẫu lông heo. v
MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn ....................................................................................................................... 1 Tóm tắt khóa luận ...........................................................................................................iv Mục lục ...........................................................................................................................vi Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii Danh sách các bảng ........................................................................................................ix Danh sách các hình và biểu đồ ........................................................................................x PHẦN I. MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu ..................................................................................................1 1.2.1. Mục tiêu .............................................................................................................1 1.2.2. Yêu cầu ..............................................................................................................2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3 2.1. Cấu trúc tổng quan của lông .....................................................................................3 2.2. Cấu trúc của lông bò và lông heo .............................................................................3 2.3. Cấu trúc của melanin ................................................................................................4 2.4. Cấu tạo của keratin ...................................................................................................5 2.5. Những công trình tách chiết DNA từ lông ...............................................................5 2.6. Nguyên tắc của PCR .................................................................................................7 2.7. Nguyên tắc xác định gen giới tính và gen halothane ................................................9 2.7.1. Nguyên tắc xác định gen giới tính .....................................................................9 2.7.2. Nguyên tắc xác định gen halothane ...................................................................9 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................11 3.1. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................11 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành..............................................................................11 3.3. Vật liệu ...................................................................................................................11 3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA ............................................................................11 3.3.2. Đoạn mồi ......................................................................................................... 11 3.3.2.1. Đoạn mồi của gen xác định giới tính........................................................11 vi
3.2.2.2. Đoạn mồi của gen halothane ....................................................................12 3.4. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .............................................................................12 3.4.1. Lấy và trữ mẫu .................................................................................................12 3.4.2. Tách chiết DNA ...............................................................................................12 3.4.3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA ly trích .........................................15 3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR ................................................................................15 3.4.4.1. Multiplex PCR xác định giới tính ............................................................15 3.4.4.2. PCR xác định gen halothane..................................................................... 16 3.4.5. Điện di và quan sát kết quả..............................................................................17 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose ................................................................................17 3.4.5.2. Kết quả điện di PCR .................................................................................17 3.5 Xử lý số liệu ............................................................................................................ 17 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................18 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích DNA ............18 4.2. Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò ...............................19 4.3. Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò ................................20 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát tác dụng của DTT trong việc phân cắt keratin khi ly trích DNA...............................................................................................................................21 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin ..............23 4.6. Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA trong phản ứng PCR ................................................23 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................25 5.1. Kết luận...................................................................................................................25 5.2. Đề nghị ...................................................................................................................25 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................26 PHỤ LỤC ......................................................................................................................28 vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair ctv cộng tác viên DNA deoxyribonucleic acid NST nhiễm sắc thể OD optical density DTT Dithiothreitol CTAB Cetyltrimetylamonium bromide BSA bovine serum albumine PCR polymerase chain reaction Taq thermus aquaticus Tỷ số OD tỷ số OD260 nm /OD280 nm UI unit UV ultra violet W wave viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi của gen xác định giới tính ........................................12 Bảng 3.2 Thành phần hỗn hợp PCR xác định giới tính .................................................15 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định giới tính ...................................................16 Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane .......................................16 Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane ..........................................17 Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+ ......18 Bảng 4.2a Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 vị trí lông bò ............................19 Bảng 4.2b Kết quả PCR từ 2 vị trí lông bò ...................................................................19 Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 nguồn lông ................................21 Bảng 4.4 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ việc sử dụng DTT ........................22 Bảng 4.5 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 3 mức CTAB ................................23 Bảng 4.6 Kết quả PCR tƣơng ứng với nồng độ BSA đƣợc bổ sung ............................. 24 ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Hình 2.1 Chu kỳ đầu tiên trong PCR ..............................................................................7 Hình 2.2 Chu kỳ thứ hai trong phản ứng PCR ..............................................................8 Hình 4.1 Kết quả PCR từ mẫu có 10 mM Ca2+ .............................................................19 Hình 4.2 Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông bò .....................................................20 Hình 4.3 Kết quả PCR với DNA từ gốc lông heo và gốc lông bò ................................21 Hình 4.4 Kết quả PCR từ mẫu có DTT và không DTT .................................................22 Hình 4.6 Kết quả PCR từ mẫu sử dụng và không sử dụng BSA ...................................24 Biểu đồ 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+ ..18 Biểu đồ 4.2 Tỷ số OD của DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông bò .........................19 Biểu đồ 4.3 Tỷ số OD của DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và lông bò ...................21 Biểu đồ 4.4 So sánh DNA ly trích bởi dung dịch đệm có DTT và không có DTT ....... 22 Biểu đồ 4.5 Tỷ số OD của DNA ly trích bởi dung dịch đệm có và không có CTAB ...23 x
1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Công nghệ sinh học đang ngày càng thể hiện tầm quan trọng trong rất nhiều ngành khoa học nhƣ chăn nuôi, thực vật, thực phẩm...Áp dụng kỹ thuật gen trong nghiên cứu di truyền đã làm tăng cấp độ và hiệu quả của việc cải thiện cây trồng và chăn nuôi. Một điều kiện tiên quyết để đạt ƣu điểm của những phƣơng pháp này là khả năng tách chiết và tinh sạch DNA đạt yêu cầu số lƣợng và giữ nguyên cấu trúc. Sự phát triển của những phƣơng pháp tinh sạch DNA hiệu quả từ nhiều nguồn mẫu khác nhau là mối quan tâm đối với những phòng thí nghiệm mô hình mẫu. Công việc này đang là thử thách đối với những vật liệu chứa một hàm lƣợng lớn polysaccharide hay những chất thứ cấp nhƣ polyphenol, terpene, resin… Tách chiết DNA từ máu, thịt rõ ràng không phức tạp và dễ thành công. Các mẫu này thƣờng đƣợc dùng cho hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên, các nguồn mẫu khác nhƣ lông, da, xƣơng… cũng cần đƣợc quan tâm. Loại mẫu này thƣờng chứa lƣợng DNA ít, nhiều protein và chất hữu cơ nên việc ly trích trở nên khó khăn khi muốn tinh sạch và có đủ lƣợng DNA cho bất kỳ phân tích nào. Lông có thể là nguồn DNA cho những nghiên cứu không ảnh hƣởng đến cơ thể sống. Tuy nhiên, lông chứa một lƣợng rất nhỏ DNA, do đó tìm ra một phƣơng pháp để tách chiết DNA từ lông là hết sức quan trọng. Vấn đề quan tâm nhất hiện nay đối với mẫu lông là lƣợng nhỏ DNA, chứa nhiều protein ức chế và quy trình tách chiết không đặc hiệu. Do đó hoàn thiện quy trình tách chiết DNA từ lông cho những thí nghiệm xa hơn là cần thiết. Từ việc thử nghiệm những quy trình ly trích, một bộ kit có thể đƣợc tạo sẽ giúp việc tách chiết đƣợc thực hiện nhanh, và có thể đƣợc thƣơng mại hóa vì vấn đề này vẫn còn đang bỏ ngỏ. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu Đánh giá ảnh hƣởng của một số hóa chất trong quy trình tách chiết DNA từ lông, trên cơ sở hoàn thiện quy trình ly trích và tạo bộ kit ly trích lông sau này.
2 1.2.2. Yêu cầu - Thay đổi quy trình tách chiết DNA từ lông heo, bò bằng cách bổ sung canxi, DTT, CTAB trong dung dịch đệm ly trích, và bổ sung BSA trong hỗn hợp PCR. - Kiểm tra hiệu quả quy trình tách chiết thông qua đo OD và phản ứng PCR với gen mục tiêu là giới tính (trên bò) và halothane (trên heo).
3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cấu trúc tổng quát của lông Theo Hairhandout (2005), lông có 3 vùng hình thái học: lớp cutin, vỏ, lõi. - Lớp cutin: là 1 lớp mờ bên ngoài của thân lông chứa những vảy bao lấy thân. Có 3 cấu trúc vảy cơ bản tạo lên lớp cutin – vòng hoa, cánh hoa, mái ngói. - Lớp vỏ: là thân chính của lông chứa những tế bào thon dài và mảnh. Nó chứa cortical fusi, hạt sắc tố, và / hoặc những cấu trúc có hình dạng từ bầu dục đến hình tròn lớn gọi là thân hình trứng. - Lõi: là trung tâm của những tế bào có thể hiện diện trong lông. Thành phần cơ bản của lông là keratin (1 loại protein), melanin (1 loại sắc tố), và 1 lƣợng rất nhỏ nguyên tố kim loại. 2.2. Cấu trúc của lông bò và lông heo Theo Wagner và ctv (1996), lông không chỉ bao gồm thân lông chết nhìn thấy bên ngoài da mà còn bao gồm phần gốc đang phát triển trong da. Phần gốc nằm trong da đƣợc bao quanh bởi bao gốc lông, để lộ ra cấu trúc phức tạp và khác nhau. Cấu trúc này thƣờng đƣợc tìm thấy trong tất cả động vật có vú. Tại phần đế của lông có hình dạng nhƣ chuông (hành lông), bao quanh là một nhú da nhỏ, hình dạng này phụ thuộc vào lớp biểu bì hình ngói của da. Chức năng của hành lông là dinh dƣỡng cho những tế bào đang phát triển của lông. Những tế bào gần nhú lông không khác nhau và là vùng tái sinh của lông, bao gồm cả bao gốc. Phụ thuộc vào vị trí của chúng trong hành lông, những tế bào đƣợc tạo ra sau trong vùng này khác nhau về những loại tế bào mà nó sẽ tạo ra lông và mô xung quanh nó. Mô này chứa năm lớp đồng tâm khác nhau, ba lớp trong cùng hợp thành bao gốc trong cùng (inner root sheath – IRS). Tiếp xúc trực tiếp với lớp cutin của lông là cutin của IRS (IRS – cutin), tiếp theo là hai lớp, lớp Huxley và lớp Henle. Lớp kèm (companion layer – CL) là lớp tiếp theo bên trong bao gốc. Lớp này cũng đƣợc gọi là lớp trong cùng của bao gốc bên ngoài (outer root sheath – ORS) hay bao gốc giữa. Lớp ngoài cùng của bao gốc là ORS, bao quanh bởi những lớp khác nhau và lông. Lớp ORS
4 không chỉ nằm trong phần nhú da của gốc lông, mà còn trong phần thân lông, thay đổi bên trong lớp biểu bì tại điểm kết thúc của nó. Những lớp của bao gốc IRS chứa ba lớp tế bào khác nhau. Lớp trong cùng của nó là cutin (IRS – cutin), những tế bào của nó là những tế bào nhỏ nhất của lông với bề dày dƣới 1 mm. Chúng có hình dạng và cách xếp lớp giống vảy cá. Lớp cutin đƣợc theo sau bởi hai lớp tế bào đơn từ những tế bào có cấu trúc tƣơng tự: lớp Huxley bên trong và Henle bên ngoài. Những lớp này chứa những tế bào có hình dạng thon dài và hình ngọn giáo bao quanh bề mặt nhẵn của lớp cutin – IRS. Ba lớp IRS có sự keratin hóa xảy ra tại những thời điểm khác nhau. Tiến trình này chịu trách nhiệm cho cấu trúc cứng giống da của ba lớp tế bào này. Ý nghĩa sinh lý học của tiến trình này chƣa đƣợc biết. Lớp đầu tiên bị keratin hóa là lớp Henle. Lớp tiếp theo là lớp cutin – IRS. Lớp Huxley giữa hai lớp này vẫn là cấu trúc sợi nhỏ của mô ngắn, không bị keratin hóa. Lớp CL bao quanh IRS. Nó có thể đƣợc thấy trong phần chiều dài gần lớp Henle nhƣ là một lớp sáng hơn, mỏng hơn. Nó gồm một lớp những tế bào hình chữ nhật, dát mỏng. ORS là lớp ngoài cùng của gốc lông. Nó tiếp xúc trực tiếp với CL và xung quanh chứa những tế bào hình khối. 2.3. Cấu trúc của melanin Trong nghiên cứu của Rees (2003) tế bào melanin tạo những hạt melanin chứa một enzyme gọi là tyrosinase. Enzyme này chứa Cu, tổng hợp sự chuyển đổi oxy hóa của DOPA (tyrosine) thành một sắc tố gọi là melanin. Tế bào melanin có nguồn gốc từ những tế bào thần kinh di chuyển vào biểu bì trong tháng thứ 3 đầu tiên. Việc tạo melanin đi cùng với việc tạo 1 vài chất trung gian độc và xảy ra chủ yếu trong hạt giống nhƣ lysosome (hạt melanin). Hạt melanin đƣợc tiết ra trong những tế bào keratin qua cơ chế đƣợc mô tả khá ít. Cơ chế hóa học của melanin là phức tạp và chƣa đƣợc hiểu nhiều do những đặc điểm của nó là 1 phức hợp của nhiều polymer, những chất trung gian tự oxy hoá nhanh chóng và không ổn định, phƣơng pháp hòa tan melanin làm thay đổi cấu trúc cơ bản của nó. Sự tạo màu lông và màu biểu bì có cơ chế tƣơng tự nhau. Trong nang lông, sắc tố đƣợc chuyển từ tế bào melanin sang tế bào keratin kề bên; trong lông, sắc tố
5 đƣợc thêm vào trong những tế bào keratin đang phát triển mà nó sẽ tạo thành thân lông. Trong da tế bào melanin đƣợc tìm thấy trong ngăn biểu bì gần màng đế. Hạt melanin đƣợc chuyển vào tế bào keratin thƣờng tạo mũ trên nhân, bảo vệ vật liệu di truyền khỏi tia UV. Màu của lông là do tế bào melanin trong hành lông chuyển melanin vào những tế bào kerarin khi lông kéo dài ra, và sau đó hóa sừng. Melanin thƣờng đƣợc mô tả trong hai lớp chính: eumelanin màu nâu hay đen và pheomelanin (do bởi sự hợp thành của cysteine) màu vàng hay đỏ. Sự phân loại hay thể hiện tình trạng sắc tố liên quan đến hai yếu tố: số lƣợng melanin đƣợc tạo ra và số lƣợng liên quan của eumelanin hay pheomelanin. Việc thiếu 1 hay cả hai loại melanin liên quan đến tóc trắng. Eumelanin chiếm ƣu thế thì cho lông nâu hay đen và pheomelanin chiếm ƣu thế thì cho lông vàng hay đỏ. Cuối cùng, màu lông không chỉ đơn thuần là kết quả của thành phần hoá học của nhiều polymer melanin. Sự phân tán ánh sáng cũng ảnh hƣởng tới màu lông. 2.4. Cấu tạo của keratin Theo Eggling (2001, 2003), keratin thuộc nhóm protein cấu trúc, là những protein dạng sợi. Keratin hình thành màng bảo vệ cho toàn bộ động vật có xƣơng sống: da, lông, tóc, vuốt, móng, sừng, vảy, mỏ. Đơn vị cơ bản của lông là một sợi protein dài hình thành trong cấu trúc alpha xoắn ốc bậc hai. Ba trong số những protein xoắn alpha xoắn quanh một cái khác hình thành nên cấu trúc gọi là tiền fibrin. Trong vòng xoắn, một sợi fibrin đƣợc tạo từ bảy tiền fibrin và đƣợc sắp xếp theo một kiểu gồm chín tiền fibrin xoắn xung quanh hai tiền fibrin. Sau đó hàng trăm sợi fibrin gắn vào một loại protein dạng keo để hình thành sợi fibrin lớn. Những sợi fibrin lớn này sẽ đƣợc gắn vào trong thân của tế bào lông chết. Đƣờng kính một sợi lông điển hình có khoảng 10 tế bào lông. Những sợi protein trong lông và những keratin alpha khác liên kết chéo trong một mức độ bởi những cầu nối 2 hóa trị giữa những phần cystein để hình thành những cầu nối disulfide. Càng nhiều cầu nối disulfide giữa các sợi thì protein càng cứng. Keratin alpha có thể phân loại thành mềm hay cứng phụ thuộc vào thành phần chứa sulfur của nó (số lƣợng cystein trong sợi polypeptide). Keratin ít sulfur của da thì mềm dẻo hơn keratin nhiều sulfur của móng, sừng, vuốt. 2.5. Những công trình tách chiết DNA từ lông
6 Thông thƣờng những công trình nghiên cứu sử dụng mẫu lông để thao tác thƣờng liên quan đến những loài động vật quý hiếm, sắp tiệt chủng hay tìm nạn nhân trong các vụ mất tích. * Schnabel và ctv (2000) sử dụng mẫu máu và nang lông trong thí nghiệm mô tả đặc điểm, tiêu chuẩn hoá, và cung cấp tính hợp lệ cho một tập hợp microsatellite đa hình cao dùng cho việc kiểm tra nguồn gốc tổ tiên của bò bizon Bắc Mỹ và gia súc. * James và ctv (2004) đã sử dụng mẫu máu, cơ, lông trong thí nghiệm ƣớc định mức độ biến đổi di truyền và sự khác nhau về quần thể trong những quần thể bị giam cầm của loài động vật hữu nhũ lớn đang bị đe dọa, heo vòi Baird (Tapirus bairdii). * Maxime Galan và ctv thuộc Viện nghiên cứu Nông Nghiệp Pháp (2003) phân biệt những loài hƣơu bằng DNA ly trích từ lông và phƣơng pháp PCR. - Hƣơu đỏ và con hoẵng là hai trong số những động vật móng guốc ở Châu Âu. Chúng đều phân bố trên một khu vực địa lý rộng lớn. Không có kỹ thuật đáng tin cậy nào cho phép phân biệt chúng dựa vào nghiên cứu mẫu lông hay mẫu phân do chúng phân bố chồng chéo nhau. Các nhà khoa học đã giới thiệu một phƣơng pháp kiểm tra để phân biệt những mẫu lông của nai đỏ và hoẵng bằng sử dụng phƣơng pháp PCR. - Mẫu lông đƣợc lấy ở mông. Nhú lông đƣợc cắt khoảng 2 mm tính từ điểm gốc của lông. Họ sử dụng đồng thời hai tiến trình ly trích, Dneasy Tissue Kit dùng cho ly trích DNA từ móng và lông của QIAamp và phƣơng pháp dựa trên Chelex -100 của Biorad. - Trong giai đoạn kiểm tra sơ bộ, họ ly trích DNA từ những mẫu lông tƣơi từ những con vật đã biết về loài. Họ so sánh mật độ khuếch đại bằng sử dụng mẫu da và thấy rằng sản phẩm cũng tốt nhƣ đối với mẫu lông đƣợc ủ (2 – 3 năm). Mật độ của sản phẩm PCR từ mẫu lông tƣơi thì nhiều hơn so với mẫu lông đƣợc ủ. DNA cũng có chất lƣợng kém hơn vì thế mẫu không đƣợc khuếch đại. - Trong thí nghiệm thứ hai, ngƣời ta thực hiện để đánh giá độ lặp lại của việc khuếch đại DNA của một mẫu khi sử dụng mẫu lông đƣợc ủ. Họ ly trích và khuếch đại DNA 2 lần từ 15 mẫu lông của từng cá thể của những loài chƣa biết. Đọc trên gel đƣợc 5 mẫu trong 15 mẫu trong lần chạy PCR đầu tiên (33,3% thành công) và 8 trong 15 lần trong lần chạy PCR thứ 2. Bốn mẫu không ra trong lần thứ 1 đã ra trong lần thứ 2, trong khi 1 mẫu ra trong lần thứ 2 đã không ra trong lần thứ 1. Đối với
7 những mẫu đã cho kết quả trong cả 2 lần chạy, theo dõi mẫu có băng giống nhau và thấy rằng độ lặp lại đạt 100% trong việc xác định loài. - Các nhà khoa học nhận thấy tỷ lệ khuếch đại thành công khá thấp chắc chắn liên quan đến điều kiện ủ trong tube làm cho DNA thêm biến tính, cùng với số lƣợng nhỏ lông của từng cá thể có khả năng dùng làm mẫu. Ngoài ra, DNA ty thể rất dễ bị biến tính với DNAse vì kích thƣớc nhỏ của nó và nó nằm ngoài nhân. Có thể những mẫu đƣợc ủ trong những điều kiện thích hợp, cụ thể trong chai khô và không bịt kín (ví dụ đậy bằng giấy), và việc thu một số lƣợng lớn mẫu lông từ từng con có thể làm tăng tỷ lệ thành công của việc khuếch đại. Và nồng độ DNA thấp có khả năng do đã không lấy đƣợc DNA ty thể khi dùng pippet hút dung dịch trong từ tube phản ứng. 2.6. Nguyên tắc của PCR Theo Gerard Morel và ctv (1998), phƣơng pháp PCR sử dụng những trình tự DNA ngắn nhƣ đoạn mồi (oligonucleotides), một enzyme tái tạo DNA, một DNA polymerase chịu nhiệt (ví dụ Taq polymerase) (Sake và ctv, 1985; Haase và ctv, 1990), và tri–photphat deoxyribonucleotides (dNTPs): dATP, dGTP, dTTP, dCTP. Sau bƣớc tách hai mạch của trình tự đích (thông thƣờng do gia nhiệt ở 95oC trong 5 phút), đoạn mồi bắt cặp hay lai với trình tự đích trong bƣớc thứ hai. Hình 2.1: Chu kỳ đầu tiên trong PCR (Nguồn Dale và ctv, 2002)
8 Hình 2.2 Chu kỳ thứ hai trong phản ứng PCR (Nguồn Dale và ctv, 2002) Nhiệt độ bắt cặp này đƣợc xác định bởi nhiệt độ nóng chảy (Tm) và trình tự đoạn mồi sử dụng (thông thƣờng khoảng giữa 37oC và 60oC). Bƣớc này đƣợc theo sau bởi sự kéo dài của đoạn mồi theo hƣớng 5' đến 3' bằng cách thêm triphotphat deoxyribonucleotide vào nhóm 3'OH cuối của đoạn mồi bởi DNA polymerase. Mỗi base đƣợc thêm vào bổ sung với base của sợi DNA mẫu. Sự kéo dài đƣợc thực hiện trên hai sợi DNA khoảng thời gian từ 65 đến 75 giây. Sự biến tính, bắt cặp (hay lai) và kéo dài đƣợc lặp lại 20 đến 30 lần để khuếch đại đoạn DNA đích theo cấp số nhân. Trong pha lỏng của phản ứng PCR, với DNA sợi đôi, số bản copy tại điểm kết thúc của phản ứng theo lý thuyết là 2n (n, số chu kỳ), nhƣng phản ứng không bao giờ đạt tối ƣu nhất và sản phẩm thƣờng chỉ đạt khoảng 70%. * Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR (Lê thị Thu Phƣơng, 2004) - Taq polymerase xúc tác tổng hợp DNA theo chiều 5' – 3' trong suốt quá trình phản ứng dƣới sự hiện diện của Mg2+.
9 - Đoạn mồi là những đoạn oligonucleotide, có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. - dNTPs làm thành nguyên liệu cho phản ứng DNA. - Dung dịch đệm: quan trọng nhất là ion Mg2+. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTPs, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của DNA mạch kép. Dung dịch đệm tiêu chuẩn chứa 50 mM KCl và khuếch đại tốt những đoạn DNA > 500 bp. - Mẫu DNA làm khuôn mẫu trong phản ứng. * Nguyên tắc của multiplex - Theo Sambrook và ctv (2001), multiplex PCR là một thuật ngữ đƣợc sử dụng khi có nhiều hơn một cặp đoạn mồi đƣợc dùng trong PCR. Mục đích của multiplex PCR là khuếch đại nhiều đoạn trong DNA đích cùng một lúc và do đó bảo tồn DNA mẫu, tiết kiệm thời gian, giảm phí tổn. Số lƣợng của mỗi phản ứng khuếch đại đƣợc giảm tƣơng ứng với số lƣợng của đoạn mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng. - Multiplex PCR rất khó để thiết lập. Cần phải chú ý để bảo đảm tất cả đoạn mồi trong phản ứng có nhiệt độ nóng chảy tƣơng đƣơng, để những đoạn mồi không phản ứng với nhau, những sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc gần nhau nhƣng có thể phân biệt với nhau trên gel. 2.7. Nguyên tắc xác định giới tính và gen halothane 2.7.1. Nguyên tắc xác định giới tính Theo trích dẫn từ Nguyễn Văn Út (2005), Schorder và ctv (1990) cho rằng việc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt nhiễm sắc thể (NST) Y trong phản ứng PCR giúp khuếch đại trình tự DNA chuyên biệt đực. Sự hiện diện hay vắng mặt của sản phẩm PCR cho phép xác định giới tính. Thông thƣờng, kèm với sự khuếch đại trình tự chuyên biệt NST Y, ngƣời ta nhân bản đồng thời một trình tự trên NST sinh dƣỡng (Chen và ctv, 2004) hoặc một trình tự trên NST X (Alves và ctv, 2003) để làm yếu tố kiểm soát sự hiện diện của vật liệu và các điều kiện phù hợp cho phản ứng nhân bản. 2.7.2. Nguyên tắc xác định gen halothane Gen halothane có hai alen N và n hình thành 3 kiểu gen NN, Nn và nn. Bằng việc so sánh trình tự nucleotide của gen này, MacLennan thấy rằng có sự đột biến C (cytosin) thành T (thymin) ở vị trí base 1843 của chuỗi nucleotide. Fujii và ctv (1991)