Tạp chí khoa học: Hoạt tính protease của một số chủng Bacillus phân lập từ nước thải chế biến thịt và thủy hải sản

Chia sẻ: Hoàng Thiện | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

114
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu là khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cũng như các yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến chúng từ các chủng Bacillus phân lập trên ba loại nước thải giàu đạm khác nhau được lấy từ các nhà máy chế biến thịt và thủy hải sản.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tạp chí khoa học: Hoạt tính protease của một số chủng Bacillus phân lập từ nước thải chế biến thịt và thủy hải sản

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 28 (2012) 116-124 Ho t tính protease c a m t s ch ng Bacillus phân l p t nư c th i ch bi n th t và th y h i s n Võ H ng Thi1,*, Nguy n Hoàng M 2, Nguy n Ph m Huy n1 1 Khoa Môi trư ng và Công ngh sinh h c, i h c K thu t Công ngh TpHCM (HUTECH) 2 Vi n Khoa h c Công ngh và Qu n lý Môi trư ng, i h c Công nghi p TpHCM Nh n ngày 23 tháng 3 năm 2012 Tóm t t. S phát tri n c a công nghi p ch bi n th t và th y h i s n Vi t Nam th i gian qua ã và ang phát sinh nhi u v n ô nhi m nư c b i các h p ch t h u cơ giàu Nitơ do ó vi c x lý các h p ch t d ng này b ng phương pháp sinh h c là phù h p. M c tiêu nghiên c u là kh o sát kh năng sinh t ng h p enzyme protease cũng như các y u t cơ b n nh hư ng n chúng t các ch ng Bacillus phân l p trên ba lo i nư c th i giàu m khác nhau ư c l y t các nhà máy ch c i m hình thái, sinh lý bi n th t và th y h i s n. T 30 ch ng phân l p, cùng v i các k t qu v và sinh hóa chuyên bi t thu nh n ư c k t h p v i khóa phân lo i c a Bergey, ã l a ch n ra 10 ch ng Bacillus có kh năng phân gi i protein t t. K t qu kh o sát cũng cho th y sau th i gian 72 gi nuôi c y các i u ki n pH 7 và 50oC, ho t tính protease c a c 10 ch ng u t c c i và dao ng trong kho ng t 1 n 1,15 U/ml. ó là cơ s ti p t c tri n khai nghiên c u ng d ng kh năng x lý nư c th i ch bi n th t và th y h i s n trong th c t v i các t h p Bacillus tuy n ch n. T khóa: Bacillus, ho t tính protease, khóa phân lo i Bergey. 1. M u∗ Trong s các lo i hình công nghi p ch bi n th c ph m t i Vi t Nam, ngành ch bi n th t gia súc gia c m và th y h i s n phát tri n khá a d ng và phong phú, song quy mô s n xu t phân tán theo hình th c h gia ình hay liên h gia ình v i công ngh ch bi n th công và thi t b t t o chi m t l t i 70-74% [1-3]. Do ó, vi c thu gom và x lý nư c th i t i các cơ s ch bi n này chưa ư c quan tâm khi ph n l n _______ ∗ Tác gi liên h . T: 84-8-35120788 E-mail: vohongthi@yahoo.com lư ng nư c th i phát sinh không ư c x lý ho c ch ư c x lý m t ph n v i hi u qu r t th p trư c khi ra sông ngòi, ao h , ã và ang gây nhi m b n nghiêm tr ng v lâu dài các ngu n nư c và môi trư ng xung quanh [4, 5]. M t i m c trưng trong nư c th i ch bi n th t và th y h i s n là s hi n di n v i hàm lư ng l n các ch t h u cơ cao phân t như protein, amino acid, lipid và m t s ch t khác [6]. Các ch t h u cơ cao phân t này do ch m phân h y nên chính là tác nhân khi n ngu n nư c b ô nhi m n ng n [7, 8]. Trong nư c th i c a các nhà máy ch bi n khác nhau, t i lư ng và n ng c a chúng có th khác bi t, ph 116 V.H. Thi nnk. / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 116-124 117 thu c vào lo i nguyên li u ch bi n, ch t ph gia s d ng, lo i s n ph m s n xu t… nhưng ph n ch t h u cơ ch y u u là protein [9], có l là do protein thư ng chi m t 15-25% tr ng lư ng tươi các lo i cá và th t gia súc [8, 10]. Do v y, gi m thi u ô nhi m, bên c nh các phương pháp x lý hóa h c, hóa lý, cơ h c thì x lý sinh h c ư c c bi t quan tâm và em l i hi u qu cao do c trưng ô nhi m n ng l n các protein có th phân h y sinh h c trong nư c th i ch bi n th t và th y h i s n. Trong quá trình x lý nư c th i b ng phương pháp sinh h c, s phân gi i protein m u b ng giai o n th y phân và nhi u nghiên c u ã ch ng minh r ng ây là giai o n quan tr ng, quy t nh t c và hi u qu x lý [11, 12]. giai o n này, m t s nhóm vi khu n có kh năng sinh t ng h p enzyme ngo i bào phân gi i các h p ch t protein không tan thành các ơn phân t (các monomer và oligomer) d tan hơn và d h p th hơn óng vai trò then ch t. Trong s các vi sinh v t có kh năng sinh enzyme ngo i bào cao, vi khu n thu c chi Bacillus ư c bi t n khá nhi u do chúng có th s d ng ư c a d ng ngu n cơ ch t tăng sinh kh i và phát tri n, do v y Bacillus ã và ang ư c ng d ng trong nhi u lĩnh v c khác nhau c a i s ng nói chung và trong công tác x lý nư c th i nói riêng Vi t Nam như nư c nuôi th y s n [13], nư c sông, h b ô nhi m b i ch t th i sinh ho t [14-16]. Nh có ho t tính enzyme ngo i bào cao, các loài thông d ng khác nhau c a Bacillus như B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium…, khi ư c b sung vào các lo i nư c th i nói trên, ã ch ng t hi u l c phân h y ch t h u cơ cao hơn h n so v i các ch ng t nhiên s n có trong nư c th i [13-16]. T nh ng cơ s trên ây, nghiên c u này ư c th c hi n v i m c tiêu tuy n ch n m t s ch ng Bacillus có ho t l c phân gi i protein cao trong nư c th i, làm cơ s cho ng d ng vào vi c x lý các lo i nư c th i giàu m. V i m c tiêu ó, nghiên c u trư c h t t p trung vào kh năng sinh t ng h p enzyme protease cũng như các y u t cơ b n nh hư ng n chúng c a các ch ng Bacillus phân l p t ba lo i nư c th i giàu m khác nhau. 2. i tư ng, nguyên li u và phương pháp nghiên c u 2.1. i tư ng nghiên c u 2.1.1. Nư c th i - Nư c th i ch bi n th y s n c a nhà máy th y s n s 4, ư ng Hưng Phú, qu n 8, Tp HCM. - Nư c th i s n xu t c a công ty c ph n h i s n Sài Gòn Fisco, KCN Vĩnh L c, qu n Bình Tân, Tp HCM. - Nư c th i ch bi n th t c a công ty c ph n k ngh Vissan, ư ng Nơ Trang Long, qu n Bình Th nh, Tp HCM. C ba lo i nư c th i trên u ư c l y trong b ti p nh n nư c th i s n xu t c a ba nhà máy. Nư c th i t i ó ư c lưu gi kho ng 2 ngày trư c khi ư c ưa vào tr m x lý ho c th i ra môi trư ng. 2.1.2. Vi khu n Bacillus Các ch ng Bacillus sau khi ư c phân l p t nư c th i và th nghi m ho t tính protease là i tư ng c a các th nghi m k ti p. 2.2. Nguyên li u nghiên c u - Môi trư ng phân l p vi khu n (môi trư ng NA): peptone 1g/100ml, cao th t 0,3g/100ml, NaCl 0,5g/100ml và agar 20g/1000ml. 118 V.H. Thi nnk. / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 116-124 - Môi trư ng nh tính kh năng sinh NH3 trong quá trình phân gi i protein (môi trư ng NB): peptone 1g/100ml, cao th t 0,3g/100ml, NaCl 0,5g/100ml. - Môi trư ng th nghi m kh năng phân gi i gelatine (môi trư ng NG): gelatine 5g/100ml, peptone 0,5g/100ml. - Các môi trư ng khác ph c v nghi m sinh hóa. - Các hóa ch t xác các th - Xác nh ho t tính protease b ng phương pháp c l th ch trên môi trư ng NA. Các ch ng có kh năng phân gi i protein m nh cho ư ng kính vòng phân gi i l n xung quanh gi ng th ch. - Th nghi m gelatin: các ch ng có kh năng phân gi i gelatine s làm tan ch y môi trư ng NG trong ng th ch và ph n gelatine ã phân h y s không ông dù nhi t th p (4oC). 2.3.3. Phương pháp xác nh ho t tính enzyme protease và nh hư ng c a các y u t - Phương pháp Anson c i ti n xác nh ho t tính protease: ho t l c phân gi i casein trong d ch nuôi c y các ch ng Bacillus ã phân l p và ch n l c 37±1oC trong 60 phút ư c ánh giá thông qua h p th quang 660nm c a s n ph m phân gi i v i thu c th Folin. ơn v ho t tính enzyme ư c xác nh là lư ng enzyme c n chuy n hóa lư ng casein tương ương 1µmol tyrosine i u ki n thí nghi m. - Kh o sát nh hư ng c a th i gian nuôi c y n ho t tính protease: l y 1ml d ch chi t enzyme thô (sau ly tâm) t d ch nuôi c y sau các kho ng th i gian khác nhau (24 gi , 48 gi , 72 gi , 96 gi ) t i 37±1oC xác nh ho t tính b ng phương pháp Anson c i ti n. - Kh o sát nh hư ng c a pH ban u n ho t tính protease: l y 1ml d ch chi t enzyme thô sau kho ng th i gian nuôi c y phù h p ã xác nh ư c trên 37±1oC trong môi trư ng NB trư c ó ã i u ch nh pH v các giá tr 3, 5, 7, 9 b ng NaOH 1M ho c HCl 1M xác nh ho t tính b ng phương pháp Anson c i ti n. - Kh o sát nh hư ng c a nhi t n ho t tính protease: ti n hành nuôi c y các ch ng vi sinh v t v i kho ng th i gian và pH t i ưu ã xác nh trên trong các i u ki n nhi t l n lư t là 30±1oC, 37±1oC, 40±1oC, 50±1oC, nh ho t tính protease. 2.3. Phương pháp nghiên c u 2.3.1. Phương pháp phân l p các ch ng Bacillus có kh năng phân h y protein và xác nh các c i m hình thái, sinh hóa M u nư c th i c a các cơ s ch bi n th y s n nêu trên ư c gia nhi t 80oC trong kho ng 20 phút, pha loãng và c y trang trên môi trư ng NA, 37±1oC trong 24 gi , r i c y ria các khu n l c thu ư c n khi thu n nh t. Các ch ng vi khu n phân l p ư c xác nh hình thái b ng phương pháp nhu m Gram và nhu m bào t . c i m sinh hóa c a các ch ng ư c xác nh thông qua các th nghi m kh năng di ng, catalase, nitrate, Indol, Methyl red, VP, citrate, nitrate. T các k t qu thu nh n ư c trên, so sánh v i các mô t trong khóa phân lo i Bergey [17] bư c u d oán các ch ng vi khu n thu c chi Bacillus. 2.3.2. Phương pháp xác nh kh năng phân gi i protein c a các ch ng Bacillus phân l p - Trên môi trư ng NB v i thu c th Nessler: màu s c dung d ch thu ư c bi n thiên màu t vàng rơm n vàng nâu s m, ph thu c hàm lư ng NH3 sinh ra. V.H. Thi nnk. / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 116-124 119 60±1oC b ng thi t b i u nhi t. Sau ó, ly trích thu enzyme và xác nh ho t tính b ng phương pháp Anson c i ti n. t t c các kh o sát triên, m i thí nghi m u ư c l p l i 3 l n tính k t qu trung bình, sau khi ã lo i b sai s thô. Ti p theo, vi c l a ch n các ch ng Bacillus trong ph m vi tài d a trên hai y u t : - là các tr c khu n Gram dương, sinh bào t . - kh năng phân gi i protein t t, nh m m b o hi u qu khi ng d ng các ch ng này vào x lý nư c th i giàu m trong th c t . T ó, trong s 30 ch ng phân l p, ã l a ch n ư c 10 ch ng, trong ó có 7 ch ng có ngu n g c t nư c th i ch bi n th y s n, ký hi u M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7 và 3 ch ng có ngu n g c t nư c th i ch bi n th t, ký hi u V1, V2 và V3. Hình thái và kh năng phân gi i protein c a m t s ch ng phân l p trong s 10 ch ng l a ch n ư c th hi n trên các hình 1 và 2 dư i ây. 3. K t qu và th o lu n 3.1. K t qu phân l p và l a ch n các ch ng Bacillus có kh năng phân h y protein t t T các m u nư c th i c a 3 nhà máy th y s n, ã phân l p ư c 30 ch ng vi khu n có kh năng phát tri n trên môi trư ng NA ch a protein là ngu n carbon duy nh t. Hình 1. K t qu nhu m Gram c a các ch ng M1, M2, M3, V1, V2 (t trái qua ph i). M1 M2 M3 M4 M5 M6 Hình 2. Kh năng sinh NH3 ( nh trái) c a 10 ch ng Bacillus và ho t tính phân gi i protein ( nh ph i) c a 6 trong s 10 ch ng Bacillus 120 V.H. Thi nnk. / Tạp chí Khoahọc ĐHQGHN, Khoahọc Tự nhiên Công nghệ 28 (2012) 116-124 K t qu th nghi m sinh hóa c a 10 ch ng ư c trình bày b ng 1. B ng 1. K t qu th nghi m sinh hóa c a 10 ch ng vi khu n l a ch n Th nghi m M1 Di VP Indol Urease S. citrate Nitrate Tinh b t Manitol NaCl 7% ng + + + + Catalase M2 + + + M3 + + + + M4 + + + + + + Các ch ng vi khu n M5 + + + + M6 + + + + M7 + + + + + + + V1 + + + + + + + V2 + + + + + + V3 + + + + + + + + Như v y, t các k t qu thu ư c v hình thái, kh năng phân gi i protein cũng như c i m sinh hóa i v i 10 ch ng trên, so v i khóa phân lo i vi sinh v t c a Bergey [17], có th kh ng nh m t l n n a là các ch ng ã l a ch n u thu c chi Bacillus. So sánh v i các công trình c a Hà Thanh Toàn và ng tác gi [18] ã phân l p ư c 17 ch ng vi khu n phân gi i protein t nư c r rác C n Thơ; công trình c a Tr n Liên Hà và ng Ng c Sâm [14] ch n l c ư c 5 ch ng Bacillus có ho t tính protease t t t 50 ch ng ban u ng d ng x lý nư c h ô nhi m thì s lư ng các ch ng Bacillus phân l p ư c trong nghiên c u này cũng khá a d ng. 1 Ch ng M1 Ch ng M3 Ch ng M2 Ch ng M4 0.9 1 Ch ng M6 Ch ng V1 0.9 Ch ng V3 0.8 0.8 0.77 0.75 0.7 0.67 0.6 0.62 0.76 0.79 0.69 0.67 0.79 0.84 Ch ng M7 Ch ng V2 0.87 0.85 0.83 0.78 0.75 0.75 0.74 0.73 0.7 0.65 0.9 Ch ng M5 0.82 0.8 Ho t tính protease (U/ml) 0.85 0.82 0.78 0.8 0.79 0.82 0.77 0.76 0.7 0.76 0.7 0.73 0.69 0.67 0.6 0.65 0.62 0.7 0.67 0.5 24 gi 48 gi 72 gi 96 gi Ho t tính protease (U/ml) 0.5 24 gi 48 gi 72 gi 96 gi Th i gian nuôi c y (gi ) Th i gian nuôi c y (gi ) Hình 3. Ho t tính phân gi i protein theo th i gian c a các ch ng M1, M2, M3, M4, M5. Hình 4. Ho t tính phân gi i protein theo th i gian c a các ch ng M6, M7, V1, V2, V3.