Tác dụng gây độc tế bào ung thư của cao chiết từ cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) – Annonaceae

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 6 * 2016<br /> <br /> <br /> TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT<br /> TỪ CÂY THUỐC THƯỢNG (PHAEANTHUS VIETNAMENSIS BAN) –<br /> ANNONACEAE<br /> Bùi Thanh Phong*, Lâm Bích Thảo**, Nguyễn Thị Ái Thuận***, Trần Công Luận****<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Giới thiệu: Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) chứa nhiều hợp chất có giá trị như alkaloid,<br /> polyphenon, triterpenoid và acetogennin… Các hợp chất này có khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa. Nghiên<br /> cứu này nhằm xác định khả năng gây độc tế bào ung thư của các cao chiết từ cây Thuốc Thượng.<br /> Phương pháp: Các cao chiết của cây Thuốc Thượng như: cao alkaloid toàn phần, cao cồn toàn phần, cao<br /> diethyl ether, cao chloroform, cao n – butanol và cao nước được xác định khả năng gây độc tế bào bằng phương<br /> pháp SRB. Các dòng tế bào ung thư sử dụng bao gồm: Các dòng tế bào ung thư: MCF-7 (ung thư vú), NCI-H460<br /> (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan) và Hela (ung thư cổ tử cung).<br /> Kết quả: Cao alkaloid toàn phần cho kết quả kháng tế bào ung thư cao nhất, giá trị IC50 với các dòng tế bào<br /> ung thư MCF –7, NCI - H460, HepG2, Hela lần lượt là 26,71, 32,28, 11,68 và 31,19 µg/ml.<br /> Bàn luận: Có thể sử dụng cao chiết alkaloid toàn phần như một tác nhân hỗ trợ điều trị ung thư trong<br /> tương lai.<br /> ABSTRACT<br /> CYTOTOXIC ACTIVITY OF THUOC THUONG(PHAEANTHUSVIETNAMENSIS BAN)<br /> AGAINST CANCER CELL LINES<br /> Bui Thanh Phong, Lam Bich Thao, Nguyen Thi Ai Thuan, Tran Cong Luan<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - No 6 - 2016: 140 - 144<br /> <br /> Background: Phaeanthusvietnamensis Ban(Vietnamese name: ThuocThuong) contains many compounds<br /> which have bioactivity such as alkaloids, triterpenes, polyphenols, andacetogenins…. These compoundsshow high<br /> antibacterial and anticancer activities. This research was conducted to determine the cytotoxicability of<br /> ThuocThuong extracts for cancer treatment.<br /> Methods: The extracts of Phaeanthusvietnamensisincluded: alcohol total, fractionated extracts (diethyl ether,<br /> chloroform, n-butanol, water) and total alkaloid. Sulforhodamine B colorimetric assay was used for cytotoxicity<br /> screening.The following cell lines were used in the assay: MCF –7 (breast cancer cell), NCI - H460 (lung cancer<br /> cell), HepG2 (liver cancer cell), Hela (cervical cancer cell).<br /> Results: The total alkaloid showed the highest activity with the IC50 values on cancer cell lines (MCF –7,<br /> NCI - H460, HepG2 and Hela) were 26.71, 32.28, 11.68 and 31.19 µg/ml, respectively.<br /> Conclusion: The total alkaloid from Phaeanthusvienamensis showed cytotoxicity. The compound could be<br /> used as a potential anticancer agent in the furture.<br /> Keywords: Phaeanthusvietnamensis Ban, anticancer, antibacterial<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ một loài là Thuốc Thượng (Phaeanthus<br /> vietnamensis Ban). Cây còn có tên khác như<br /> Ở Việt Nam, chi Phaeanthus (họ Na) chỉ có<br /> * **<br /> Khoa Dược – Đại học Quốc tế Hồng Bàng Trung tâm Sâm và Dược liệu<br /> *** ****<br /> Khoa Dược – Đại học y Dược TP. HCM Đại học Tây Đô<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Bùi Thanh Phong ĐT: 0934188966 Email: phongbui86@gmail.com<br /> 140<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 6 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Thuốc Mọi, Da Xà Lắc, Thuốc Dấu Cà Doong,… Chloroform, cô cạn dịch Chloroform thu cắn<br /> là loài thực vật đặc hữu của vùng Trung Trường alkaloid(2).<br /> Sơn(6). Cây mọc hoang tại các tỉnh Thừa Thiên- Cao toàn phần và các cao phân đoạn: 200 g<br /> Huế (Phú Lộc), Quảng Nam-Đà Nẵng (Đại Lộc, dược liệu được chiết ngấm kiệt bằng cồn 96%.<br /> Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước, Thu dịch cồn và cô thành dạng cao sệt, thu<br /> Phước Sơn). Bộ phận dùng là lá, vỏ thân và vỏ được cao toàn phần. Lấy một nửa khối lượng<br /> rễ, dùng để điều trị nhiễm khuẩn(7). Cho đến nay, cao toàn phần hòa vào nước, lần lượt lắc phân<br /> chỉ có một số nghiên cứu về hoạt tính kháng đoạn với các dung môi là ether ethylic,<br /> khuẩn và phân tích alkaloid từ cây Thuốc cloroform, n – butanol. Kết quả thu lấy 4 loại<br /> Thượng(5,8). Trong các nghiên cứu gần đây, chi cao chiết là ether ethylic, cloroform, n –<br /> Phaeanthus (họ Na) được xem là nguồn giàu các butanol và cao nước còn lại.<br /> hợp chất có hoạt tính sinh học (alkaloid,<br /> Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào<br /> acetogenin, triterpen, polyphenol,…). Trong đó,<br /> (cytotoxic assay)<br /> nhóm acetogenin và alkaloid còn là các hợp chất<br /> kháng ung thư tiềm năng. Nghiên cứu này nhằm Tác động gây độc tế bào được xác định bằng<br /> xác định hoạt tính kháng ung thư của các cao thử nghiệm sulforhodamin B (SRB)(1,3,4,9). Thử<br /> chiết từ cây Thuốc Thượng (Phaeanthus nghiệm dựa vào khả năng của SRB, thuốc<br /> vietnamensis Ban). nhuộm liên kết với protein của tế bào sau khi tế<br /> bào được cố định bằng acid tricloroacetic. Lượng<br /> ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein<br /> Đối tượng nghiên cứu tổng của tế bào. Trong thử nghiệm, tế bào được<br /> Dược liệu là bột khô lá cây Thuốc Thượng nuôi trong đĩa 96 giếng ở mật độ thích hợp. Sau<br /> (Phaeanthus vietnamensis Ban) được thu hái ở 24 giờ, tế bào được cảm ứng với cao chiết ở các<br /> Bà Nà-Đà Nẵng. Mẫu vật được định danh và nồng độ khác nhau hay với DMSO 0,25 % (đối<br /> lưu trữ tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. chứng) trong 48 giờ. Sau đó tế bào được cố định<br /> Hồ Chí Minh. bằng acid tricloroacetic 50% và nhuộm với SRB<br /> 0,2 %. SRB được hòa tan bằng Tris 10 mM và đo<br /> Các dòng tế bào ung thư: MCF-7 (ung thư<br /> mật độ quang ở bước sóng 492 nm và 620 nm.<br /> vú), NCI-H460 (ung thư phổi), HepG2 (ung thư<br /> Phần trăm gây độc tế bào được tính bằng công<br /> gan) và Hela (ung thư cổ tử cung) được mua từ<br /> thức:<br /> ATCC, Hoa Kỳ. Tế bào fibroblast được phân lập<br /> từ da bao qui đầu người, đại diện cho tế bào %I = (1 - ) x 100%<br /> thường. Các dòng tế bào ung thư và fibroblast Với: ODTN: Giá trị OD492-620 của mẫu thử nghiệm<br /> được nuôi cấy và bảo quản tại Phòng thí nghiệm<br /> ODC : Giá trị OD492-620 của mẫu đối chứng<br /> Sinh học phân tử -Bộ môn Di truyền-trường ĐH<br /> Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. IC50 được xác định bằng cáchvẽ đồ thị biểu<br /> diễn tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ khảo<br /> Phương pháp nghiên cứu sát của chất cần thử nghiệm bằng phầm mềm<br /> Phương pháp điều chế mẫu thử Excel. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ cho tỉ<br /> Alkaloid toàn phần: 100 g dược liệu được làm lệ gây độc tế bào 50% bằng cách tính phương<br /> ẩm bằng amoniac 10% sau đó được chiết kiệt trình đường thẳng qua 2 điểm có tỉ lệ gây độc tế<br /> bằng Chloroform. Acid hóa dịch chiết bằng HCl bào gần 50% nhất (1 điểm có tỉ lệ gây độc tế bào<br /> 2% và thu dịch nước. Kiềm hóa dịch nước bằng nhỏ hơn 50%, điểm còn lại có tỉ lệ gây độc tế bào<br /> amoniac 10%. Lắc dịch kiềm hóa với lớn hơn 50%), sau đó từ phương trình trên (có<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 141<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 6 * 2016<br /> <br /> dạng y = ax + b), thế y = 50 vào, suy ra được giá KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> trị nồng độ chính là IC50.<br /> Kết quả chiết cao<br /> Chứng dương được sử dụng là<br /> Từ 100 g dược liệu thu được 3,90 g alkaloid<br /> camptothecin. Do camptothecin có độc tính<br /> toàn phần. Từ 200 g dược liệu thu được 49,80 g<br /> với các dòng tế bào khác nhau nên nồng độ<br /> cao toàn phần. Hòa 24,90 g cao toàn phần vào<br /> camptothecin được sử dụng với từng dòng tế<br /> nước, lần lượt cho lắc phân đoạn với các dung<br /> bào khác nhau. Nồng độ của camptothecin lần<br /> môi là ether ethylic, cloroform, n – butanol thu<br /> lượt với các dòng tế bào fibroblast, Hela, Hep<br /> nhận được 4 loại cao lần lượt có khối lượng là<br /> G2, MCF-7, NCI-H460 là 2,5; 1,00; 0,07; 0,01;<br /> 7,36 g; 5,17 g; 4,80 g; 4,22 g.<br /> 0,01 (µg/ml).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> UV 254 nm UV 365 nm Dragendorff<br /> Hình 1. Sắc kí lớp mỏng các phân đoạn.<br /> SKLM, hệ dung môi Chloroform: MeOH: NH3(8: 2: 0,2)<br /> (Từ trái qua: Cao toàn phần, cao ether, cao Chloroform, cao alkaloid tp, cao n-BuOH, cao nước)<br /> Khi soi dưới đèn UV 254 nm, UV 365 nm và thì vết alkaloid nhiều. Với cao n – butanol thì<br /> nhuộm bằng thuốc thử Dragendorff thấy rằng cũng còn nhiều vết alkaloid, ở cao nước cũng<br /> cao chiết cây Thuốc Thượng có vết alkaloid khá cho vết alkaloid khá phân cực.<br /> rõ. Với cao alkaloid toàn phần và cao cloroform<br /> Kết quả nghiên cứu khả năng kháng tế bào ung thư<br /> Kết quả khảo sát khả năng gây độc tế bào in vitro<br /> Bảng 1. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư ở nồng độ 50,75 và 100 µg/ml<br /> Phần trăm (%) gây độc tế bào (Trung bình ± Độ lệch chuẩn)<br /> Cao chiết Nồng độ (µg/ml)<br /> MCF-7 Hela NCI-H460 HepG2<br /> 100 47,29 ± 2,76 17,34 ± 2,57 19,59 ± 0,30 33,30 ± 3,92<br /> Cao<br /> 75 - - - -<br /> toàn phần<br /> 50 - - - -<br /> 100 34,80 ± 2,97 15,46 ± 5,24 24,12 ± 2,50 6,09 ± 3,32<br /> Cao ether 75 - - - -<br /> 50 - - - -<br /> <br /> <br /> 142<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 6 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Phần trăm (%) gây độc tế bào (Trung bình ± Độ lệch chuẩn)<br /> Cao chiết Nồng độ (µg/ml)<br /> MCF-7 Hela NCI-H460 HepG2<br /> 100 45,32 ± 3,23 22,00 ± 2,01 28,73 ± 2,93 13,63 ± 2,31<br /> Cao<br /> 75 - - - -<br /> n - butanol<br /> 50 - - - -<br /> 100 8,36 ± 3,65 -1,09 ± 3,55 7,60 ± 2,88 8,22 ± 2,36<br /> Cao nước 75 - - - -<br /> 50 - - - -<br /> 100 92,34 ± 2,79 85,21 ± 3,67 64,95 ± 1,47 -<br /> Cao<br /> 75 84,38 ± 5,27 - 44,31 ± 3,74<br /> cloroform<br /> 50 63,66 ± 5,55 - - 81,72 ± 3,53<br /> 100 92,89 ± 1,49 88,91 ± 2,58 - -<br /> Cao alkaloid<br /> 75 91,04 ± 2,07 - - -<br /> toàn phần<br /> 50 78,51 ± 1,93 - 74,35 ± 0,52 94,24 ± 0,44<br /> 1 - 60,83 ± 3,04 - -<br /> Camptothecin 0,07 - - - 59,04 ± 1,18<br /> 0,01 63,88 ± 2,26 - 80,75 ± 1,97 -<br /> Ghi chú: -: không thực hiện<br /> Do một số cao có thể làm chết trên 50% tế ung thư của cây Thuốc Thượng tập trung vào<br /> bào ở nồng độ thấp hơn 100 µg/ml nên nghiên nhóm hợp chất alkaloid.<br /> cứu được tiến hành trên các nồng độ là 50, 75 và Từ các kết quả trên, cao alkaloid toàn phần<br /> 100 µg/ml. Với cao chiết làm cho hơn 50% tế bào và cao cloroform sẽ được sử dụng để thực hiện<br /> ung thư chết sẽ được tiếp tục thí nghiệm để xác thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tăng trưởng<br /> định IC50. 50% quần thể tế bào ở mẫu thử nghiệm so với<br /> Theo bảng trên, cao alkaloid toàn phần cho đối chứng (IC50) trên 4 dòng tế bào ung thư được<br /> kết quả gây độc tế bào trên các dòng tế bào nêu trên và dòng tế bào lành đối chứng là<br /> ung thư khảo sát mạnh nhất, kế đó là cao nguyên bào sợi người (fibroblast).<br /> cloroform. Điều này cho thấy hoạt tính kháng<br /> Thử nghiệm xác định IC50 của các cao chiết trên các dòng tế bào ung thư<br /> Bảng 2. IC50 (µg/ml) của các mẫu trên các dòng tế bào ung thư và tế bào fibroblast<br /> Dòng tế bào<br /> STT Tên Cao<br /> MCF-7 Hela NCI-H460 HepG2 fibroblast<br /> 1 Alkaloid toàn phần 26,71 ± 1,37 31,19 ± 2,40 32,28 ± 1,84 11,68 ± 0,41 71,50 ± 2,46<br /> 2 Cao cloroform 37,40 ± 2,24 55,10 ± 2,30 56,53 ± 3,85 15,29 ± 1,76 > 100<br /> Hai cao chiết alkaloid toàn phần và cao và cuối cùng là dòng NCI – H460. Đồng thời các<br /> cloroform đều cho hiệu quả ức chế tế bào ung cao chiết này ít gây độc tế bào thường.<br /> thư rất cao. Cao cloroform chứa alkaloid và các KẾT LUẬN<br /> hợp chất khác nên cho kết quả thấp hơn alkaloid<br /> Dịch chiết cây Thuốc Thượng cho khả năng<br /> toàn phần, khả năng kháng ung thư của alkaloid<br /> ức chế tế bào ung thư Hela, Hep G2, MCF-7,<br /> toàn phần mạnh hơn 1,5 lần so với cao<br /> NCI-H460, trong đó cao alkaloid toàn phần thể<br /> cloroform. Kết quả trên chứng minh khả năng<br /> hiện tác dụng mạnh nhất. Bên cạnh đó, khả năng<br /> kháng ung thư được thực hiện chủ yếu nhờ vai<br /> gây độc tế bào lành tính như nguyên bào sợi của<br /> trò các alkaloid có trong cây Thuốc Thượng.<br /> các cao chiết thấp hơn các loại tế bào ung thư. Do<br /> Alkaloid toàn phần và cao cloroform đều cho vậy, có thể tiếp tục các nghiên cứu sâu hơn về<br /> kết quả ức chế tế bào ung thư cao với dòng tế độc tính của cây Thuốc Thượng trên cơ thể động<br /> bào Hep G2, kế đó là dòng MCF – 7, dòng Hela<br /> <br /> <br /> 143<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 6 * 2016<br /> <br /> vật, tiến tới ứng dụng vào các chế phẩm hỗ trợ 7. Nguyễn Tiến Bân (2007). Sách đỏ Việt Nam – Phần II: Thực Vật.<br /> NXB Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ, tr.370.<br /> điều trị ung thư hiệu quả. 8. Petr S, Nguyen Thi Nghia, Ivo V, Vilim S (1990). “A new<br /> bisbenzylisoquinoline alkaloid from Phaeanthus vietnamensis<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO and its antibacterial activity”. Heterocycles (Tokyo), 30(1): 205-<br /> 1. Alley MC, Scudiero DA, Monks A et al (1988). Feasibility of 210.<br /> Drug Screening with Panels of Human Tumor Cell Lines 9. Scudiero DA, Shoemaker RH, Paull KD, Monks A, Tierney S,<br /> Using a Microculture Tetrazolium Assay. Cancer Research, Nofziger TH, Currens MJ, Seniff D, Boyd MR (1988).<br /> 48(3): 589-601. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell<br /> 2. Hội đồng dược điển (2002). Dược điển Việt Nam IV. Bộ Y tế, growth and drug sensitivity in culture using human and other<br /> tr.120-200. tumor cell lines. Cancer Res, 48: 4827-4833.<br /> 3. Monks A, Scudiero D, Skehan P, Shoemake R, Paull K, Vistica 10. Trần Công Luận, Huỳnh Thị Ngọc Lan, Bùi Thanh Phong,<br /> D, Hose C, Langley J, Cronise P, Campbell H, Mayo J, Boyd M Đặng Ngọc Phái (2015). Tác dụng kháng khuẩn của các cao<br /> (1991). Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a chiết từ cây Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban). Tạp<br /> diverse panel of cultured human tumor cell lines. Journal of chí Y Học TP.HCM, tập 19, số 5, tr.165-168.<br /> National Cancer Institute, 11(83): 757-766.<br /> 4. Nguyễn Thái Hoàng Tâm, Nguyễn Thụy Vy, Tất Tố Trinh,<br /> Nguyễn Thị Tuyết Giang, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Nguyễn Ngày nhận bài báo: 30/08/2016<br /> Ngọc Hạnh (2007). Chuẩn hóa thử nghiệm Sulforhodamine B<br /> (SRB) để xác định tính gây độc tế bào của hợp chất tự nhiên. Những<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/09/2016<br /> vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Nhà xuất bản Ngày bài báo được đăng: 25/11/2016<br /> khoa học kỹ thuật Quy Nhơn, tr.809-811.<br /> 5. Nguyen Thi Nghia, Ivo V (1991). Alkaloids from leaves of<br /> Phaeanthus vietnamensis. Fitoterapia 62(4): 315-318.<br /> 6. Nguyễn Tiến Bân (2000). Thực vật chí Việt Nam, Tập 1 –<br /> Annonaceae. NXB Khoa học và Kỹ Thuật, tr.45-67.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 144<br />