Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Ảnh hưởng của CO2, nhiệt độ và nitrit lên sự cân bằng axít bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng (Monopterus albus Zuiew, 1793)

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm nghiên cứu được thực hiện nhằm cung cấp cơ sở khoa học về cơ chế điều hòa axít - bazơ trong máu lươn dưới tác động riêng lẻ và kết hợp của CO2, nhiệt độ và nitrit tăng cao. Ngoài ra, nghiên cứu cũng khảo sát sự thay đổi sinh lý của lươn đồng dưới những tác động của điều kiện sống như trên.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Ảnh hưởng của CO2, nhiệt độ và nitrit lên sự cân bằng axít bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng (Monopterus albus Zuiew, 1793)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã ngành: 62 62 03 01 PHAN VĨNH THỊNH ẢNH HƯỞNG CỦA CO2, NHIỆT ĐỘ VÀ NITRIT LÊN SỰ CÂN BẰNG AXÍT-BAZƠ VÀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ MÁU CỦA LƯƠN ĐỒNG (Monopterus albus Zuiew, 1793) Cần Thơ, 2019
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: Gs.Ts. Nguyễn Thanh Phương Người hướng dẫn phụ: Gs.Ts. Tobias Wang Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………….……………. Vào lúc: ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm ….. Phản biện 1: ………………………………………. Phản biện 2: ………………………………………. Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Phan Vinh Thinh, Nguyen Thanh Phuong, Colin J. Brauner, Do Thi Thanh Huong, Andrew T. Wood, Garfield T. Kwan, Justin L. Conner, Mark Bayley and Tobias Wang, 2018. Acid-base regulation in the air- breathing swamp eel (Monopterus albus) at different temperatures. Journal of Experimental Biology, 221 (10) jeb172551 2. Phan Vĩnh Thịnh, Đỗ Thị Thanh Hương, Mark Bayley, Tobias Wang và Nguyễn Thanh Phương, 2018. Ảnh hưởng của nồng độ CO2 cao trong nước lên cân bằng acid và base của lươn đồng, Monopterus albus (Zuiew, 1973). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 54(3B): 138-146. 3. Phan Vinh Thinh, Do Thi Thanh Huong, Le Thi Hong Gam, Christian Damsgaard, Nguyen Thanh Phuong, Mark Bayley and Tobias Wang, 2019. Renal acid excretion contributes to acid-base regulation during hypercapnia in air-exposed swamp eel (Monopterus albus). Journal of Experimental Biology: jeb.198259 doi: 10.1242/jeb.198259 Published 11 April 2019
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, biến đổi khí hậu (BĐKH) cũng như hiện tượng nóng lên toàn cầu đã và đang đe dọa đến các đồng bằng ven biển trên thế giới, ước tính mực nước biển sẽ dâng thêm từ 20 cm đến 45 cm vào năm 2030 và 2090 (Khang et al., 2008). Sự biến đổi này cũng làm gia tăng hàm lượng các khí độc vào môi trường như CO2, NO2, CH4 và tăng nhiệt độ 1-4°C trong thế kỷ tiếp theo (IPCC, 2013). Theo IPCC (2007) thì đồng bằng sông Cửu Long được dự đoán là một trong mười đồng bằng trên thế giới chịu ảnh hưởng nặng nhất của BĐKH. Vì thế, BĐKH ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển bền vững của ngành thủy sản Việt Nam, nhất là nuôi trồng thủy sản do động vật thuỷ sản là loài biến nhiệt nên nhiệt độ là yếu tố quan trọng gây ảnh hưởng trực tiếp và gián tiếp đến đời sống. Điều hòa pH hay cân bằng axít - bazơ trong máu của động vật là một cơ chế quan trọng giúp sinh vật thích nghi với những thay đổi của môi trường sống cũng như những thay đổi ngay bên trong cơ thể sinh vật. Đa số các loài động vật, bao gồm động vật sống dưới nước, pH ngoại bào của cơ thể sẽ giảm khi nhiệt độ cơ thể tăng lên (Truchot, 1987; Ultsch and Jackson, 1996; Stinner and Hartzler, 2000; Burton, 2002; Wang and Jackson, 2016). Bên cạnh sự thay đổi về nhiệt độ thì hàm lượng khí CO2 trong ao nuôi thủy sản cũng tăng cao do tác động của BĐKH và hiệu ứng nhà kính. Theo Boyd (1998) hàm lượng CO2 trong ao nuôi tăng cao gây ảnh hưởng đến đời sống động vật thủy sinh. Khi áp suất riêng phần của CO2 trong nước (PwCO2) lớn hơn PaCO2 cá sẽ kiềm hãm quá trình thải CO2 qua màng, làm tăng CO2 trong máu từ đó làm giảm khả năng hô hấp của cá và dẫn đến sự thay đổi mạnh các phản ứng sinh lý của cơ thể cá (Truchot, 1987). Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đối với loài thủy sản có cơ quan hô hấp phụ như nghiên cứu của Damsgaard et al. (2015), Gam et al. (2018) trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá thát lát (Chitala ornata) về ảnh hưởng của CO2 đối với việc điều chỉnh axít - bazơ đã cho thấy 2 loài này có khả năng điều chỉnh axít - bazơ cao hơn so với các loài hô hấp khí trời khác. Ngoài ra, khi nhiệt độ tăng cao thì cá cũng tăng cường trao đổi chất trong cơ thể và sự phân huỷ các hợp chất độc hại. Đặc biệt, nitrit là sản phẩm của chu trình nitơ, được hình thành từ ammonia trong điều kiện oxy hòa tan thấp là một chất độc được ghi nhận đối với động vật thủy sinh do làm giảm oxy trong máu qua hình thành methaemoglobin có màu nâu đỏ dẫn đến sự xáo trộn hô hấp, quá trình sinh lý và tăng trưởng. Tuy nhiên, những nghiên cứu về tác động của nitrit trong môi trường lên các đặc điểm sinh học cũng như khả năng điều hòa axít - bazơ của các loài cá hô hấp khí trời vùng nhiệt 1
đới vẫn còn rất ít. Cho đến nay, chỉ có vài nghiên cứu trên các loài cá có cơ quan hô hấp phụ như cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc (Channa striata) của Lefevre et al. (2011 và 2012) và cá thát lát (Chitala ornata) của Gam et al. (2017) đã ghi nhận được các kết quả tiêu biểu về khả năng chịu đựng nitrit cao trong việc giảm hấp thụ nitrit thông qua mang và các cơ chế khử nitơ hiệu quả. Lươn đồng (Monopterus albus) là cá hô hấp khí trời bắt buộc được nuôi phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Lươn đồng phân bố rộng rãi khu vực Đông Nam Á (Rosen and Greenwood, 1976). Môi trường sống của lươn thường ở những nơi nước tĩnh, thiếu oxy, nhiều các khí độc như CO2 và H2S (Graham, 1997). Mang lươn bị tiêu biến đáng kể và không có hiệu quả cao trong quá trình trao đổi chất của lươn. Thay vào đó, sự hấp thụ oxy xảy ra chủ yếu trên các biểu mô mạch máu trong khoang miệng và thực quản (Shih, 1940; Rainboth, 1996; Iversen et al., 2013; Damsgaard et al., 2014). Những nghiên cứu về phản ứng sinh lý của lươn với các điều kiện môi trường thay đổi vẫn còn rất ít, đặc biệt là nghiên cứu điều hòa axít - bazơ trong máu trước sự ảnh hưởng của nhiệt độ tăng, CO2 hay nitrit trong nước cao đến các loài cá nhiệt đới vẫn rất hạn chế. Chính vì thế, nghiên cứu tác động của nhiệt độ, CO 2 và nitrit lên lươn đồng cũng như tìm hiểu cơ chế thích nghi của lươn khi môi trường thay đổi rất cần thiết góp phần cho sự phát triển bền vững của ngành thủy sản. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án Nghiên cứu được thực hiện nhằm cung cấp cơ sở khoa học về cơ chế điều hòa axít - bazơ trong máu lươn dưới tác động riêng lẻ và kết hợp của CO2, nhiệt độ và nitrit tăng cao. Ngoài ra, nghiên cứu cũng khảo sát sự thay đổi sinh lý của lươn đồng dưới những tác động của điều kiện sống như trên. 1.3 Các nghiên cứu chính của luận án a) Khảo sát sự ảnh hưởng của CO2 cao lên sự điều hòa axít - bazơ trong máu và một số chỉ tiêu sinh lý máu của lươn (Monopterus albus) ở 2 kích cỡ. b) Ảnh hưởng của sự gia tăng nhiệt độ lên sự điều hòa axít - bazơ của lươn (Monopterus albus) ở 2 kích cỡ. c) Nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp của CO2 và nhiệt độ lên sự cân bằng axít-bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn (Monopterus albus) ở 2 kích cỡ. d) Nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp của CO2 và nitrit lên sự cân bằng axít - bazơ và chỉ tiêu sinh lý máu của lươn (Monopterus albus) ở 2 kích cỡ. 2
e) Nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp của nhiệt độ và nitrit lên sự cân bằng axít - bazơ và chỉ tiêu sinh lý máu của lươn (Monopterus albus) ở 2 kích cỡ. 1.4 Các đóng góp quan trọng và tính ứng dụng của luận án a) Xác định được vai trò quan trọng của thận trong quá trình điều hòa axít - bazơ của lươn. b) Chứng minh được lươn hoàn toàn có khả năng sống trong điều kiện không khí ẩm tương tự loài lưỡng cư. c) Xác định được cơ chế điều hòa axít - bazơ của lươn hoàn toàn giống với cơ chế của các loài bò sát, lưỡng cư khi bị ảnh hưởng của nhiệt độ. d) Lươn là loài cá hô hấp khí trời thứ hai được xác định có khả năng điều hòa axít - bazơ và phục hồi pH rất tốt trong điều kiện CO2 cao cũng như khi nitrit cao và nhiệt độ cao. CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 09/2014 đến tháng 12/2017 tại Bộ môn Dinh dưỡng và Chế biến Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ (Việt Nam) và Khoa Sinh học, Trường Đại học Aarhus (Đan Mạch). Sử dụng nước máy đã khử Clorine cho toàn bộ các thí nghiệm của nghiên cứu. Trong suốt thí nghiệm, chất lượng nước luôn được duy trì ổn định trong giới hạn tốt nhất trong suốt thời gian thí nghiệm giúp nâng cao hiệu quả của các thí nghiệm. Nhiệt độ nước trung bình 27-29°C, pH nước dao động: 7,7-7,8; oxy hòa tan 90%, CO2 hòa tan
Khảo sát được thực hiện tại 9 bể nuôi lươn đồng với mô hình nuôi có giá thể (vĩ tre), sử dụng thức ăn tươi sống trong suốt thời gian nuôi. Lươn đồng được nuôi với mật độ 250 con/m 2 trong bể có diện tích 8-10 m2/bể và được thay nước hằng ngày vào buổi sáng (40-50%). Các yếu tố môi trường được đo dựa theo thời gian nuôi lần lượt là đầu vụ (1 tháng sau thả giống), giữa vụ (4-5 tháng sau thả giống) và cuối vụ (chuẩn bị thu hoạch - 9 tháng sau thả giống); mỗi thời điểm chọn 3 bể khác nhau. Các chỉ số môi trường và thu mẫu nước được thực hiện mỗi 3 giờ và liên tục trong 24 giờ. Mẫu nước được thu giữa bể và trữ lạnh để phân tích các chỉ tiêu NO2 và H2S tại phòng thí nghiệm; các chỉ tiêu pH, nhiệt độ, PwCO2 (áp suất riêng phần CO2 trong nước) được đo trực tiếp bằng máy OxyGuard Pacific Box, máy YSI để đo oxy hoà tan và nhiệt kế để đo nhiệt độ nước. 2.3.2 Nội dung 1: Ảnh hưởng của CO2 lên sự cân bằng axít - bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng a. Thí nghiệm 1: Xác định khả năng đệm non-bicarbonate (βNB) trong máu trong điều kiện in vitro Mẫu máu (khoảng 10 mL) được lấy trực tiếp thông qua ống thông động mạch của 6 con lươn đồng lớn. Sau đó, máu được ly tâm nhẹ với tốc độ 600 rpm trong 3 phút ở 27°C nhằm mục đích tách máu thành hai phần, phần lắng bên dưới là máu với hematocrit cao (trên 60%) và phần nổi bên trên với giá trị hematocrit thấp (30%). Mỗi phần máu được cho vào các bình cầu Eschweiler lắc nhẹ trong suốt thời gian thí nghiệm. Sử dụng hệ thống máy Wösthoff (Bochum, Đức) để bổ sung vào máu lần lượt 7, 15 và 30 mmHg CO2 trong ít nhất 30 phút cho mỗi mức CO2. Tại mỗi mức CO2, máu được lấy ra để đo tổng nồng độ CO2 (TCO2) của huyết tương, pH máu và Hct. Đối với mỗi mẫu máu, βNB được tính toán từ mối quan hệ tuyến tính giữa HCO3- và pH, và đánh giá ảnh hưởng của Hct lên mối quan hệ tuyến tính giữa βNB và Hct. b. Thí nghiệm 2a: Ảnh hưởng của CO2 lên sự cân bằng axít - bazơ của lươn đồng lớn. - Bố trí thí nghiệm: lươn thí nghiệm có kích cỡ lớn (250-350 g/con). Lươn đồng được đặt ống dẫn lưu động mạch và đặt ống thông tiểu. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 6 lươn đồng (6 lần lặp lại) và được bố trí vào hệ thống bể nhỏ sử dụng máy điểu chỉnh CO 2 (Wösthoff, Bochum, Germany). Hệ thống máy Wösthoff có cơ chế điều chỉnh đúng áp suất CO2 mong muốn cho từng nghiệm thức theo thí nghiệm. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện 27°C, oxy hòa tan >90%. Lươn đồng được bố trí riêng biệt từng bể. Các nghiệm thức được bố trí như sau: Nghiệm thức 1: 0,1 mmHg CO2 trong nước 4
Nghiệm thức 2: 0,1 mmHg CO2 trong không khí Nghiệm thức 3: 30 mmHg CO2 trong nước Nghiệm thức 4: 30 mmHg CO2 trong không khí (Áp suất riêng phần CO2 trong nước ở 27°C là 30 mmHg tương đương với 4% CO2 hòa tan trong nước và cũng tương đương nồng độ CO2 là 49,8 mg/L được đo bằng máy Oxyguard Pacific, Đan Mạch). - Phương pháp thu mẫu và chỉ tiêu phân tích: Máu lươn đồng được lấy thông qua ống dẫn lưu tại các thời điểm: 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Mẫu máu được dùng đo các chỉ tiêu như pH, PaCO2 (áp suất riêng phần CO2 trong máu cá) và Hb, Hct. Huyết tương dùng để đo hàm lượng HCO3-Na+, K+, Cl- và áp suất thẩm thấu. Nước tiểu lươn đồng được phân tích các chỉ tiêu gồm pH, tổng CO2, TAN, Na+, K+, Cl-. c. Thí nghiệm 2b: Ảnh hưởng của CO2 lên chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng nhỏ - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần tương ứng với 3 bể. Lươn đồng được bố trí mật độ 50 con/bể. Căn cứ vào hàm lượng CO 2 khảo sát từ bể nuôi ngoài thực tế (14 mmHg CO2 cho lươn nhỏ và 30 mmHg CO2 cho lươn lớn) để chọn hàm lượng CO2 cho thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí gồm 3 nghiệm thức: Nghiệm thức 1: 0,1 mmHg CO2 trong nước (đối chứng) Nghiệm thức 2: 14 mmHg CO2 trong nước Nghiệm thức 3: 30 mmHg CO2 trong nước Thí nghiệm được bố trí trong hệ thống bể tuần hoàn nước và sử dụng máy Oxyguard Pacific (Đan Mạch) để điều chỉnh hàm lượng CO 2 theo các nghiệm thức của thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện 27°C, pH nước ban đầu 7,7-7,8 và oxy hòa tan >90%. - Phương pháp thu mẫu và chỉ tiêu phân tích: Máu lươn đồng nhỏ được thu trực tiếp từ động mạch đuôi tại các thời điểm 0 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Mỗi bể thu 6 lươn đồng. Máu được phân tích nhanh các chỉ tiêu là pH, pCO2, Hb và Hct và xác định số lượng tế bào hồng cầu, bạch cầu. Huyết tương được đo các chỉ tiêu: HCO3-, ion Na+, K+, Cl- và áp suất thẩm thấu. 3.3.3 Nội dung 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự cân bằng axít - bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng 5
a. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng cấp tính của nhiệt độ lên giá trị pH ngoại bào của lươn đồng lớn - Bố trí thí nghiệm: chọn 8 lươn đồng (tương ứng với 8 lần lặp lại) đã được phục hồi sau đặt ống dẫn lưu động mạch vào từng bể riêng biệt. Ở mỗi bể được tiến hành nâng nhiệt độ dần từ 20 đến 25, 25 đến 30 và từ 30 đến 35°C. Mỗi mức nhiệt độ được giữ trong 48 giờ sau đó nâng lên mức nhiệt độ kế tiếp. Lươn đồng được lấy máu sau mỗi 24 và 48 giờ ở từng mức nhiệt độ. Thí nghiệm sử dụng hearter giúp nâng nhiệt độ nước đúng mức mong muốn và hệ thống cảm biến nhiệt độ tự ngắt giúp duy trì ổn định đúng mức nhiệt độ. Nhiệt độ được tăng 1°C/1 giờ cho tất cả các mức nhiệt độ. - Các chỉ tiêu phân tích: mẫu máu được phân tích pH, PaCO2, Hb và Hct. Huyết tương được phân tích các chỉ tiêu HCO3-, ion Na+, K+ Cl- và áp suất thẩm thấu. b. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ ảnh hưởng lên pH nội bào của lươn đồng Giá trị pH nội bào của lươn đồng được xác định ở 3 vị trí là gan, tim và cơ. Lươn đồng được bố trí riêng lẻ vào từng bể, mỗi bể được nâng nhiệt lên từng mức nhiệt độ khác nhau (20, 25, 30 và 35°C). Mỗi mức nhiệt độ có 8 lươn đồng (tương ứng 8 lần lặp lại) được giữ trong 24 giờ trước khi tiến hành thu mẫu. Cách nâng nhiệt độ và duy trì nhiệt độ được thực hiện tương tự thí nghiệm mục 2.3.3.2.a. Lươn đồng được làm chết nhanh bằng cách hủy tủy trên đỉnh đầu và lấy mẫu trong 2-4 phút sau khi lươn đồng chết. Tất cả mẫu mô được giữ trong giấy bạc và bảo quản trong N2 lỏng trước khi được giữ trong điều kiện -80°C để phân tích c. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng nhỏ - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức là 1 mức nhiệt độ, được lặp lại 3 lần, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Lươn đồng có kích cỡ 30 g/con, được nuôi với mật độ 50 con/bể trong bể có 30L nước. Cách nâng nhiệt độ và duy trì nhiệt độ được thực hiện tương tự thí nghiệm mục 3.3.3.2.a Nghiệm thức 1: đối chứng (27-28ºC) Nghiệm thức 2: 30ºC Nghiệm thức 3: 33ºC Nghiệm thức 4: 36ºC -Các chỉ tiêu phân tích: 6
Máu lươn đồng được thu trực tiếp từ đuôi tại các thời 0 giờ, 1 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày. Mỗi bể thu 3 lươn đồng. Máu được phân tích nhanh các chỉ tiêu là pH, pCO2, Hb và Hct và xác định số lượng tế bào hồng cầu, bạch cầu. Huyết tương được đo các chỉ tiêu như HCO3-, ion Na+, K+, Cl- và áp suất thẩm thấu. 2.3.4 Nội dung 3: Ảnh hưởng kết hợp của CO 2 và nhiệt độ lên sự cân bằng axít - bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng a. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng kết hợp của CO 2 và nhiệt độ lên sự cân bằng axít - bazơ của lươn đồng lớn - Bố trí thí nghiệm: sử dụng 6 lươn đồng lớn (250-350 g/con) (tương ứng với 6 lần lặp lại) đã phục hồi sau khi đút ống dẫn lưu động mạch, mỗi lươn đồng được bố trí vào mỗi bể riêng biệt. Hàm lượng CO2 được đưa vào các bể qua hệ thống máy điểu chỉnh CO2 (Wösthoff, Bochum, Germany) sau khi các bể lươn đồng đạt được nhiệt độ mong muốn (nhiệt độ thí nghiệm). Nhiệt độ được nâng lên và duy trì đúng mức tương tự thí nghiệm mục 3.3.3.2.a. Thí nghiệm gồm 6 nghiệm: (1) 0 mmHg CO2 ở 25°C, (2) 7 mmHg CO2 ở 25°C, (3) 14 mmHg CO2 ở 25°C, (4) 0 mmHg CO2 ở 35°C, (5) 7 mmHg CO2 ở 35°C và (6) 14 mmHg CO2 ở 35°C. - Cách lấy máu: máu lươn đồng được lấy thông qua ống dẫn lưu động mạch tại các thời điểm thu mẫu 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thời điểm 0 giờ được tính khi các bể lươn đồng đã đạt được các mức nhiệt độ mong muốn. Mẫu máu được phân tích pH, PaCO2, Hb và Hct. Huyết tương được phân tích các chỉ tiêu HCO3-, ion Na+, K+ Cl- và áp suất thẩm thấu. b. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của CO2 và nhiệt độ lên sự cân bằng axít-bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng nhỏ - Bố trí thí nghiệm: lươn đồng nhỏ (30 g/con) được bố trí mật độ 50 con/bể trong 30 L nước gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Cách nâng nhiệt độ và duy trì nhiệt độ được thực hiện tương tự thí nghiệm mục 3.3.3.2.a. Các nghiệm thức gồm: (1) 7 mmHg CO2 ở 25°C, (2) 7 mmHg CO2 ở 35°C, (3) 14 mmHg CO2 ở 25°C, và (4) 14 mmHg CO2 ở 35°C. - Cách thu mẫu: thu mẫu máu lươn đồng trực tiếp từ động mạch đuôi tại các thời điểm 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thời điểm 0 giờ được tính khi các bể lươn đồng đã đạt được các mức nhiệt độ mong muốn. Mỗi lần thu 3 con/bể. Máu được phân tích nhanh các chỉ tiêu là pH, pCO2, Hb và Hct và xác định số lượng tế bào hồng cầu, bạch cầu. Huyết tương được đo các chỉ tiêu: HCO3-, ion Na+, K+, Cl- và áp suất thẩm thấu. 7
2.3.5 Nội dung 4: Ảnh hưởng kết hợp của CO2 và nitrit lên sự cân bằng axít - bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng a. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng CO2 và nitrit lên sự cân bằng axít - bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng lớn - Bố trí thí nghiệm: lươn đồng lớn (250-350 g/con) đã phục hồi sau đút ống lưu dẫn động mạch. Nồng độ nitrit sử dụng là giá trị LC 5 96 giờ = 23,57 mM của lươn đồng đã được báo cáo bởi Huong et al. (2014). Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 6 lần. Các nghiệm thức gồm: Nghiệm thức 1: 0 mmHg CO2 + 0 mM NO2- (đối chứng) Nghiệm thức 2: 30 mmHg CO2 Nghiệm thức 3: 23,57 mM NO2- Nghiệm thức 4: 30 mmHg CO2 + 23,57 mM NO2- - Cách lấy máu: máu lươn đồng được lấy thông qua ống dẫn lưu động mạch tại các thời điểm thu mẫu 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ. Mẫu máu được phân tích pH, PaCO2, metHb, Hb và Hct. Huyết tương được phân tích các chỉ tiêu HCO3-, ion Na+, K+, Cl- và áp suất thẩm thấu. Thí nghiệm sử dụng hệ thống trộn khí CO2 của máy điểu chỉnh Wösthoff, (Bochum, Germany) tương tự 2 thí nghiệm về CO2 bên trên. Sử dụng muối NaNO2 để bổ sung nitrit vào các nghiệm thức. b. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng CO2 và nitrit lên sự cân bằng axít - bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng nhỏ - Bố trí thí nghiệm: lươn đồng nhỏ (30 g/con) được bố trí mật độ 50 con/bể trong bể 30 L nước gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 3 bể tương ứng với 3 lần lặp lại. Sử dung máy đo Oxyguard Pacific (Oxyguard International A / S, Farum, Đan Mạch) để điều chỉnh đúng lượng CO2 vào các nghiệm thức, nitrit được bổ sung tương tự thí nghiệm mục 3.3.5.2a. Các nghiệm thức gồm: Nghiệm thức 1: 0 mmHg CO2 + 0 mM NO2- (Đối chứng) Nghiệm thức 2: 14 mmHg CO2 Nghiệm thức 3: 23,57 mM NO2- Nghiệm thức 4: 14 mmHg CO2 + 23,57 mM NO2- Nghiệm thức 5: 30 mmHg CO2 + 23,57 mM NO2- - Cách thu mẫu: máu lươn đồng trực tiếp từ động mạch đuôi tại các thời điểm 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ. Mỗi lần thu 3 con/bể. 8
Máu được phân tích nhanh các chỉ tiêu là pH, pCO2, met Hb, Hb và Hct và xác định số lượng tế bào hồng cầu, bạch cầu. Huyết tương được đo các chỉ tiêu: HCO3-, ion Na+, K+, Cl- và áp suất thẩm thấu. 2.3.6 Nội dung 5: Ảnh hưởng kết hợp của nhiệt độ và nitrit lên sự cân bằng axít-bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng. a. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nhiệt độ và nitrit lên sự cân bằng axít - bazơ và các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng lớn - Đối tượng: 6 lươn đồng lớn (250-350 g/con) đã phục hồi sau khi đút ống dẫn lưu động mạch tương ứng với 6 lần lặp lại. - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí và thu mẫu tương tự thí nghiệm về nhiệt độ trên lươn lớn của mục 3.3.3.1a. Hàm lượng NO 2- được bổ sung vào đầu thí nghiệm (20°C) và duy trì đúng nồng độ nitrit thí nghiệm là 23,57 mM trong suốt thí nghiệm. Cách nâng nhiệt độ và duy trì nhiệt độ được thực hiện tương tự thí nghiệm mục 3.3.3.2.a và nitrit được bổ sung tương tự thí nghiệm mục 3.3.5.2a - Cách lấy máu: máu lươn đồng được lấy sau mỗi 24 giờ và 48 giờ ở từng mức nhiệt độ. Mẫu máu được phân tích pH, PaCO2, Hb và Hct. Huyết tương được phân tích các chỉ tiêu HCO3-, ion Na+, K+ Cl- và áp suất thẩm thấu. b. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nhiệt độ và nitrit lên các chỉ tiêu sinh lý máu của lươn đồng nhỏ - Bố trí thí nghiệm: lươn đồng nhỏ (30 g/con) được bố trí mật độ 50 con/bể trong 30 L nước gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 3 bể tương ứng với 3 lần lặp lại. Cách nâng nhiệt độ và duy trì nhiệt độ được thực hiện tương tự thí nghiệm mục 3.3.3.2.a và nitrit được bổ sung tương tự thí nghiệm mục 3.3.5.2a Các nghiệm thức gồm: Nghiệm thức 2: 23,57 mM NO2- ở 27°C Nghiệm thức 4: 23,57 mM NO2- ở 33°C Nghiệm thức 5: 23,57 mM NO2- ở 36°C - Cách thu mẫu: máu lươn được lấy trực tiếp từ đuôi tại các thời điểm 0 giờ, ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 4 và ngày 7. Mỗi lần thu 3 con/bể. Máu được phân tích nhanh các chỉ tiêu là pH, pCO2, met Hb, Hb và Hct và xác định số lượng tế bào hồng cầu, bạch cầu. Huyết tương được đo các chỉ tiêu: HCO3-, ion Na+, K+, Cl- và áp suất thẩm thấu. 2.4 Phương pháp phân tích 2.4.1 Phương pháp đút ống trực tiếp vào động mạch của lươn đồng Lươn đồng (250-350 g/con) được gây mê trong nước có benzocaine (Merck, Germany) với nồng độ 225 mg/L trong 20 phút trước khi tiến hành phẫu thuật đặt ống thông mạch máu (PE 40) đã chứa dung dịch 9
heparin vào động mạch thông qua lỗ nhỏ vừa tạo. Lươn đồng sau khi đặt ống được đưa vào các bể chứa nước sạch có sụt khí để phục hồi trong vòng 24 giờ trước khi bắt đầu thí nghiệm. Ống thông tiểu của lươn được đặt vào bàng quang của lươn qua lỗ hậu môn. Sau khi thấy nước tiểu chảy vào ống thông tiểu, tiến hành cố định ống thông tiểu bằng các mũi khâu và nước tiểu lươn được chứa trong ống nhựa (10 mL). 2.4.2 Các chỉ tiêu pH, pCO2 và HCO3- trong máu Giá trị pH và pCO2 trong máu được đo trực tiếp bằng máy đo khí máu cầm tay iStat (Abbott) và được tính đền bù nhiệt độ bằng thân nhiệt của lươn theo Matle el al. (2014). Hàm lượng HCO3 trong huyết tương được đo theo phương pháp Cameron (1971). 2.4.3 Các chỉ tiêu huyết học Hồng cầu trong máu cá được nhuộm bằng dung dịch Natt - Herrick theo phương pháp của Natt and Herrick (1952) bằng buồng đếm hồng cầu. Mẫu máu được cố định trên lame và được nhuộm bằng dung dịch Wright & Giemsa để xác định tổng bạch cầu theo phương pháp của Humason (1979). Hàm lượng Hb đo bằng cách pha loãng 20 µL máu cá được pha loãng với 4 mL thuốc thử Drabkin trong cuvet. Dùng máy đo quang phổ đo mức độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch ở bước sóng 540 nm. Tỷ lệ metHb được xác định bằng dung dịch phosphate buffer 0,02 M- pH 7,3 ở bước sóng 480-700 nm theo phương pháp của Lefevre et al. (2011). Máu cũng được cho vào ống thủy tinh (hematocrit tube) để đo tỉ lệ huyết sắc tố (Larsen and Snieszko, 1961). 2.4.4 Phương pháp phân tích các ion Hàm lượng ion Na+ và K+ trong huyết tương được đo theo phương pháp quang kế ngọn lửa bằng máy Sherwood Model 420, Sherwood Scientific Ltd., Cambridge, UK20. Ion Cl- được đo bằng máy Sherwood model 926S MK II Chloride analyzer qua phương pháp đo chuẩn độ Cloride. Và áp suất thẩm thấu được đo bằng máy đo Fiske one-ten osmometer (Fiske® Associates, Two Technology Way, Norwood, Massachusetts, USA). 2.4.5 Phương pháp đo và phân tích các chỉ tiêu môi trường Nhiệt độ và pH: được đo bằng máy đo cầm tay Mettler-Toledo (AG 8603 Schwerzenbach, Thụy Sĩ). Áp suất riêng phần oxy trong nước (PwO2 ): được đo bằng thiết bị cầm tay YSI 556 (YSI, Ohio, USA). 10
Áp suất riêng phần CO2 trong nước (PwCO2 ): đo bằng máy đo Oxyguard Pacific (Oxyguard International A / S, Farum, Đan Mạch). Hàm lượng [NO2-] trong nước: các mẫu nước ở mỗi vị trí lấy mẫu được chứa trong chai thủy tinh và được bảo quản trong nước đá, sau đó được vận chuyển về Khoa Thủy sản để đo trong ngày. Nitrit được đo quang phổ ở 540 nm (Varian Cary 50 Spectrophotometer, Varian Inc.) sử dụng phản ứng Griess (Lefevre et al., 2011). Hàm lượng H2S trong nước: tương tự các lấy mẫu nước đo nitrit, mẫu nước được chứa trong chai thủy tinh nâu có nút và được bảo quản trong nước đá, sử dụng phương pháp 4500 – S2- D. Methylene Blue (APHA et al., 1995). 2.4.6 Phương pháp đo pH nội bào Gan, tim và cơ lươn đồng được nghiền mịn trong dung dịch nitơ lỏng và đo theo phương pháp của Portner et al., 1990; Brauner et al., 2004; Baker et al., 2009). 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được nhập, tính toán trung bình và độ lệch chuẩn bằng phần mềm Microsoft Excel 2013. So sánh thống kê sự khác biệt giữa các nghiệm thức trong cùng một thời điểm thu mẫu và giữa các lần thu mẫu trong cũng một nghiệm thức bằng one-way ANOVA với phép thử DUNCAN. Biểu đồ và biểu bảng được thực hiện bằng phần mềm SigmaPlot 12.5. Luận án được trình bày bằng phần mềm Microsoft Word 2013. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát môi trường nước nuôi lươn đồng theo mô hình nuôi bằng giá thể nilon với các kích cỡ lươn khác nhau Sự biến động về nhiệt độ giữa ngày và đêm không lớn, dao động trong khoảng 26-28°C. Hàm lượng oxy trong các bể nuôi tương đối thấp, thấp nhất vào 7 giờ sáng với áp suất riêng phần O2 (PO2) trung bình là 3,1±0,9 mmHg, 2,5±0,3 mmHg và 10,2±6,4 mmHg tương ứng thời điểm đầu, giữa và cuối vụ nuôi. Áp suất riêng phần của oxy trong nước cao nhất lúc 10 giờ sáng (cao hơn 10 lần so với các khoảng thời gian khác trong ngày) và cao nhất là bể nuôi đầu vụ (PO 2=33,8 mmHg) . Ngược với oxy, áp suất CO2 trong nước (PwCO2) của các bể nuôi cao nhất vào lúc 7 giờ sáng là 9,9-10,7 mmHg CO2 vào đầu và giữa vụ. Áp suất CO2 trong nước giảm dần và đạt thấp nhất lúc 10 giờ trưa (2,1 và 3,4 mmHg CO2 vào giai đoạn đầu và giữa vụ nuôi). Tuy nhiên, ở giai đoạn cuối vụ nuôi thì PwCO2 biến động không đáng kể giữa các mốc 11
thời gian trong ngày, khoảng 26-27 mmHg CO2. Giá trị pH nước thấp nhất là 7,1 lúc 7 giờ sáng và cao nhất lúc 10 giờ sáng ở cả 3 giai đoạn nuôi là 7,45. Mặt khác, pH nước ở các bể cuối vụ (6,9-7) thấp hơn so với giai đoạn đầu và giữa vụ. Ngoài ra, hàm lượng H2S dao động trong khoảng 0,001 đến 0,003 mg/L ở tất cả các giai đoạn nuôi. Hàm lượng NO2- cao nhất ở các bể nuôi cuối vụ, cao nhất lúc sáng sớm (0,281±0,012 mg/L). 3.2 Ảnh hưởng của điều kiện CO2 môi trường cao lên sự cân bằng axít-bazơ của lươn đồng 3.2.1 Ảnh hưởng của CO2 cao lên điều hòa axít - bazơ trong máu lươn đồng Hình 3.1: Giá trị pH (A), PaCO2 (B) và nồng độ HCO3- (mM) (C) trong máu động mạch của lươn đồng tiếp xúc với 30 mmHg CO2. Dấu (*) cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa so với 0 giờ trong cùng nghiệm thức (p
độ Hb thay đổi từ 11,2 còn 8,8 mM trong 72 giờ và Hct giảm từ 52% xuống 38%. Nồng độ ion Cl- trong huyết tương giảm đều từ khoảng 112 mM ở 0 giờ đến 96 và 97 mM ở hai nghiệm thức 30 mmHg CO2 trong không khí trong nước. Theo cùng xu hướng, nồng độ Na + trong huyết tương giảm trong 72 giờ ở thí nghiệm này. Ngoài ra, ion K+ huyết tương lại tăng nhẹ từ 2,0 lên 3,2 mM. 3.2.3 Ảnh hưởng của CO2 môi trường cao lên sự bài tiết axít Hình 3.2: Một số chỉ tiêu trong nước tiểu: lượng nước tiểu (A), pH nước tiểu (B), TAN (C), [HCO3-], tổng axít bài tiết (D), chuẩn độ a-xít (E) và tổng proton H+ đào thải (F) trong nước tiểu của lươn đồng tiếp xúc với 30 mmHg CO2 trong 72 giờ. Dấu (*) cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa so với 0 giờ trong cùng nghiệm thức (p
khoảng 5 lần (p
lúc 72 giờ là 13,77 mM, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng và thời điểm 0 giờ (p0,05). Bên cạnh, hàm lượng K+ tăng cao nhất sau 72 giờ tiếp xúc và cao nhất là 3,35 mM ở nghiệm thức 30 mmHg CO2, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với 2 nghiệm thức còn lại (p0,05) và Hct tăng cao nhất sau 72 giờ thí nghiệm (>50%). 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự điều hòa axít - bazơ của lươn đồng 3.3.1 Ảnh hưởng cấp tính của nhiệt độ lên quá trình điều hòa axít - bazơ của lươn lớn Sự gia tăng nhiệt độ là nguyên nhân làm pHa giảm mạnh và tuyến tính với độ dốc là 0,025±0,001 và 0,028±0,001 đơn vị/°C sau 24 và 48 giờ, độ dốc giữa 2 lần khác biệt không ý nghĩa (p>0,05) (Hình 3.4). Ngoài ra, PaCO2 tăng dần từ 10,1 mmHg ở 20°C lên 19,1 mmHg ở 35°C (p0,05) trong suốt thời gian nâng nhiệt độ. 15
Hình 3.4: Giá trị pH ngoại bào (A), PaCO2 (B) và nồng độ HCO3- (C) của lươn đồng ở các mức nhiệt độ 20-25-30-35°C. Các giá trị có chữ cái giống nhau (a, b, c) thì khác biệt không ý nghĩa (p>0,05). 3.3.2 Ảnh hưởng cấp tính của nhiệt độ lên sự điều hòa pH nội bào của lươn đồng Sự gia tăng nhiệt độ cũng là nguyên nhân đầu tiền làm thay đổi pH nội bào của lươn đồng được thể hiện trong. Ở tim, pH nội bào chỉ giảm nhẹ từ 7,45 ở 20°C đến 7,36 ở 30°C (p>0.05) và giảm mạnh còn 7,32 ở 35°C (p
Số lượng các tế bào hồng cầu và bạch cầu trong máu lươn đồng tăng đáng kể ở các nghiệm thức 33 và 36°C, khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (p