Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài tai chua (Garcinia cowa Roxb. ex Choisy) và đằng hoàng (Garcinia hanburyi Hook. f) ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Với mục đích tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật thuộc chi Garcinia nhằm đóng góp cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực dược phẩm, luận án tập trung nghiên cứu hai loài thuộc chi Garcinia là Garcinia cowa và Garcinia hanburyi.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài tai chua (Garcinia cowa Roxb. ex Choisy) và đằng hoàng (Garcinia hanburyi Hook. f) ở Việt Nam

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ KIM AN NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI TAI CHUA (GARCINIA COWA ROXB. EX CHOISY) VÀ ĐẰNG HOÀNG (GARCINIA HANBURYI HOOK F.) Ở VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2020
2 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. NGÔ ĐẠI QUANG Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. TRẦN THỊ THU THỦY Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201…. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Ngày nay, các sản phẩm bảo vệ sức khỏe và hỗ trợ điều trị bệnh có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng vì an toàn với người sử dụng do có ít tác dụng phụ hơn các sản phẩm tổng hợp. Nhiều hợp chất từ thiên nhiên đã được nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc hóa học và chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng. Những nghiên cứu này không chỉ đóng góp kiến thức về các hợp chất trong thiên nhiên mà còn góp phần phát hiện các hợp chất tiềm năng, từ đó xây dựng được kế hoạch bảo tồn và phát triển những loài sinh vật có giá trị phù hợp với khí hậu và thổ nhưỡng của Việt Nam. Với khí hậu nóng ẩm chủ yếu, Việt Nam là môi trường sống thích hợp của nhiều loại cây thuốc quý đã được sử dụng trong dân gian. Nhiều loài thuộc chi Garcinia đã được sử dụng làm các vị thuốc chữa bệnh, ví dụ nhựa đằng hoàng (gamboge) khô dạng thỏi màu vàng được dùng để điều trị ung thư, cầm máu, tẩy giun sán, chữa viêm hô hấp … Nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học các loài thuộc chi Garcinia đã chỉ ra thành phần hóa học chính của chúng là các xanthone với nhiều hoạt tính sinh học giá trị như hoạt tính ức chế tế bào ung thư, hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính kháng khuẩn, ... Tại Việt Nam, hai cây thuộc chi Garcinia là cây tai chua (Garcinia cowa Robx. ex Choisy) và cây đằng hoàng (Garcinia hanburyi Hook. f) thuộc họ Guttiferae sinh trưởng và phát triển rất tốt, phân bố ở nhiều địa phương trên cả nước [1]. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài cây này, tuy nhiên cây tai chua (Garcinia cowa) và cây đằng hoàng (Garcinia hanburyi) mọc ở Việt Nam chưa được nhóm tác giả nào nghiên cứu. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Với mục đích tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật thuộc chi Garcinia nhằm đóng góp cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực dược phẩm, luận án tập trung nghiên cứu hai loài thuộc chi Garcinia là Garcinia cowa và Garcinia hanburyi. Do đó, luận án: “Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài tai chua (Garcinia cowa Roxb. ex Choisy) và đằng hoàng (Garcinia hanburyi Hook. f) ở Việt Nam.” được thực hiện với những nội dung chính sau: - Phân lập các hợp chất từ nhựa cây tai chua Garcinia cowa. - Phân lập các hợp chất từ nhựa và thân cành cây đằng hoàng Garcinia hanburyi. - Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được. - Khảo sát tính chất động học và nhiệt động học của acid gambogic làm cơ sở cho việc bán tổng hợp một số dẫn xuất của acid gambogic. - Khảo sát một số hoạt tính sinh học của các hợp chất thu được. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ nhựa cây tai chua Garcinia cowa và nhựa, thân cành cây đằng hoàng Garcinia hanburyi. - Khảo sát một số tính chất động học và nhiệt động học của acid gambogic - Tổng hợp một số dẫn xuất của acid gambogic trên cơ sở phản ứng ester hóa và amide hóa - Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất phân lập được theo các phương pháp ABTS và DPPH. - Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của một số chất phân lập từ cây Garcinia cowa - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất phân lập và tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư như ung thư gan (Hep-G2), phổi (LU-1), mô liên kết (RD), đại trực tràng (HT-29), cổ tử cung (HeLa).
2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Phần tổng quan thống kê các nghiên cứu trong nước và trên thế giới về các vấn đề sau: 1.1. Giới thiệu chung về chi Garcinia 1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Garcinia 1.1.2. Công dụng 1.1.3. Thành phần hóa học chi Garcinia 1.1.4. Hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ chi Garcinia 1.1.5. Nghiên cứu hóa học về chi Garcinia tại Việt Nam 1.2. Tổng quan về cây tai chua Garcinia cowa 1.2.1. Đặc điểm hình thái và phân bố 1.2.2. Tình hình nghiên cứu hóa học và các hoạt tính sinh học 1.3. Tổng quan về cây đằng hoàng Garcinia hanburyi 1.3.1. Đặc điểm hình thái và phân bố 1.3.2. Tình hình nghiên cứu hóa học và các hoạt tính sinh học 1.4. Tổng quan về acid gambogic 1.4.1. Cấu trúc hóa học 1.4.2. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của acid gambogic 1.4.3. Bán tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính sinh học các dẫn xuất của GA CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phần này mô tả chi tiết các quá trình xử lý mẫu, phương pháp tạo cặn chiết, tiến hành sắc ký và phân lập các hợp chất; các phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất; các phương pháp khảo sát một số tính chất động học và nhiệt động học của acid gambogic và các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học. 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nhựa của loài tai chua (Garcinia cowa) được thu tại huyện Quỳ Châu – Nghệ An và Phú Quốc – Kiên Giang vào tháng 12 năm 2015. Mẫu tiêu bản số GC2015128 lưu tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Nhựa và thân cành của loài đằng hoàng (Garcinia hanburyi) được thu tại huyện Phú Quốc – Kiên Giang vào tháng 12 năm 2015. Mẫu tiêu bản số GH2015129 lưu tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Cả hai loài trên được giám định loài bởi TS. Nguyễn Quốc Bình - Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập các chất Việc phân lập các chất từ các dịch chiết các bộ phận của cây được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là RP-18 (Merck) và sắc ký rây phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck). 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc Cấu trúc các hợp chất phân lập và bán tổng hợp được xác định bằng cách kết hợp giữa các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại.  Phổ khối phân giải cao HRESIMS  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều
3  Nhiệt độ nóng chảy  Góc quay cực [α]D 2.2.3. Phương pháp khảo sát động học của các vật liệu vô định hình Các phương pháp phổ biến nhất để khảo sát động học ở trạng thái gương của các vật liệu vô định hình là phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai (differential scanning calorimetry - DSC) và quang phổ điện môi băng thông rộng (broadband dielectric spectroscopy - BDS). 2.2.4. Các phương pháp đánh giá hoạt tính 2.2.4.1. Phương pháp đánh giá khả năng chống oxi hóa ABTS và DPPH  Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa ABTS Hoạt tính chống oxi hóa bằng ABTS của một chất thử được tiến hành theo phương pháp của Saeed N. [218] có sự thay đổi nhỏ.  Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa DPPH Hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH được tiến hành theo phương pháp của Brand Williams [219] có chỉnh sửa. Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp ABTS và DPPH của các mẫu nghiên cứu được tính như sau: % Thu dọn gốc tự do = (ODđối chứng – ODmẫu thử)*100/ODđối chứng (%) Trong đó: ODđối chứng: Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử ODmẫu thử: Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử 2.2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase  Nguyên lí: Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-nitrophenyl--D-glucopyranoside dưới tác động của enzyme -glucosidase, tạo ra sản phẩm p-nitrophenol có màu vàng: p-nitrophenyl--D-glucopyranoside   -D-glucose + p-nitrophenol  glu cos idase Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng cho biết lượng sản phẩm p-nitrophenol sinh ra, từ đó phản ánh hoạt độ của enzyme -glucosidase.  Khả năng ức chế enzyme - glucosidase của mẫu thử được xác định bằng công thức: % ức chế = [A(đối chứng) – A(mẫu thử)] / A(đối chứng) x 100% IC50 là nồng độ chất thử ức chế 50% hoạt động của enzyme -glucosidase, được tính bằng phần mềm Tablecurve. 2.2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro  Phương pháp sàng lọc hoạt tính MTT [222]  Phương pháp sàng lọc hoạt tính SRB [221] CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM Phần thực nghiệm mô tả chi tiết các quá trình xử lý mẫu tạo cặn chiết, phân lập các chất sạch từ nhựa cây G. cowa và từ nhựa và thân cành cây G. hanburyi. Phần này cũng mô tả quá trình khảo sát một số tính chất động
4 học và nhiệt động học của acid gambogic, quá trình tổng hợp các dẫn xuất của acid gambogic. Các dữ kiện phổ và các hắng số vật lý của các chất phân lập và tổng hợp được cũng được trình bày tại đây. 3.1. Phân lập các chất từ cây G. cowa Nhựa G. cowa (3,0 kg) Đập nhỏ, sấy ở 45oC trong 3 ngày Nhựa G. cowa khô (2,8 kg) Ngâm MeOH (3 L x 3 lần) ở nhiệt độ phòng, kết hợp siêu âm Cặn tổng (500,0 g) Ngâm DCM (3 L x 3 lần) Cặn DCM (96,7 g) Cặn MeOH CC-SiO2, DCM-MeOH (100:0 đến 0:100, v/v) GCN1 (22,4 g) GCN2 (37,5 g) GCN3 (15,9 g) GCN3.1 GCN3.2 GC5 GC4 GC2 14,2 mg 9,8 mg 13,5 mg GCN1.3 GCN1.4 GCN1.6 GCN1.8 GC18 GC8 GC7 GC9 GC12 GC10 160 mg 230 mg 40 mg 120 mg 1,43 g 260 mg GCN2.2 GCN2.4 GCN2.6 GCN2.8 GCN2.10 GCN2.11 GC11 GC13 GC14 GC16 GC1 GC3 GC15 GC17 GC6 20 mg 45 mg 850 mg 37 mg 80 mg 8,3 mg 28 mg 12,1 mg 25,8 mg Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết DCM của nhựa cây G. Cowa Nhựa cây G. cowa (3,0 kg) có dạng chất rắn màu nâu, sau khi thu mua về được đập thành các cục nhỏ và được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 45 °C trong ba ngày để loại bỏ hơi ẩm, kết quả thu được 2,8 kg nhựa khô. Ngâm nhựa cây G. cowa khô vào 3 L dung môi MeOH ở nhiệt độ phòng, kết hợp với siêu âm trong hai ngày. Thực hiện chiết lại 3 lần, mỗi lần 3 L MeOH. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi ở áp suất thấp
5 thu được 500 g cặn tổng có dạng nhựa màu nâu đen. Phần cặn tổng được chiết bằng dung môi DCM (500 mL x 3) ở nhiệt độ phòng kết hợp với siêu âm thu được 96,7 g cặn DCM và còn lại phần không tan là cặn MeOH. 3.2. Phân lập các chất từ cây G. hanburyi 3.2.1. Phân lập các chất từ nguyên liệu thân cành Nguyên liệu thân cành G. hanburyi (2,5 kg) thu được là các đoạn hình trụ, thẳng hay cong queo dài 10-30 cm, đường kính 0,5-1,0 cm. Nguyên liệu thu về được chặt thành mảnh nhỏ, đem sấy khô ba ngày trong tủ sấy ở nhiệt độ 45oC để loại bỏ hoàn toàn nước, thu được 2,1 kg nguyên liệu khô. Sau đó nguyên liệu được nghiền thành bột, ngâm với MeOH (3 L × 3) ở nhiệt độ phòng kết hợp với siêu âm ở 40ºC. Dịch chiết được lọc và gom lại sau đó được quay cất chân không ở áp suất thấp thu được 325,0 g cặn tổng MeOH dạng nhựa màu nâu đậm. Cặn này được hòa tan và chiết với DCM (500 mL × 3). Sau khi cô quay để loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được cặn chiết DCM (71,9 g), phần không tan trong DCM còn lại là cặn MeOH. Thân cành G. hanburyi (2,5 kg) Chặt nhỏ, sấy ở 45oC trong 3 ngày Thân cành G. hanburyi khô (2,1 kg) Ngâm MeOH (3 L x 3 lần) ở nhiệt độ phòng, kết hợp siêu âm Cặn tổng (325 g) Ngâm DCM (500 mL x 3 lần) Cặn DCM (71,9 g) Cặn MeOH CC-SiO2, n-hexane-EtOAc (100:0 đến 3:1, v/v), DCM-EtOAc (15:1 đến 3:1, v/v) và DCM-MeOH (9:1 đến 1:2, v/v)) GHT1 GHT2 GHT3 GHT4 GHT5 GHT6 GHT7 GHT8 3,4 g 11,9 g 7,4 g 7,5 g 9,5 g GH6 GH1 GH8 30 GH3 10 GH2 30 mg 820 mg mg mg 470 mg Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết DCM của thân cành cây G. hanburyi 3.1.2. Phân lập các chất từ nguyên liệu nhựa Nhựa có dạng nhựa mủ màu vàng nhạt, khối lượng 500 g. Mủ nhựa được cho vào bình cầu, thêm axeton và cất dưới áp suất thấp để loại bỏ nước trong mẫu, thu được 356,0 gam nhựa khô. Ngâm nhựa khô trong 3 L dung môi MeOH ở nhiệt độ phòng, kết hợp với siêu âm trong hai ngày. Thực hiện chiết lại 3 lần, mỗi lần 3 L
6 MeOH. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi ở áp suất thấp thu được 257,0 g cặn tổng có dạng nhựa màu vàng nâu. Phần cặn tổng được chiết bằng dung môi DCM (500 mL x 3) ở nhiệt độ phòng kết hợp với siêu âm thu được 89,0 g cặn DCM và còn lại phần không tan trong DCM là cặn MeOH. Mủ nhựa G. hanburyi (400 g) Thêm acetone, cất dưới áp suất thấp Nhựa G. hanburyi khô (356 g) Ngâm MeOH (3 L x 3 lần) ở nhiệt độ phòng, kết hợp siêu âm Cặn tổng (257 g) Ngâm DCM (500 mL x 3 lần) Cặn DCM (89,0 g) Cặn MeOH CC-SiO2, n-hexane-EtOAc (100:0 đến 3:1, v/v), DCM-EtOAc (15:1 đến 3:1, v/v) và DCM-MeOH (9:1 đến 1:2, v/v)) GHN4 GHN6 GHN8 GHN10 23,4 g 29,6 g 10,8 g 15,1 g GH5 GH7 GH1 GH2 GH4 38 mg 300 mg 930 mg 270 mg 750 mg Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết DCM của nhựa cây G. hanburyi 3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của GA 3.3.1. Khảo sát tính chất nhiệt động học và động học của acid gambogic ở trạng thái gương và trạng thái dung dịch siêu lạnh Trước khi tiến hành các phản ứng tổng hợp, các tính chất nhiệt động học và động học của acid gambogic ở trạng thái gương và trạng thái dung dịch siêu lạnh đã được khảo sát theo phương pháp mô tả tại phần 2.2.3 tại Viện Vật lý – Trường Đại học Silesia, Ba Lan nhằm mục đích đánh giá mức độ đáp ứng của GA với các tính chất của hoạt chất có khả năng ứng dụng làm thuốc. Tính chất nhiệt động học của acid gambogic được đo trên máy phân tích nhiệt quét vi sai Mettler-Toledo sử dụng phần mềm 1 STARe. Thiết bị đo được trang bị với một cảm biến gốm ceramic với 120 cặp nhiệt điện (thermocouple) và hệ thống làm mát sử dụng nitrogen lỏng. Thiết bị được hiệu chỉnh nhiệt độ và entanpi bằng việc sử dụng indium và kẽm tiêu chuẩn. Mẫu được khảo sát trong chén nung bằng nhôm, kích thước 40 µL. Tất cả các phép đo được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 273-373 K với tốc độ gia nhiệt 10 K/phút. Quang phổ điện môi phổ rộng (BDS) của acid gambogic được đo trên máy phân tích tần số hiệu suất cao Novo-Control GmbH Alpha hoạt động trong dải tần số từ 10−1 đến 106 Hz và trong khoảng nhiệt độ 153-411 K. Thiết bị điều khiển nhiệt Quattro có thể kiểm soát quá trình tăng nhiệt với sai số nhỏ hơn 0,1 K. Đường kính của các mẫu là 15 mm và khoảng cách giữa các phân tử acid gambogic trạng thái gương là 0,1 mm.
7 3.3.2. Tổng hợp các dẫn xuất của GA Các phản ứng tổng hợp dẫn xuất ester và amide của GA được tiến hành theo sơ đồ hình 3.4 giữa GA với tác nhân R-H là alcohol hoặc amine, sử dụng hệ xúc tác DDC/DMAP để hoạt hóa nhóm acid. Các alcohol tham gia phản ứng gồm methanol và ethanol; các amine tham gia phản ứng gồm diallylamine, piperidine, morpholine, 1-(4- trifluoromethyl-phenyl)-piperazine, 1-(2,5-difluoro-benzyl)-piperazine, thiophene-2-ethylamine, furfurylamine. O O 30 29 HO 34 33 35 R 28 24 27 25 O 32 31 26 O 23 19 22 40 37 20 17 13 O O O R-H 38 O 18 16 O 14 O 36 2 12 21 DCC/DMAP 39 3 9 11 5 7 8 4 6 10 OH O OH O Hình 3.4. Sơ đồ tạo dẫn xuất ester/amide của GA 3.3.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất ester của GA Hỗn hợp của GA (100 mg; 0,16 mmol), DMAP (2,925 mg; 0,024 mmol), DCC (49,5 mg; 0,24 mmol) và MeOH hoặc EtOH (1,6 mmol) trong THF (3 mL) được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3h. Dung dịch phản ứng được đổ vào nước (10 mL), chiết bằng EtOAc (3 x 10 mL). Pha hữu cơ được gộp lại, làm khan và cô đặc cho sản phẩm thô. Tinh chế sản phẩm thô trên cột silica gel (cỡ hạt 40-63 μm, đường kính cột Φ 20 mm, chiều dài cột L = 50 cm) sử dụng hệ dung môi giải ly n-hexane-EtOAc thu được hai ester kí hiệu là GA1 và GA2. 3.3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất amide của GA Hỗn hợp của GA (100 mg; 0,16 mmol), DMAP (2,925 mg; 0,024 mmol), DCC (49,5 mg; 0,24 mmol) và amine (0,24 mmol) trong THF (3 mL) được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 10-24 h (kiểm tra bằng TLC). Dung dịch phản ứng được đổ vào nước (10 mL) và chiết bằng EtOAc (3 x 8 mL). Pha hữu cơ được gộp lại, làm khan và cô đặc, tinh chế trên cột silica gel (cỡ hạt 40-63 μm, đường kính cột Φ 20 mm, chiều dài cột L = 50 cm) sử dụng hệ dung môi giải ly n-hexane-EtOAc, kết quả thu được 6 sản phẩm amide hóa, kí hiệu là GA3-GA8. 3.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất 3.4.1. Hoạt tính chống oxi hóa ABTS và DPPH Các hợp chất GC7-GC16, GH1-GH8 được đánh giá hoạt tính chống oxi hóa ABTS và DPPH theo phương pháp mô tả ở phần 2.2.3.1, thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3.4.2. Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase Các hợp chất được đánh giá hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase theo phương pháp được mô tả trong phần 2.2.3.2, thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3.4.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro Các hợp chất GC1-GC18, GH1-GH8 được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng tế bào HT-29 và HeLa theo phương pháp MTT mô tả ở phần 2.2.3.3, thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu hợp chất tự nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Hàn Quốc (KIST), Gangneung, Hàn Quốc. Các hợp chất GA1-GA8 và GA được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư Hep-G2, LU-1 và RD theo phương pháp SRB mô tả ở phần 2.2.3.3, thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
8 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phần này trình bày về cách xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập và tổng hợp được, kết quả khảo sát một số tính chất nhiệt động học và động học của acid gambogic và kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất phân lập và tổng hợp được 4.1. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học cây G. cowa Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết DCM của nhựa cây G. cowa đã thu được 18 chất, gồm 17 xanthone: cowaxanthone I-K (GC1-GC3), norcowanol A-B (GC4-GC5), garcinone F (GC6), fuscaxanthone A (GC7), 7-O-methylgarcinone E (GC8), cowagarcinone A (GC9), cowaxanthone (GC10), rubraxanthone (GC11), cowanin (GC12), norcowanin (GC13), cowanol (GC14), kaennacowanol A (GC15), garcinone D (GC16), fuscaxanthone I (GC17) và 01 hợp chất tocotrienol: parvifoliol F (GC18). Trong đó, 06 hợp chất GC1- GC6 được xác định là các hợp chất mới. Cấu trúc các hợp chất được trình bày dưới đây: R6 O OH 9' 8' 8 1 R5 8a 9a R1 9 A B C 5a O 4a OH R4 5 4 10' R3 R2 R1 R2 R3 R4 R5 R6 1' O OH 1 7'-OH-Ge H H OH OCH3 H 8 1 10 MeO 11 7'-OH-Ge H H OH OH H 9 2 13 3 H 7'-OH-Ge H H OH H HO 5 O 4 O 4 4'-OH-Pr H H OH OH 7''-OH-Ge 14 7 5 3'-OH-Pr H H OH OH 7''-OH-Ge 6 3'-OH-Pr H H OH OCH3 3''-OH-Pr 8 prenyl H prenyl OH OCH3 prenyl 9 prenyl H prenyl OH OCH3 geranyl 26 5 4 geranyl H OH OCH3 H 4a 24 23 21 10 H 6 25 11 H H H OH OCH3 geranyl 12 16 20 8a O 2 22 12 prenyl H H OH OCH3 geranyl 8 9 11 15 19 prenyl H H OH OH geranyl OH 13 18 14 4'-OH-Pr H H OH OCH3 geranyl 15 4'-OH-Pr H H OH OCH3 7''-OH-Ge 16 prenyl H H OH OCH3 3''-OH-Pr 17 4'-OH-Pr H H OH OCH3 3''-OH-Ge 4' 10' 8' CH2OH 1' OH 1' 7'-OH-Ge = 9' 4'-OH-Pr = 5' 10'' 8'' 4' 1'' OH 1' OH 7''-OH-Ge = 9'' 3'-OH-Pr = 5' 10'' 4'' 8'' 1'' OH 1'' OH 3''-OH-Ge = 9'' 3''-OH-Pr = 5'' Hình 4.1. Cấu trúc các hợp chất GCx (x = 1-18) phân lập từ cây G. cowa Tất cả các xanthone thu được đều là xanthone tetraoxygen thế với các vị trí mang oxy là C-1, C-3, C-6 và C-7, trừ hợp chất GC3 là trioxygen thế. Trên phổ 1H NMR của các xanthone phân lập được đều quan sát thấy tín hiệu đặc trưng của nhóm 1-OH phenol liên hợp với nhóm cacbonyl tại H 13,00-14,00 trừ các hợp chất được đo phổ trong dung môi CD3OD. Tín hiệu của các proton thơm ở vùng trường yếu là tín hiệu của các proton thuộc khung xanthone, trong đó proton H-8 do chịu ảnh hưởng hút electron của nhóm cacbonyl liên hợp ở C-9 nên thường xuất hiện ở trường yếu hơn so với tín hiệu của các proton thơm còn lại với độ chuyển dịch hóa học H 7,45-7,53. Tín hiệu của proton H-2, H-4, H-6 thường xuất hiện ở H 6,19-6,33; trong khi đó tín hiệu của proton H-
9 5 thường xuất hiện tại trường yếu hơn H 6,68-6,86. Riêng hợp chất GC3 có tín hiệu H-5 và H-6 xuất hiện ở trường rất yếu tại H lần lượt 7,41 và 7,28 gần với tín hiệu độ dịch chuyển của H-8 tại H 7,51. Trên phổ 13C NMR của các hợp chất phân lập được đều xuất hiện các tín hiệu cacbon đặc trưng của khung xanthone chứa 1-3 nhóm thế prenyl hoặc geranyl [45, 161, 167, 173, 180]. Kết quả tổng hợp các tín hiệu cacbon trong khung xanthone của các hợp chất GC1-GC17 được tổng hợp trong bảng 4.1 dưới đây. Bảng 4.1. Tín hiệu độ dịch chuyển của các cacbon trong khung xanthone Cac Vị C-C hoặc C- Ghi chú trí C-O C-H prenyl/geranyl 1 160,0-162,7 - - GC7: C 158,0 (C-O) 2 - 98,3-98,4 104,5-112,2 3 161,5-164,5 - - GC7: C 159,9 (C-O) 4 - 92,2-93,9 107,8 4a 155,1-157,1 - - 5 - 100,9-103,9 111,4-113,9 GC3: C 119,8 (C-H) 5a 152,9-157,9 - - 6 152,3-157,8 125,3 - GC3: C 125,3 (C-H) 7 142,6-147,2 - - GC3: C 151,4 (C-O) 8 - 105,0-109,4 129,2-139,8 8a - - 109,5-113,8 GC3: C 121,9 (C-C) 9 179,9-183,5 - - 9a - - 101,7-103,9 a Đo trong CDCl3, 125 MHz. c Cấu trúc các chất được xác định dựa vào các dữ kiện phổ NMR, HRESIMS kết hợp với so sánh với các hợp chất đã được công bố trong các tài liệu tham khảo. Kết quả xác định được cấu trúc của 17 xanthone, trong đó có 06 xanthone mới: cowaxanthone I-K (GC1-GC3), norcowanol A-B (GC4-GC5), garcinone F (GC6) và 03 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ cây G. cowa: garcinone D (GC16), fuscaxanthone I (GC17) và parvifoliol F (GC18). Sau đây trình bày kết quả nghiên cứu cấu trúc của hai hợp chất GC1 và GC4. 4.1.1. Hợp chất GC1: Cowaxanthone I (Hợp chất mới) Hợp chất GC1 được phân lập ở dạng tinh thể hình kim óng ánh màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 204-205 o C. Trên phổ HRESIMS (hình 4.2) xuất hiện pic ion phân tử proton hóa [M+H]+ tại m/z 429,1907 (tính toán lý thuyết cho CTPT C24H29O7 là 429,1908), do đó CTPT của GC1 được xác định là C24H28O7. Phổ 1H và 13C NMR của GC1 xuất hiện các tín hiệu gợi ý GC1 có cấu trúc của một xanthone monogeranyl hóa. Tại vùng trường thấp trên phổ 1H NMR có tín hiệu cộng hưởng của ba proton thơm tại H 7,50 (1H; s; H-8); 6,80 (1H; s; H-5) và 6,32 (1H; s; H-4). Ngoài ra còn có tín hiệu của một nhóm methoxy dao động ở H 3,96 (3H; s; 7-OCH3) và một nhóm geranyl hydrate hóa (hình 4.3). Trên phổ 13C NMR có tín hiệu của 15 Csp2 với các tín hiệu đặc trưng cho khung xanthone. Đó là tín hiệu của một nhóm cacbonyl ở C 181,0 (C-9) và tín hiệu của một cacbon phenolic liên hợp với nhóm cacbonyl ở C 161,1 (C-1). Phổ 13C NMR cũng chỉ ra tín hiệu của 6 cacbon thơm đính với oxygen tại C 161,1 (C-1); 164,1 (C-3); 157,2 (C-4a); 155,7 (C-5a); 153,9 (C-6) và 147,2 (C-7). Tín
10 hiệu của cacbon methoxy xuất hiện ở C 56,7 (7-OCH3) còn tín hiệu của một Csp3 bậc 3 liên kết với oxygen ở C 71,5 (C-7’) (hình 4.4). Hình 4.3. Phổ 1H NMR của hợp chất GC1 Hình 4.4. Phổ 13C NMR của hợp chất GC1 Tín hiệu proton thơm ở trường thấp H 7,50 được quy kết cho H-8 do ảnh hưởng hút electron của nhóm cacbonyl liên hợp ở C-9. Trên phổ HMBC cũng chỉ ra tương tác của H-8 với C-9, C-8a (C 113,6) và C-7. Nhóm methoxy được quy kết ở vị trí C-7 do tương tác HMBC của proton nhóm methoxy và H-8 với C-7. Hai proton thơm còn lại được quy kết là H-5 (H 6,80) và H-4 (H 6,32) do tương tác HMBC của proton H-5 với C-9, C-7, C- 6 và của proton H-4 với C-9, C-2 (C 111,8), C-3. Sự có mặt của nhóm geranyl hydrate hóa được xác định dựa vào các tín hiệu trên phổ 1H, 13C NMR, HSQC và HMBC. Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác của proton H-1’ (H 3,33) với cacbon phenolic C-1 và với C-2, C- 3; tương tác của proton anken tại H 5,27 (1H; t; 6,0; H-2’) với hai cacbon methylen là C-1’ (C 22,1), C-4’ (C 41,3) và một cacbon methyl C-10’ (C 16,1); tương tác của proton methylen H-4’ (H 1,98) với một cacbon anken bậc 4 là C-3’ (C 135,6) và hai cacbon methylen C-5’ (C 23,7), C-6’ (C 44,3). Vị trí của nhóm hydroxy trên nhóm geranyl được xác định tại C-7’ do tương tác HMBC của hai nhóm proton methylen H-5’, -6’ (H lần lượt 1,47 và 1,40) và proton của hai nhóm methyl H-8’, -9’ (H 1,15) với C-7’. Các dữ liệu phổ của GC1 được đưa ra trong bảng 4.2, cấu trúc phân tử và các tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất GC1 được chỉ ra trong hình 4.5. O OH 10' 9' H O OH OH OH H3CO 7 8 9a 1 1' 3' 5' 7' H3CO 8a9 2 2' 4' 6' 8' 5a 3 HO O OH HO 6 O 4a OH 5 4 H H Hình 4.5. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất GC1 Bảng 4.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC1 và GC2 Vị trí GC1 GC2  H ab (mult; J) C ac HMBC (HC)  ab H (mult; J) Cac HMBC (HC) 1 161,1 161,1 2 111,8 111,6 3 164,1 164,0 4 6,32 (s) 94,0 2, 3, 4a, 9a, 9 6,33 (s) 93,9 2, 3, 4a, 9a, 9 4a 157,2 157,2 5 6,80 (s) 103,7 5a, 8a, 7, 6, 9 6,79 (s) 103,4 5a, 8a, 7, 6, 9 5a 155,7 155,3 6 153,9 153,2
11 7 147,2 144,7 8 7,50 (s) 105,7 5, 5a, 6, 7, 8a, 9 7,45 (s) 109,1 5, 5a, 6, 7, 9 8a 113,6 113,8 9 181,0 181,1 9a 103,2 103,2 1’ 3,33 (m) 22,1 3, 1, 3’, 2’, 2 3,33 (m) 22,1 3, 1, 3’, 2’, 2 2’ 5,27 (t; 6,0) 123,8 1’, 4’, 10’ 5,27 (t; 7,0) 123,8 1’, 4’, 10’ 3’ 135,6 135,6 4’ 1,98 (m) 41,3 2’, 3’, 5’, 6’, 10’ 1,98 (t; 7,0) 41,3 2’, 3’, 5’, 6’, 10’ 5’ 1,47 (m) 23,7 3’, 7’, 6’, 4’ 1,47 (m) 23,6 3’, 7’, 6’, 4’ 6’ 1,40 (m) 44,3 5’, 8’, 9’, 4’, 7’ 1,39 (m) 44,2 5’, 8’, 9’, 4’, 7’ 7’ 71,5 71,5 8’ 1,15 (s) 29,2 6’, 7’, 9’ 1,15 (s) 29,1 6’, 7’, 9’ 9’ 1,15 (s) 29,2 6’, 7’, 8’ 1,15 (s) 29,1 6’, 7’, 8’ 10’ 1,80 s) 16,1 2’, 3’, 4’ 1,79 (s) 16,1 2’, 3’, 4’ OCH3 3,96 (s) 56,7 7 - - - a Đo trong CD3OD, 500 MHz, 125 MHz b c Trên cơ sở phân tích phổ HRESIMS và các phổ 1D, 2D NMR của hợp chất GC1, chúng tôi xác định GC1 là 1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2-(7-hydroxy-3,7-dimethyloct-2-enyl)xanthone. Đây là hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên và được đặt tên là cowaxanthone I. 4.1.2. Hợp chất GC4: Norcowanol A (Hợp chất mới) Hợp chất GC4 phân lập được dưới dạng chất bột màu vàng nhạt. Trên phổ HRESIMS (hình 4.14) xuất hiện pic ion phân tử proton hóa [M+H]+ tại m/z 499,2324 (tính toán lý thuyết cho CTPT C28H35O8 là 499,2326), do đó CTPT của GC4 được xác định là C28H34O8. Hình 4.15. Phổ 1H NMR của hợp chất GC4 Hình 4.16. Phổ 13C NMR của hợp chất GC4 Phổ 1H và 13C NMR của GC4 xuất hiện các tín hiệu có thể gợi ý GC4 có cấu trúc của một xanthone chứa một nhóm geranyl hydrate hóa và một nhóm prenyl hydrate hóa. Tại vùng trường thấp trên phổ 1H và 13C NMR có tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm CH thơm tại H 6,27 (1H; s; H-4)/ C 93,1 và 6,69 (1H; s; H-5)/ C 101,0. Tín hiệu của hai nhóm methylen dạng doublet xuất hiện ở H 3,41 (2H; d; 7,5; H-1’)/ C 21,8 và 4,15 (2H; d; 6,5; H-1”)/ C 26,5 và tín hiệu singlet của 4 nhóm methyl gợi ý sự tồn tại của hai nhóm thế prenyl hoặc geranyl trên khung xanthone. Nhóm geranyl được xác định là nhóm 7-hydroxy-3,7-dimethyloct-2-enyl dựa vào phổ NMR và các tương tác H-C trên phổ HSQC và HMBC, trong đó đặc biệt là tín hiệu của hai nhóm methylen có cùng độ dịch chuyển hóa học tại H 1,12 (3H; s; H-8”, -9”)/ C 29,1 và tương tác trên phổ HMBC của hai nhóm methyl này với một Csp3 bậc 3 liên kết với oxygen tại C 71,5 (C-7”). Ngoài ra còn có tương tác
12 H-C trên phổ HMBC của proton H-1” với hai cacbon anken C-2” (C 125,0), C-3” (C 135,5) và tương tác của proton anken H-2” với 2 cacbon methylen C-1”, C-4” (C 41,3) và 1 cacbon methyl C-10” (C 16,5). Tín hiệu dịch chuyển về trường thấp của nhóm methylen CH2-1” gợi ý nhóm geranyl gắn với C-8. Trên phổ HMBC cũng xuất hiện tương tác của H-1” với các cacbon của khung xanthone là C-7 (C 142,5), C-8 (C 129,2) và C-8a (C 112,1). Nhóm prenyl được xác định là nhóm 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl dựa vào tương tác HMBC của proton H- 1’ với các cacbon C-2’ (C 126,8) và C-3’ (C 135,1) và tương tác của proton methylen dạng singlet liên kết với oxygen tại H 4,33 (3H; s; H-4’)/ C 61,8 với các cacbon C-2’, C-3’ và C-5’ (C 21,7). Vị trí của nhóm prenyl được xác định tại C-2 do tương tác HMBC của H-1’ với C-1 (C 161,5), C-2 (C 110,3) và C-3 (C 163,2). Các tương tác HMBC của proton H-4 với các cacbon C-2, C-3, C-4a (C 156,4), C-9a (C 103,9), C-9 (C 183,5) và tương tác của proton H-5 với các cacbon C-8a, C-7, C-6 và C-9 cho phép xác định vị trí của các proton thơm trong khung xanthone. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của GC4 được trình bày dưới đây, các dữ liệu phổ của hợp chất GC4 trình bày trong bảng 4.4. 9'' OH 8'' OH 7'' 6'' 5'' 10'' 4'' 3'' OH OH 2'' 1'' 4' O OH O OH 8 1 1' 3' HO HO 7 9 9a 8a 2 2' 5' 5a 3 HO 6 O 4a OH HO O OH 5 4 H H Hình 4.17. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất GC4 Kết quả phân tích phổ của hợp chất GC4 cho thấy cấu trúc của hợp chất gần như trùng khớp với hợp chất kaennacowanol A đã được phân lập từ cây G. cowa [141], ngoại trừ sự biến mất tín hiệu của nhóm methoxy. Trên cơ sở phân tích phổ HRESIMS và các phổ 1D, 2D NMR của hợp chất GC4, hợp chất GC4 được xác định là 1,3,6,7-tetrahydroxy-2-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl)-8-(7-hydroxy-3,7-dimethyloct-2-enyl)xanthone. Đây là hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên và được đặt tên là norcowanol A. 4.2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học cây G. hanburyi Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết DCM của thân và nhựa cây G. hanburyi thu được 8 xanthone lồng GH1-GH8. Cấu trúc các hợp chất được trình bày dưới đây. Trên phổ NMR của các hợp chất GH1-GH8 đều xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho các hợp chất xanthone polyprenyl thế mang khung lồng 4-oxotricyclo[4.3.1.03,7]dec-8-en-2-one - một kiểu khung xanthone phổ biến ở cây G. hanburyi. Ngoài ra còn có các tín hiệu đặc trưng của một vòng pyrano hình thành do phản ứng của nhóm –OH và nhóm geranyl. R1 R2 CHO 24 25 O 23 O 19 22 20 13 O 18 1716 O 14 O O O O R3 2 A 21 D C B 12 3 9 11 5 7 8 4 6 10 OH O OH O O R1 R2 R3 R 7 R = CH3 1 COOH CH3 isoprenyl 8 R = n-butyl 2 CH3 COOH isoprenyl 3 COOH CH3 H 4 CH3 COOH H isoprenyl = 5 CH3 CHO H 6 CH3 CH3 H
13 Hình 4.61. Cấu trúc hóa học các hợp chất GHx (x = 1-8) phân lập từ cây G. hanburyi Phổ H NMR khung xanthone lồng của các hợp chất GH1-GH8 cho thấy các tín hiệu proton tương đương 1 có độ dịch chuyển tương tự nhau. Đó là tín hiệu singlet của proton nhóm hydroxy phenolic liên hợp với nhóm cacbonyl tại H 12,70-13,00 (6-OH). Tín hiệu proton doublet ở trường yếu đặc trưng cho tín hiệu của proton olefin liên hợp với nhóm cacbonyl tại H 7,55-7,57 (d; 6,5-7,0; H-10). Nhóm tín hiệu proton đặc trưng cho cấu trúc lồng gồm tín hiệu của một nhóm methylen xuất hiện tại H 2,31 (1H; dd; 13,0; 5,0; H-21); 1,34-1,36 (1H; overlap; H-21); một proton methine tại H 2,51 (1H; d; 9,5; H-22) và một proton methine tại H 3,47 (1H; m; H-11) đối với xanthone mang khung lồng 4-oxotricyclo[4.3.1.03,7]dec-8-en-2-one hoặc tại H 2,81-2,89 đối với đối với xanthone mang khung lồng 4-oxotricyclo[4.3.1.03,7]decan-2-one. Tín hiệu của một cặp proton doublet có hằng số tách J = 10,0 tại H 6,61-6,66 (H-4) và 5,38-5,54 (H-3) đặc trưng cho liên kết đôi của vòng pyrano (vòng D) (bảng 4.17). Bảng 4.17. Tín hiệu độ dịch chuyển của các proton và cacbon khung xanthone lồng Vị trí Xanthone mang khung lồng 4- Xanthone mang khung lồng 4- oxotricyclo[4.3.1.03,7]dec-8-en-2-one oxotricyclo[4.3.1.03,7]decan-2-one Hab Cac Hab Cac 2 78,4-81,3 78,4-81,3 3 5,38-5,54 (d; 10,0) 124,5-126,5 5,38-5,54 (d; 10,0) 124,5-126,5 4 6,61-6,66 (d; 10,0) 115,3-115,9 6,61-6,66 (d; 10,0) 115,3-115,9 5 102,8-103,3 102,8-103,3 6 - 157,3 -157,8 - 157,3 -157,8 7 100,4-100,6 100,4-100,6 8 178,8-179,0 178,8-179,0 9 133,2-133,8 3,07-3,18 (m) 48,5-48,6 10 7,55-7,57 (d; 6,0-6,5) 134,9-135,6 4,37-4,42 (dd; 4,5; 72,3-74,1 1,5) 11 3,47 46,8-47,0 2,81-2,89 43,7-44,2 12 202,4-203,5 208,1-208,4 13 83,7-84,7 86,0-86,4 14 90,5-90,9 88,4-88,4 16 157,3-157,7 155,5-155,7 17 107,6-108,3 107,6-108,3 18 160,9-161,5 160,9-161,5 21 2,31 (dd; 13,0; 5,0); 1,34- 25,2-25,5 2,31 (dd; 13,0; 5,0); 20,0 1,36 (overlap) 1,34-1,36 (overlap) 22 2,51 (d; 9,5) 49,0-49,2 2,51 (d; 9,5) 43,6 23 83,2-84,1 82,1-82,4 24 1,69 (s) 29,7-30,1 1,69 (s) 29,7-30,1 25 1,29 (s) 27,2-29,1 1,29 (s) 27,2-29,1 a Đo trong CDCl3, 500 MHz, 125 MHz. b c Tín hiệu độ dịch chuyển của các cacbon ở cùng vị trí trong các xanthone mang khung lồng có cấu trúc tương tự (6 xanthone mang khung lồng 4-oxotricyclo[4.3.1.03,7]dec-8-en-2-one GH1-GH6 và hai xanthone mang
14 khung lồng 4-oxotricyclo[4.3.1.03,7]decan-2-one GH7-GH8) gần như trùng khớp với nhau. Ngoài ra, có thể quan sát thấy khi khung xanthone lồng bị oxi hóa thành khung 4-oxotricyclo[4.3.1.03,7]decan-2-one, toàn bộ tín hiệu của cacbon trong cấu trúc lồng bị dịch chuyển. Cấu trúc các chất được xác định dựa vào các dữ kiện phổ NMR kết hợp với so sánh với các hợp chất đã được công bố trong các tài liệu tham khảo. Kết quả đã phân lập và xác định cấu trúc 08 xanthone lồng, gồm acid gambogic (GH1), acid isogambogic (GH2), acid morellic (GH3), acid isomorellic (GH4), isomorellin (GH5), desoxymorellin (GH6), isomoreollin B (GH7) và acid 10α-butoxygambogic (GH8). Kết quả phân tích dữ kiện phổ của acid gambogic được trình bày dưới đây: 4.2.1. Hợp chất GH1: Acid gambogic Hợp chất GH1 được phân lập từ dịch chiết nhựa và thân cành cây G. hanburyi dưới dạng bột vô định hình màu 20 cam, góc quay cực [α] D = -578o (c 0,201; CHCl3). Phổ 1H, 13C NMR và HSQC của GH1 cho phép xác định các tín hiệu của 44 proton và 38 cacbon, trong đó có 1 nhóm -OH tại H 12,77; 8 nhóm methyl; 5 nhóm methylen; 6 nhóm -CH sp2; 2 nhóm methine; 3 cacbon cacbonyl; 10 Csp2 không chứa liên kết C-H, trong đó có 3 cacbon gắn với oxygen; 4 Csp3 bậc 3 gắn với oxygen. 29 30 HOOC HOOC 34 35 28 24 33 27 25 O O COSY 32 31 26 23 19 H 13 22 40 37 20 O O O 38 O 18 1716 O 14 O 36 2 D C B A 12 21 HMBC 39 3 5 7 9 11 H 4 6 8 10 H H O O H OH O H Hình 4.62. Cấu trúc hóa học và tương tác COSY, HMBC của hợp chất GH1 Hình 4.63. Phổ 1H NMR của hợp chất GH1 Hình 4.64. Phổ 13C NMR của hợp chất GH1 Các tương tác trên phổ COSY, HSQC và HMBC cho thấy GH1 có các mảnh cấu trúc gồm: ba nhóm prenyl, trong đó có một nhóm prenyl có chứa một nhóm COOH; một nối đôi CH=CH; một hệ spin CHsp2-CHsp3- CH2-CHsp3 (hình 4.62). Các dữ liệu này gợi ý GH1 có cấu trúc của một xanthone lồng polyprenyl thế. Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác của proton nối đôi tại H 5,38 (d; 10,0; H-3) và 6,60 (d; 10,0; H-4) với cacbon sp3 bậc 4 tại C 81,3 (C-2). Các tương tác HMBC giữa các proton methylen tại H 1,76 (1H; overlap; H-20); 1,59 (1H; m; H-20) và 2,01 (2H; m; H-36) với C-2 (C 81,3) giúp khẳng định phần cấu trúc liên quan đến vòng D của khung xanthone lồng. Các tương tác giữa proton olefin singlet ở trường thấp H 7,55 (1H; d; 7,0; H-10) với các cacbon gồm: 2 cacbon cacbonyl tại C 178,9 (C-8) và 203,3 (C-12); cacbon sp3 tại C 46,8 (C-11) và tương tác HMBC giữa proton tại H 2.51 (1H; d; 9,0; H-22) với (C-14) và (C-23) giúp làm sáng tỏ phần cấu trúc liên quan đến vòng A trong khung xanthone lồng. Tương tác HMBC giữa proton methylen của nhóm 3-carboxylbut-2-enyl tại H 2,95 (2H; d; 7,0; H-26) với các cacbon C-12, C-13, C-14 cho thấy vị trí của nhóm này trên khung xanthone lồng (hình 4.70). Điều này gợi ý cấu trúc hóa học của GH1 có thể là acid (Z)-4-((2R,11S,13R,14S,23S)-6-hydroxy-2,23,23-trimethyl-17-(3-
15 methylbut-2-en-1-yl)-2-(4-methylpent-3-en-1-yl)-8,12-dioxo-2,8,11,12,13,23-hexahydro-7H,4H-11,22- methanofuro[3,2-g]pyrano[3,2-b]xanthen-3a-yl)-2-methylbut-2-enoic (acid gambogic) phù hợp với công thức phân tử C38H44O8. Kết hợp phân tích các phổ COSY, HSQC và HMBC chúng tôi gán được các tín hiệu cacbon và proton còn lại. Kết quả phân tích phổ NMR và so sánh với dữ liệu phổ của GH1 với acid gambogic trong tài liệu tham khảo [36] được tóm tắt trong bảng 4.18 cho thấy dữ liệu phổ hoàn toàn trùng khớp. Do đó chúng tôi kết luận hợp chất GH1 chính là acid gambogic. 4.3. Kết quả tổng hợp dẫn xuất của GA 4.3.1. Kết quả khảo sát sự hồi phục phân tử ở trạng thái gương và trạng thái dung dịch siêu lạnh của acid gambogic vô định hình Trong số các dạng hình thái của hoạt chất, dạng vô định hình được quan tâm hơn dạng tinh thể vì khả năng tan tốt hơn trong nước và hoạt tính sinh học cao hơn. Dạng vô định hình của vật liệu được tạo ra bằng cách làm lạnh nhanh thuốc để tránh sự kết tinh sau khi làm nóng chảy nó ở nhiệt độ nóng chảy. Sự chuyển động phân tử trong các vật liệu vô định hình được đặc trưng bởi thời gian hồi phục cấu trúc α trong các trạng thái dung dịch siêu lạnh và trạng thái gương. Những vật liệu này có cấu trúc sắp xếp không theo trật tự và phụ thuộc vào nhiệt độ, ở nhiệt độ cao vật liệu vô định hình có tính chất giống như chất lỏng nhưng ở nhiệt độ thấp quá trình hồi phục phân tử diễn ra chậm hơn rất nhiều và các vật liệu này có tính chất giống chất rắn. Việc khảo sát sự hồi phục phân tử ở trạng thái gương và trạng thái dung dịch siêu lạnh của GA nhằm đánh giá tiềm năng ứng dụng làm thuốc của GA. Tính chất nhiệt của GA đã được khảo sát trên cơ sở phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) trong khoảng nhiệt độ từ 273-373 K với tốc độ tăng nhiệt là 10 K/phút. Kết quả đã xác định được nhiệt độ chuyển thủy tinh của GA là Tg = 338K (hình 4.87). Hình 4.87. Phổ DSC của a) GA mẫu ban đầu; b) GA sau khi được nung ở 373 K trong 3 phút Để khảo sát động học phân tử của GA vô định hình, tiến hành đo phổ điện môi bang thông rộng (BDS) trong khoảng tần số rộng từ 10-1 đến 106. Trong quá trình đo, nhiệt độ tăng từ 153 đến 333 K với tốc độ gia nhiệt 10 K/phút và từ 333 đến 411 K với tốc độ gia nhiệt 2 K/phút. Quang phổ điện môi băng thông rộng BDS của GA từ dạng dung dịch siêu lạnh và dạng thủy tinh được trình bày trong hình 4.88 dưới đây. Hình 4.88. Quang phổ điện môi băng thông rộng của GA ở nhiệt độ a) cao hơn nhiệt độ chuyển gương và b) thấp hơn nhiệt độ chuyển gương. Trên quang phổ điện môi băng thông rộng của GA ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ chuyển pha thủy tinh có thể quan sát thấy hai quá trình hồi phục phân tử thứ cấp β và γ kết hợp với chuyển động nội phân tử của GA. Trong
16 khi đó trên phổ BDS ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển thủy tinh xuất hiện đỉnh tương ứng với quá trình hồi phục cấu trúc α và độ dẫn điện dc. Các quá trình hồi phục phân tử của GA dịch về phía tần số cao hơn khi tăng nhiệt độ, cho thấy sự tăng mức độ chuyển động phân tử khi tăng nhiệt độ. Bằng việc kết hợp các dữ kiện thực nghiệm đo được trong phổ BDS, kết hợp với phương trình Vogel– Fulcher–Tammann (VFT) thu được nhiệt độ chuyển thủy tinh Tg = 333 K (xác định ở nhiệt độ mà thời gian hồi phục bằng 100 s). Kết quả này có sai lệch so với phương pháp DSC nhưng sai số này là bình thường và chấp nhận được. Kết quả tính toán lý thuyết trên cơ sở sự phụ thuộc của thời gian hồi phục cấu trúc dạng α vào nhiệt độ τα (T = 300 K) cũng cho biết GA có thể tồn tại ở trạng thái ổn định động học trong khoảng 2,31.109 ngày. Điều đó chứng tỏ GA khá bền và có thể lưu trữ ở nhiệt độ phòng. Ngoài ra, dựa vào phương trình VFT cũng tính được độ giòn vật liệu của GA là mp = 103 (các chất thông thường mp = 16-200 [199]). Khi độ giòn trong khoảng 16 đến 30, ví dụ như thủy tinh (SiO2) thì vật liệu được coi là rất cứng. Với độ giòn vật liệu lớn hơn 100, vật liệu được coi là rất giòn. Trong khoảng từ 30 đến 100, độ giòn vật liệu ở mức trung bình. Do đó, GA ở trạng thái dung dịch siêu lạnh có thể được xếp vào vật liệu giòn. Kết quả tính toán trên phần mềm ECNLE thu được nhiệt độ chuyển thủy tinh Tg = 338 K với tốc độ gia nhiệt 10 K/phút hoàn toàn phù hợp với thực nghiệm. Ngoài ra kết quả tính toán cũng cho thấy quá trình β có mối liên hệ chặt chẽ với sự hồi phục phân tử và hình thành từ động học của các phân tử riêng lẻ, quá trình này còn gọi là quá trình hồi phục Johari–Goldstein. Như vậy các tính chất về thời gian ổn định động học lớn và độ giòn vật liệu tương đối của GA cho thấy GA có thể đáp ứng được các yêu cầu về mặt vật lý của một hoạt chất có tiềm năng làm thuốc. Đây là cơ sở quan trọng để tiến hành các phản ứng tổng hợp dẫn xuất của GA nhằm thu được các dẫn xuất có hoạt tính cao có tiềm năng ứng dụng vào thực tế. 4.3.2. Định hướng nghiên cứu HOOC O O O O OH O Hình 4.89. Cấu trúc hóa học và tinh thể của GA Cấu trúc tinh thể của GA cho thấy cấu trúc hệ vòng xanthone nằm trên một mặt phẳng và có hai mặt trên và dưới khác nhau. Hai nhóm prenyl và vòng polycyclic nằm ở phía trên, tạo nên phía kỵ nước (hydrophobic face), còn nhóm acid cacboxylic và nhóm carbonyl của hệ vòng polycyclic nằm phía dưới tạo nên phía ưa nước (hydrophilic face) (hình 4.89). Các kết quả về việc chuyển hóa nhóm cacboxylic đã gợi ý rằng phía mặt phẳng hydrophilic không đóng vai trò quan trọng trong sự gắn kết với đích sinh học của nó. Nhóm cacboxyl -COOH có thể chuyển hóa về các dạng nhóm chức khác như ester, amide hay nhóm mang tính base khác mà không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính apoptosis [184]. Các nghiên cứu về hoạt tính-cấu trúc (SAR) của GA đã chỉ ra tầm quan trọng của nối đôi trên vòng D (liên hợp với nhóm C=O của vòng C) đối với hoạt tính [171]. Các dẫn xuất tạo ra từ sự chuyển hóa nhóm 6-OH (vòng B) như methyl hay acyl hóa có hoạt tính tương tự như chất đầu. Vì thế nhóm 6-OH này cũng không đóng vai trò quyết định đối với hoạt tính. Từ các kết quả phân tích SAR của GA nói trên, chúng tôi lựa chọn tổng hợp một số dẫn xuất của GA bằng cách chuyển hóa nhóm acid cacboxylic về dạng ester và amide với mục đích giữ nguyên các phần cấu trúc có hoạt tính của GA. Các phản ứng chuyển hóa sử dụng hệ xúc tác DCC/DMAP để hoạt hóa nhóm acid.
17 4.3.3. Kết quả tổng hợp các dẫn xuất Việc chuyển hoá nhóm COOH của GA được thực hiện theo sơ đồ hình 3.4. Cấu trúc của các sản phẩm và hiệu suất phản ứng được trình bày trong bảng 4.26. Bảng 4.26. Cấu trúc các sản phẩm và hiệu suất phản ứng Ký hiệu R Hiệu suất (%) Trạng thái vật lý Khối lượng (mg) Ghi chú GA1 -OCH3 91 Dầu, màu vàng 220 GA2 -OC2H5 75 Dầu, màu vàng 175 GA3 N 70 Dầu, màu vàng 250 Hợp chất mới GA4 N 84 Dầu, màu vàng 233 O GA5 N 79 Dầu, màu vàng 189 Hợp chất mới GA6 N N CF3 51 Dầu, màu vàng 140 Hợp chất mới F GA7 N N 68 Dầu, màu vàng 126 Hợp chất mới F GA8 N 15 Dầu, màu vàng 52 Hợp chất mới S H Kết quả chuyển hóa acid gambogic đã thu được 08 dẫn xuất, trong đó có 02 dẫn xuất ester là methyl gambogate (GA1), ethyl gambogate (GA2) và 06 dẫn xuất amide là N,N-diallylgambogamide (GA3), N- piperidinylgambogamide (GA4), N-morpholinegambogamide (GA5), 1(4-trifluoromethylbenzene- piperazinyl)gambogamide (GA6), 1-(2,5-difluorobenzyl)piperazinylgambogamide (GA7) và N-(2-thiophen-2- yl)ethylgambogamide (GA8). Trong đó 05 dẫn xuất N,N-diallylgambogamide (GA3), N-morpholinegambogamide (GA5), 1(4-trifluoromethylbenzene-piperazinyl)gambogamide (GA6), 1-(2,5- difluorobenzyl)piperazinylgambogamide (GA7) và N-(2-thiophen-2-yl)ethylgambogamide (GA8) là các hợp chất mới. Cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được xác định bằng phổ NMR một chiều và hai chiều. Các hợp chất sạch GA1-GA5 đã được đo phổ khổi phân giải cao. Kết quả phân tích dữ kiện phổ của hợp chất GA3 và GA5 được trình bày dưới đây: 4.3.3.1. Hợp chất GA3: N,N-diallyl gambogamide Trên phổ HRESIMS của hợp chất GA3 xuất hiện pic phân tử proton hóa [M+H]+ tại m/z 708,3883 (tính toán cho CTPT C44H54NO7 là 708,3900). Do đó, CTPT của hợp chất GA3 là C44H53NO7. Phổ 1H, 13C NMR và HSQC của GA3 cho thấy các tín hiệu proton và cacbon tương ứng với nhóm allyl tại δH 5,61 (2H; m)/ δC 133,6; 132,8 (2CH= allyl); δH 5,09-5,02 (4H; m)/ δC 117,6 (2CH2= allyl); δH 3,88 (2H; m)/ δC 45,5 (CH2 allyl); δH 3,71; 3,61 (2H; dd; 16,0; 5,5)/ δC 49,5 (CH2 allyl). Kết quả phân tích trên phổ COSY không cho thấy tương tác nào của các proton allyl với các proton của GA. 30 28 34 35 24 O 33 27 29 25 O 31 N 19 32 23 26 40 37 20 17 13 38 O 18 16 O 14 O 2 22 12 36 21 39 3 9 11 5 7 8 4 6 10 OH O Hình 4.96. Cấu trúc hóa học của hợp chất GA3
18 Độ chuyển dịch hóa học proton và cacbon của các vị trí khác trong khung chất của GA gần như không thay đổi. Tuy nhiên có một số thay đổi liên quan đến proton và cacbon ở vị trí 26, 27, 28. Cụ thể: tín hiệu proton H-26 bị tách thành hai pic tại δH 2,22 (1H; dd; 15,0; 6,0); 2,42 (1H; dd; 15,0; 7,0); tín hiệu proton H-26, -27 bị dịch về trường cao hơn so với GA (GH1: δH 2,95 (H-26), δH 6,09 (H-27); GA3: δH 2,42; 2,22 (H-26), δH 5,43 (H- 27)); tín hiệu cacbon C-27 (δC 122,3) dịch chuyển về phía trường cao hơn, trong khi C-28 (δC 133,9) bị dịch chuyển về trường thấp hơn (GH1: δC 137,8 (C-27), δC 127,8 (C-28); GA3: δC 122,3 (C-27), δC 133,8 (C-28)). Hình 4.97. Phổ 1H NMR của hợp chất GA3 Hình 4.98. Phổ 13C NMR của hợp chất GA3 Kết quả sự tách tín hiệu của H-26 và sự dịch chuyển tín hiệu proton H-26 và H-27 về phía trường cao hơn có thể được giải thích do sự chắn từ xa của nguyên tử N có mật độ electron lớn khi hai liên kết đôi liên hợp C=C và C=O tồn tại ở cấu dạng S-trans và do cấu trúc cồng kềnh của diallyl amine. Điều này có thể là do liên kết đôi C27=C28 có cấu hình cis như tài liệu [198]. Khi đó hai proton H-26 có thể nằm ở vị trí khác nhau trong không gian so với nguyên tử N nên chúng không còn là proton tương đương, kết quả cho hai tín hiệu trên phổ 1H NMR. Sự tách tín hiệu cũng xảy ra đối với ester ethyl gambogate nhưng không xảy ra với methyl gambogate. Kết quả sự dịch chuyển của C-27 và C-28 có thể giải thích do nguyên tử N có mật độ electron lớn, có thể gây hiệu ứng liên hợp với liên kết C=O làm cho sự liên hợp của hai liên kết đôi C27=C28 và C=O giảm. Sự biến đổi của các tín hiệu chỉ ra ở trên có thể coi là những tín hiệu đặc trưng chứng tỏ GA đã bị ester hóa hoặc amide hóa. Dựa vào kết quả phân tích phổ NMR và HRESIMS, chúng tôi xác định GA đã bị amide hóa, sản phẩm GA3 thu được là N,N-diallylgambogamide. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được tổng hợp. 4.3.3.2. Hợp chất GA5: N-morpholinyl gambogamide 30 28 34 35 24 O 33 27 29 25 O 31 N 19 32 23 26 40 37 20 17 13 38 O 18 16 O 14 O 36 2 22 12 O 21 39 3 9 11 5 7 8 4 6 10 OH O Hình 4.102. Cấu trúc hóa học của hợp chất GA5 Trên phổ HRESIMS của hợp chất GA5 xuất hiện pic phân tử proton hóa [M+H]+ tại m/z 698,6393 (tính toán lý thuyết cho CTPT C42H52NO8 là 698,3693). Do đó, CTPT của hợp chất GA5 là C42H51NO8. Trên phổ 1H NMR của GA5 ta thấy có xuất hiện thêm tín hiệu proton gắn với cacbon liên kết với oxygen hoặc nitrogen tại δH 3,62- 3,21 (8H; m; 4CH2 morpholine). Trên phổ 13C NMR của GA5 cũng xuất hiện thêm tín hiệu của hai cacbon sp3 liên kết với oxygen tại δC 67,2; 66,8 (2CH2-O morpholine) và hai cacbon sp3 liên kết với nitrogen tại δC 46,3 (CH2-N); 41,3 (CH2-N). Tương tự hai dẫn xuất amide GA3 và GA4, trên phổ của hợp chất GA5 cũng xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho sự amide hóa, đó là sự tách thành hai tín hiệu của proton H-26 tại δH 2,39 (1H; dd; 15,0; 6,0); 2,25 (1H; dd; 15,0; 7,0); đó là sự dịch chuyển về phía trường cao của cacbon C-27 và sự dịch về phía trường thấp của C-28 so với GA (δC 122,2 (C-27), δC 133,2 (C-28)).