Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

7
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài "Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương" là xây dựng chế độ chiết xuất phyoestrogen từ bột phôi đậu tương và làm giàu các phytoestrogen dạng aglycone; chứng minh bằng thực nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của phytoestrogen; thử nghiệm hoạt tính phytoestrogen in vivo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Lê Minh Châu NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM PHYTOESTROGEN TỪ PHÔI ĐẬU TƯƠNG Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023
Công trình được hoàn thành tại: Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên PGS.TS Hồ Phú Hà Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Đại học Bách Khoa Hà Nội họp tại Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ……… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu - ĐHBK Hà Nội 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Phytoestrogen có nhiều lợi ích với sức khỏe con người, đặc biệt là phụ nữ và phụ nữ mãn kinh: phòng chống ung thư, làm giảm cholesterol và các bệnh tim mạch, phòng chống các triệu chứng bất lợi ở tuổi mãn kinh, tăng cường khả năng nhận thức. Các phytoestrogen có mặt trong các bộ phận khác nhau của cây đậu tương như hạt, lá mầm, thân, rễ. Theo các nghiên cứu gần đây đã công bố, so sánh giữa các thành phần cấu tạo hạt đậu tương gồm vỏ hạt, phôi hạt và phần nội nhũ thì phôi hạt có hàm lượng phytoestrogen cao nhất. Các nghiên cứu về nhóm hợp chất phytoestrogen trong phôi đậu tương công bố trên thế giới chủ yếu tập trung vào 6 hợp chất gồm nhóm aglycone và β-glucoside trong khi các tài liệu đã công bố về đủ 12 thành phần phytoestrogen trong phôi hạt chưa nhiều. Kết quả khảo sát 12 thành phần phytoestrogen các bộ phận hạt đậu tương trên các giống đậu tương Hàn Quốc, Pháp cho thấy phôi hạt đậu tương có hàm lượng phytoestrogen cao nhất, gấp 5-6 lần so với toàn hạt và cao hơn nhiều lần so với vỏ hạt và lá mầm. Tại Việt Nam chưa có báo cáo nào về 12 thành phần phytoestrogen trong phôi hạt, do vậy chưa có cái nhìn tổng quát về nhóm hợp chất này. Do đó, chúng tôi đã tiến hành với đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương”. Đề tài này được định hướng sẽ nghiên cứu, phân tích đầy đủ 3 thành phần hoạt chất chính và 9 dẫn chất ở dạng glucoside từ đó định lượng chính xác hàm lượng phytoestrogen tổng số, xây dựng phương án chiết xuất tối ưu, nâng cao hiệu suất thu nhận phytoestrogen dạng aglycone, thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của phytoestrogen chiết xuất từ phôi đậu tương. 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng chế độ chiết xuất phyoestrogen từ bột phôi đậu tương và làm giàu các phytoestrogen dạng aglycone - Chứng minh bằng thực nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của phytoestrogen - Thử nghiệm hoạt tính phytoestrogen in vivo. 1
2.2. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá và xử lý nguyên liệu: Đánh giá hàm lượng tạp trong phôi đậu tương ban đầu, xác định các đặc tính của bột phôi đậu tương và bột phôi đậu tương đã loại lipid. - Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất phytoestrogen tổng; Tối ưu hóa chế độ chiết xuất phytoestrogen tổng. - Thu nhận phytoestrogen aglycone: Khảo sát chế độ thủy phân phytoestrogen glucoside thành aglycone bằng enzyme β- glucosidase, cellulase; Tinh sạch phytoestrogen aglycone - Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phytoestrogen gồm cao phytoestrogen tổng, cao phytoestrogen aglycone thô và cao phytoestrogen aglycone tinh sạch. - Đánh giá hoạt tính phytoestrogen in vivo của cao phytoestrogen tổng và cao phytoestrogen aglycone thô. 3. Ý nghĩa khoa học của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Luận án là một trong số ít các công trình công bố đầy đủ về 12 thành phần phytoestrogen trong phôi hạt – một phụ phẩm của quá trình sản xuất bột đậu tương nhưng là bộ phận có hàm lượng phytoestrogen cao nhất so với các bộ phận khác của hạt đậu. Kết quả các nghiên cứu của luận án sẽ đóng góp vào cơ sở dữ liệu khoa học về các phytoestrogen từ nguồn nguyên liệu này. Khẳng định bằng thực nghiệm các dạng phytoestrogen gồm β- glucoside, acetyl-glucoside, malonyl-glucoside đều bị thủy phân bởi enzyme β-glucosidase và enzyme cellulase – đây là cơ sở cho việc nghiên cứu làm giàu phytoestrogen dạng aglycone thông qua việc nâng cao hiệu suất thủy phân các dạng acetyl-glucoside và malonyl- glucoside. Các nghiên cứu đã công bố cho thấy các dạng acetyl- glucoside, malonyl-glucoside khó bị thủy phân trong hệ tiêu hóa của người do vậy hướng đề xuất nâng cao hàm lượng phytoestrogen aglycone bằng con đường thủy phân các dạng glucoside này bởi 2
enzyme β-glucosidase và enzyme cellulase bên ngoài cơ thể là một đường hướng khả thi, hiệu quả. Đề xuất nâng cao hàm lượng phytoestrogen aglycone bằng enzyme cellulase – là một enzyme chưa phổ biến trong thủy phân các phytoestrogen glucoside, đặc biệt là trong thủy phân các cao chiết phytoestrogen từ phôi đậu tương. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Dựa vào kết quả đánh giá hàm lượng phytoestrogen trong bột phôi đậu tương, khẳng định các tiềm năng sử dụng phôi đậu tương – một phụ phẩm của quá trình sản xuất đậu tương mảnh, hiện chủ yếu làm thức ăn gia súc và chưa phát huy được hết các hoạt tính sinh học quý. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính sinh học của các dịch chiết phytoestrogen cho thấy các phytoestrogen có khả năng chống oxy hóa và có hiệu quả tương tự như estradiol có giá trị trong việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm bổ sung dinh dưỡng hay thực phẩm thuốc, mỹ phẩm để chăm sóc sức khỏe con người, đặc biệt là phụ nữ tiền mãn kinh và mãn kinh. 4. Tính mới của đề tài Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu, khảo sát đầy đủ các phytoestrogen và các dạng dẫn xuất của chúng từ phôi đậu tương giống Đ8 Việt Nam, một nguồn phụ phẩm rất giàu phytoestrogen, hiện chưa được sử dụng rộng rãi cho người mà chủ yếu đang làm thức ăn trong chăn nuôi. Luận án cũng đánh giá được khả năng chống oxy hóa, độc tính và hoạt tính estrogen in vivo của của các cao chiết giàu phytoestrogen từ phôi hạt. Đề xuất chế độ làm giàu phytoestrogen aglycone từ phôi đậu tương sử dụng enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân và enzyme cellulase từ Trichoderma reesei. Kết quả cho thấy sử dụng enzyme cellulase để thủy phân hiệu quả hơn so với việc sử dụng enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân, là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu phát triển các sản phẩm có chứa phytoestrogen aglycone nâng cao được giá trị của các hợp chất này, làm phong phú thêm tính ứng dụng của chúng trong lĩnh 3
vực công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Cây đậu tương và phôi đậu tương 1.1.1. Tình hình sản xuất tiêu thụ đậu tương tại Việt Nam 1.1.2. Thành phần hóa học phôi đậu tương 1.1.3. Thành phần các chất có hoạt tính sinh học trong phôi đậu tương 1.2. Phytoestrogen 1.2.1. Tổng quan về phytoestrogen 1.2.2. Phytoestrogen trong phôi đậu tương 1.2.3. Khả dụng sinh học của phytoestrogen đậu tương 1.2.4. Lợi ích của phytoestrogen aglycone đậu tương và các chất chuyển hóa của chúng với sức khỏe con người 1.2.5. Tính an toàn của phytoestrogen đậu tương 1.3. Các phương pháp chiết xuất phytoestrogen 1.3.1. Các phương pháp truyền thống 1.3.2. Các phương pháp hiện đại 1.3.3. Phương pháp chiết xuất phytoestrogen phôi đậu tương 1.4. Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside đậu tương thành aglycone 1.4.1. Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside bằng enzyme 1.4.2. Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside bằng vi sinh vật 1.5. Phương pháp tinh sạch phytoestrogen aglycone 1.6. Các sản phẩm có chứa phytoestrogen từ đậu tương Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Phôi đậu tương 2.1.2. Hóa chất 2.1.3. Động vật thực nghiệm 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm 2.2. Bố trí thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp đánh giá và xử lý nguyên liệu 2.2.2. Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen 2.2.3. Phương pháp thu nhận phytoestrogen aglycone 2.2.4. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phytoestrogen 2.2.5. Đánh giá hoạt tính phytoestrogen in vivo 4
Bột phôi đậu tương Đánh giá Loại lipid bằng n-hexane và xử lý Thu hồi n-hexane nguyên liệu Bột phôi đậu tương loại lipid Chiết xuất Xây dựng chế độ Dịch chiết phytoestrogen tổng chiết xuất phytoestrogen Thu hồi ethanol Cô quay chân không Cao phytoestrogen tổng Loại protein, saccharide Đánh giá hoạt tính Cao phytoestrogen trước thủy phân phytoestrogen Đánh giá in vivo khả năng Thủy phân bằng enzyme chống Thu nhận oxy hóa phytoestrogen Cao phytoestrogen aglycone thô aglycone Tinh sạch bằng dung môi Cao phytoestrogen aglycone tinh sạch Hình 2.1 Sơ đồ bố trí nội dung thí nghiệm 2.3. Xử lý số liệu Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đánh giá và xử lý nguyên liệu 3.1.1. Đánh giá hàm lượng tạp chất phôi đậu tương A B Hình 3.1 Phôi đậu tương chưa loại tạp (A) và phôi đậu tương loại tạp (B) 5
Bảng 3.1 Kết quả đánh giá lượng tạp trong phôi đậu tương Kết quả (%) Hàm lượng tạp chất lt 18,96 ± 0,61 3.1.2. Đặc tính bột phôi đậu tương Bảng 3.2 Đặc tính bột phôi đậu tương Độ ẩm W1 (%) Hàm lượng lipid L1 (%) 5,86 ± 0,07 10,56 ± 0,09 Bảng 3.3 Hàm lượng các phytoestrogen trong bột phôi đậu tương STT Thành phần Hàm lượng Hàm lượng (mg/100g) (µmol/g) 1 Daidzein 40,89 ± 0,62 1,61 ± 0,02 2 Glycitein 62,38 ± 0,20 2,19 ± 0,01 3 Genistein 41,60 ± 0,47 1,54 ± 0,00 4 Daidzin 257,75 ± 0,74 6,19 ± 0,02 5 Glycitin 152,73 ± 0,85 3,42 ± 0,02 6 Genistin 159,63 ± 1,08 3,69 ± 0,03 7 Acetyldaidzin 349,28 ± 0,89 8,12 ± 0,02 8 Acetylglycitin 23,79 ± 0,15 0,49 ± 0,00 9 Acetylgenistin 239,20 ± 1,45 5,04 ± 0,03 10 Malonyldaidzin 75,61 ± 0,44 1,51 ± 0,01 11 Malonylglycitin 64,13± 0,31 1,20 ± 0,01 12 Malonylgenistin 304,58 ± 1,06 5,88 ± 0,02 Phytoestrogen tổng số 1771,58 ± 3,10 40,88 ± 0,06 Hàm lượng phytoestrogen tổng số trong bột phôi đậu tương ban đầu là 1771,58 ± 3,10 mg/100g CK, tương đồng với các kết quả về hàm lượng phytoestrogen tổng số và thành phần trong phôi đậu tương của các giống tại Pháp, Hàn Quốc, Thái Lan, Australia.. đã công bố. Bột phôi đậu tương nghiên cứu có hàm lượng aglycone cao vượt trội hơn 8%, hàm lượng β-glucoside cao, hơn 30% là một thuận lợi. 3.1.3. Đặc tính bột phôi đậu tương đã loại lipid 6
Hình 3.2 Bột phôi đậu tương (A) và bột phôi đậu tương loại lipid (B) Bảng 3.5 Đặc tính bột phôi đậu tương đã loại lipid Độ ẩm W2 (%) Hàm lượng lipid L2 (%) 5,79 ± 0,09 0,43 ± 0,06 ‒ Hiệu suất loại lipid của bột phôi đậu tương là 95,92%. ‒ Hiệu suất thu hồi bột phôi loại lipid là 97,21% ‒ Hiệu suất thu hồi dung môi n-hexane là 66,67% Bảng 3.6 Hàm lượng các phytoestrogen trong bột phôi đậu tương đã loại lipid STT Thành phần Hàm lượng Hàm lượng (mg/100g) (µmol/g) 1 Daidzein 45,57 ± 0,65 1,79 ± 0,03 2 Glycitein 68,99 ± 0,22 2,43 ± 0,01 3 Genistein 40,94 ± 0,08 1,52 ± 0,00 4 Daidzin 298,88 ± 1,10 7,18 ± 0,03 5 Glycitin 172,42 ± 1,13 3,86 ± 0,03 6 Genistin 170,68 ± 0,75 3,95 ± 0,02 7 Acetyldaidzin 333,22 ± 0,30 7,74 ± 0,01 8 Acetylglycitin 14,23 ± 0,28 0,29 ± 0,01 9 Acetylgenistin 224,22 ± 0,98 4,73 ± 0,02 10 Malonyldaidzin 47,77 ± 0,27 0,95 ± 0,01 11 Malonylglycitin 30,09 ± 0,09 0,57 ± 0,00 12 Malonylgenistin 301,01 ± 4,95 5,81 ± 0,10 Phytoestrogen 1748,01 ± 8,25 40,80 ± 0,17 tổng 7
3.2. Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen 3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất phytoestrogen Khối lượng dịch chiết phytoestrogentổng (mg/gCK) 250 250 b Khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (mg/g CK) b b b b b 240 240 b b a a 230 230 220 220 210 210 200 200 1/8 1/10 1/12 1/15 1/20 25 30 35 40 45 tb 233,57 239,39 240,26 241,71 243,49 tb 229,06 233,57 235,36 236,78 236,87 Nhiệt độ (độ C) Tỉ lệ nguyên liệu /dung môi Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khối Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/ lượng dịch chiết phytoestrogen tổng dung môi đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng Khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (mg/g CK) 260,00 260,00 b b d a a Khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (mg/g CK) c a 250,00 bc 250,00 a ab 240,00 240,00 230,00 230,00 220,00 220,00 210,00 210,00 200,00 200,00 7 8 9 10 11 50% 60% 70% 80% 90% tb 239,39 243,35 250,01 245,43 240,11 tb 250,01 254,29 255,18 250,11 248,02 pH Nồng độ ethanol (%) Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến khối lượng Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol dịch chiết phytoestrogen tổng đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng b b b b 270,00 Khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng a 260,00 250,00 240,00 230,00 (mg/g CK) 220,00 210,00 200,00 60 90 120 150 180 tb 254,29 264,23 266,87 267,13 268,04 Thời gian (phút) Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng 8
Tại các điểm khảo sát cho khối lượng dịch chiết phytoestrogen lớn nhất là: - Nhiệt độ 30 oC - Tỷ lệ nguyên liệu / dung môi = 1/10 - pH = 9 - Nồng độ ethanol: 60% - Thời gian: 90 phút 3.2.2. Tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt Bảng 3.9 Bảng giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố Mức Biến số Kí hiệu -1 0 +1 Thời gian (phút) X1 60 90 120 Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu X2 8 10 12 pH X3 8 9 10 Nồng độ dung môi (%) X4 50 60 70 Để xây dựng và đánh giá tính tương thích của mô hình đạt được, phân tích phương sai ANOVA được sử dụng. Một mô hình được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê khi thỏa mãn các điều kiện sau: 1. Giá trị P > F của các mô hình < 0,0001 2. Độ chính xác thích hợp AP (adequate precision) được sử dụng để định hướng cho không gian thiết kế lớn hơn 4,0 3. Giá trị LOF phản ánh độ rời rạc của dữ liệu phải không có ý nghĩa về mặt thống kê 4. Giá trị R2 cao (> 0,8) Bảng 3.11. Phân tích ANOVA cho mô hình hồi quy Giá Tổng các Bậc tự Trung bình Giá trị Giá trị trị phương sai do phương sai F P>F Mô 3920,63 14 280,05 87,93 < 0.0001 hình a1 85,18 1 85,18 26,73 0,0001 a2 3305,46 1 3305,46 1037,34 < 0,0001 a3 3,98 1 3,98 1,25 0,2825 9
a4 32,88 1 32,88 10,32 0,0063 a12 61,28 1 61,28 19,23 0,0006 a13 15,52 1 15,52 4,87 0,0445 a14 49,13 1 49,13 15,42 0,0015 a23 50,66 1 50,66 15,90 0,0013 a24 27,81 1 27,81 8,73 0,0105 a34 59,95 1 59,95 18,82 0,0007 a11 115,07 1 115,07 36,11 < 0,0001 a22 61,62 1 61,62 19,34 0,0006 a33 61,57 1 61,57 19,32 0,0006 a44 112,90 1 112,90 35,43 < 0,0001 Số dư 44,61 14 3,19 LOF 20,21 10 2,02 0,033 0,9288 Sai số 24,40 4 6,10 Cor 3965,24 28 Total LOF = lack of fit, Có ý nghĩa tại p < 0,05; Không có ý nghĩa tại p > 0,05 SD 1,79 R2 0,9887 Giá trị 258,11 2 R hiệu chỉnh 0,9775 C.V% 0,69 R2 dự đoán 0,9610 Độ chính xác thích Press 154,53 34,292 hợp (AP) Xét theo các tiêu chuẩn trên, mô hình bậc hai trong nghiên cứu này thỏa mãn cả 4 tiêu chí với P < 0,0001; AP = 34,292; LOF =0,9288 không có ý nghĩa về mặt thống kê; R2 = 0,9887 chỉ ra rằng có sự đồng nhất cao của giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán. Ngoài ra, một số yếu tố khác cũng được sử dụng để đánh giá mô hình hoàn toàn tương thích tốt với kết quả thực nghiệm và dự đoán (predicted and actual value plots) và các biểu đồ phân bố ngẫu nhiên của các lần thí nghiệm (residuals versus runs models). Các dữ liệu ở các hình cũng chỉ ra rằng mô hình có sự tương quan tốt khi các điểm tập trung theo dạng đường thẳng và phân bố của các điểm thí nghiệm là ngẫu nhiên. 10
(A) (B) Hình 3.8 Biểu đồ so sánh giá trị thực nghiệm – dự đoán (A) và Phân bố ngẫu nhiên 29 thí nghiệm (B) Phương trình hồi quy lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (Y) có dạng mô hình bậc 2 được biểu diễn theo biến coded Y = 264,13 + 2,66X1 + 16,6X2 – 0,58X3 – 1,66X4 + 3,91X1X2 – 1,97X1X 3 – 3,50X1 X 4 – 3,56X2X 3 + 2,64X2X4 + 3,87X3X 4 – 4,21X12 – 3,08X22 – 3,08X32 – 4,17X42 Phương trình hồi quy hàm lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (Y) có dạng mô hình bậc 2 được biểu diễn theo biến thực như sau: Y = - 255,97728 + 1,57066X1 + 25,94183X2 + 55,35413X3 + 1,08964X4 + 0,065233X1 X 2 – 0,065650X1 X 3 – 0,011682X1 X 4 – 1,77938X2 X 3 + 0,13184X2 X4 + 0,38715X3X4 – 4,67993E-0,03X12 – 0,77051X22 – 3,08093X32 – 0,041721X42 Do giá trị a3 >0,05 nên phương trình hồi quy khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (Y) theo biến thực suy biến như sau Y = - 255,97728 + 1,57066X1 + 25,94183X2 + 1,08964X4 + 0,065233X1 X 2 – 0,065650X1 X 3 – 0,011682X1 X 4 – 1,77938X2 X 3 + 0,13184X2 X4 + 0,38715X3X4 – 4,67993E-0,03X12 – 0,77051X22 – 3,08093X32 – 0,041721X42 (A) Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất và nồng độ ethanol đến khối lượng dịch chiết (B) Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên phytoestrogen tổng liệu và nồng độ ethanol đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng 11
(C )Ảnh hưởng của pH và nồng độ ethanol đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (D) Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu và pH đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (E) Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất và tỉ lệ dung môi: nguyên liệu đến khối lượng dịch (F) Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất và chiết phytoestrogen tổng pH đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng Hình 3.10. Biểu diễn 3D ảnh hưởng các yếu tố thực nghiệm đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng Như vậy các điều kiện chiết xuất được lựa chọn sau khi tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt là: - Thời gian chiết xuất là 90 phút - Tỉ lệ dung môi / nguyên liệu là 1/12 - pH chiết xuất là 9; - Nồng độ ethanol là 65% Bảng 3.3 Hàm lượng các phytoestrogen trong dịch chiết phytoestrogen tổng Tối ưu bằng phương pháp đáp Thành phần ứng bề mặt (µmol/g CK) 1 Daidzein 1,66 ± 0,01 2 Glycitein 2,34 ± 0,01 12
3 Genistein 1,39 ± 0,01 4 Daidzin 6,77 ± 0,03 5 Glycitin 3,75 ± 0,02 6 Genistin 3,91 ± 0,02 7 Acetyldaidzin 7,61 ± 0,03 8 Acetylglycitin 0,18 ± 0,00 9 Acetylgenistin 4,63 ± 0,02 10 Malonyldaidzin 0,76 ± 0,00 11 Malonylglycitin 0,33 ± 0,00 12 Malonylgenistin 5,70 ± 0,02 Phytoestrogen tổng 39,02 ± 0,16 So sánh hiệu quả quá trình chiết xuất các phytoestrogen giữa phương pháp khảo sát đơn yếu tố và phương pháp đáp ứng bề mặt hiệu quả chiết xuất các phytoestrogen tổng số tăng từ 81,14 đã tăng lên 95,62%. Trong đó lượng phytoestrogen thu được theo phương pháp khảo sát đơn yếu tố là 32,19 ± 0,21 (µmol/g CK) tương đương 1418,27 ±10,23 (mg/100 g CK) tăng lên khi chiết xuất theo phương pháp đáp ứng bề mặt là 39,02 ± 0,16 (µmol/g CK) tương đương 1671,54 ± 6,86 (mg/100g CK). 3.3. Thu nhận phytoestrogen aglycone 3.3.1. Thu nhận cao phytoestrogen tổng Từ bột phôi đậu tương đã loại lipid tiến hành chiết xuất, cô quay thu cao phytoestrogen tổng. Hiệu suất thu hồi dung môi ethanol là 70,21%. Cao phytoestrogen tổng được điều chỉnh pH và xác định hàm lượng phytoestrogen thành phần bằng HPLC. Kết quả của cao chiết trước khi thủy phân được trình bày trong bảng sau Bảng 3.13 Hàm lượng các phytoestrogen trong cao chiết trước thủy phân STT Thành phần cao chiết Hàm lượng (µmol/g CK) 1 Daidzein 1,92 ± 0,06 2 Glycitein 2,72 ± 0,10 3 Genistein 1,74 ± 0,02 13
4 Daidzin 9,57 ± 0,13 5 Glycitin 5,14 ± 0,14 6 Genistin 5,63 ± 0,09 7 Acetyldaidzin 7,77 ± 0,05 8 Acetylglycitin 0,39 ± 0,01 9 Acetylgenistin 4,77 ± 0,08 10 Malonyldaidzin 1,32 ± 0,06 11 Malonylglycitin 1,16 ± 0,02 12 Malonylgenistin 5,77 ± 0,04 Phytoestrogen tổng 47,90 ± 0,14 3.3.2. Chuyển hóa phytoestrogen glucoside thành aglycone bằng enzyme β-glucosidase Sử dụng enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân để chuyển hóa phytoestrogen glucoside tại pH 5, nhiệt độ 37 oC. Kết quả khảo sát nồng độ enzyme và thời gian thủy phân được trình bày ở hình sau Hình 3.12 Hiệu suất thủy phân Hình 3.14 Hiệu suất thủy phân các dạng glucoside theo nồng các dạng glucoside bằng enzyme độ enzyme β-glucosidase β-glucosidase theo thời gian 14
35,00 Hàm lượng aglycone (µmol/g CK) b b bc c c 30,00 25,00 20,00 b bc cd d d 15,00 b b b b b 10,00 b b b b b a 5,00 a a a 0,00 0 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 Daidzein 1,92 14,88 14,89 14,94 14,97 14,98 Glycitein 2,72 7,58 7,57 7,58 7,58 7,59 Genistein 1,74 8,75 8,75 8,77 8,81 8,82 Aglycone tổng 6,38 31,21 31,22 31,29 31,36 31,39 Thời gian (h) Daidzein Glycitein Genistein Aglycone tổng Hình 3.15 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân bằng enzyme β- glucosidase đến hàm lượng aglycone Vậy có thể sử dụng enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân 49290 (Sigma-Aldrich) hoạt lực 4 U/mg để làm giàu aglycone trong cao chiết phytoestrogen tổng số. Điều kiện thủy phân các phytoestrogen glucoside của enzyme là: ‒ pH 5 ‒ Nhiệt độ 37 oC ‒ Nồng độ enzyme: 4 U/g bột đậu tương khử lipid ‒ Thời gian 5,5 giờ 3.3.3. Chuyển hóa phytoestrogen glucoside thành aglycone bằng enzyme cellulase Enzyme cellulase từ Trichoderma reesei C2730 (Sigma) hoạt lực β-glucosidase 28 U/ml. Điều kiện phản ứng thủy phân cơ sở được xác định theo khuyến cáo của Sigma và Wang [78]: pH = 4,8; Nhiệt độ 40 o C; Nồng độ enzyme 0,5 U/g; Thời gian: 4,0 giờ. 15
Hình 3.16 Hiệu suất thủy phân Bảng 3.18 Hiệu suất thủy phân các dạng glucoside bằng enzyme các dạng glucoside bằng enzyme cellulase theo nhiệt độ cellulase theo pH Hình 3.20 Hiệu suất thủy phân Hình 3.22 Hiệu suất thủy phân dạng glucoside theo nồng độ các dạng glucoside bằng enzyme enzyme cellulase cellulase theo thời gian 16
40,00 b d e c c Hàm lượng aglycone (µmol/g) 35,00 30,00 25,00 20,00 b c c c d b c d c c 15,00 10,00 a c cd d b b 5,00 aaa 0,00 0 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 Daidzein 1,92 16,15 16,49 16,67 16,49 16,48 Glycitein 2,72 5,66 5,69 5,70 5,60 5,60 Genistein 1,74 13,12 13,27 13,54 13,27 13,27 Aglycone tổng 6,38 34,94 35,45 35,91 35,36 35,35 Thời gian (h) Daidzein Glycitein Genistein Aglycone tổng Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân bằng enzyme cellulase đến hàm lượng aglycone Vậy có thể sử dụng enzyme Cellulase từ Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich) để làm giàu aglycone trong cao chiết phytoestrogen tổng. Điều kiện thủy phân của enzyme là: ‒ pH 5 ‒ Nhiệt độ 50 oC ‒ Nồng độ enzyme: 1,5 U/g bột đậu tương khử lipid ‒ Thời gian 5,0 giờ 3.3.4. So sánh hiệu quả quá trình thủy phân glucoside bằng enzyme β-glucosidase và cellulase Dựa vào kết quả làm giàu aglycone bằng hai enzyme β-glucosidase hạnh nhân và cellulase Trichoderma reesei cho thấy khi sử dụng với nồng độ enzyme thấp hơn, cellulase Trichoderma reesei cho hiệu suất thủy phân các dạng β-glucoside tương đương với việc sử dụng β- glucosidase hạnh nhân, ngoài ra còn rất hiệu quả trong việc thủy phân dạng acetyl-glucoside do đó làm tổng hiệu suất thủy phân các dạng glucoside được nâng lên hơn 10% dẫn đến hàm lượng aglycone tổng số thu được cũng cao hơn. 3.3.5. Tinh sạch phytoestrogen 17
Bảng 3.17 Độ tinh sạch của các cao chiết phytoestrogen theo các giai đoạn thu nhận Cao Cao Cao phytoestrogen phytoestrogen phytoestrogen aglycone tổng aglycone thô tinh sạch Khối lượng cao chiết 28,08 ± 0,03 4,35 ± 0,01 1,41 ± 0,00 (mg) Hàm lượng 2072,42 ± 1201,35 ± 1333,68 ± phytoestrogen tổng 4,85 1,20 3,63 (mg/100g CK) Hàm lượng aglycone 1161,64 ± 174,12 ± 3,85 951,75 ± 0,80 (mg/100g CK) 4,20 Hàm lượng aglycone so với phytoestrogen 8,40 79,22 87,10 tổng (%) Độ tinh sạch aglycone so với khối 6,20 21,87 82,39 lượng cao chiết (%) 3.4. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phytoestrogen Mẫu 1: cao phytoestrogen tổng (mẫu CE) Mẫu 2: cao phytoestrogen alycone thô (mẫu TPCa) Mẫu 3: cao phytoestrogen aglycone tinh sạch (mẫu TSC) 3.4.1. Đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH Khả năng quét gốc tự do DPPH của các cao chiết phytoestrogen được trình bày trong các hình sau 100 93,95 80 67,18 75,25 Phần trăm quét gốc tự do 80 Phần trăm quét gốc tự do 57,49 60 40,85 60 40 31,11 23,06 (%) 40 16,59 (%) 16,74 20 20 10,50 0 8,71 0 0 10 20 30 0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 Nồng độ acid ascorbic (µg/ml) Nồng độ cao phytoestrogen tổng (mg/ml) Hình 3.25 Khả năng quét gốc tự do của acid Hình 3.16 Khả năng quét gốc tự do của ascorbic cao phytoestrogen tổng Linear Y = -4,656 + 3,791*X Quadratic Y = 6,431 + 7,815*X – 0,118*X2 IC50 =0,0137 (mg/ml) IC50 = 6,142 ± 0,050 (mg/ml) 18