Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Sĩ đánh giá sự thay đổi tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của nghiên cứu là tìm ra phương thức tác động của điều kiện vi trọng lực mô phỏng lên sự phát triển của hucMSC, thông qua việc xác định các thay đổi về hình thái tế bào, sự tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào của hucMSC trong điều kiện in vitro.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Sĩ đánh giá sự thay đổi tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚC KHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG RỐN NGƯỜI TRONG ĐIỀU KIỆN VI TRỌNG LỰC MÔ PHỎNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2021
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Hoàng Nghĩa Sơn Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ …, ngày … tháng … năm 2021. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Trong lĩnh vực sinh học trọng lực, các nghiên cứu về vi trọng lực trong không gian đã tìm ra nhiều tác động của điều kiện trọng lực lên các quá trình sinh học, các cơ chế nhạy cảm với trọng lực, hay sự định hướng dựa vào trọng lực của các sinh vật. Tuy nhiên, việc nghiên cứu trong không gian đã và đang gặp phải một số khó khăn nhất định, bao gồm chi phí đắt đỏ cho các phương tiện nghiên cứu và những ảnh hưởng tiêu cực từ môi trường vi trọng lực lên cơ thể phi hành gia. Để khắc phục những khó khăn trên, các nhà khoa học đã cố gắng tạo ra các mô hình hệ thống sinh học mô phỏng điều kiện tương tự trạng thái vi trọng lực trên mặt đất nhằm nghiên cứu sâu hơn các tác động của điều kiện vi trọng lực hay siêu trọng lực trên các sinh vật sống hay đối tượng sống trên Trái Đất. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các loại tế bào ở những sinh vật khác nhau hoạt động khác nhau trong không gian so với trên Trái đất. Do có sự đa dạng lớn về các loại tế bào trong tự nhiên, ảnh hưởng của vi trọng lực lên các tế bào đó vô cùng đa dạng và thường phức tạp. Một số nghiên cứu về vai trò của vi trọng lực đối với sự tăng sinh và biệt hóa tế bào đã chứng minh rằng các tế bào phát triển trong môi trường vi trọng lực phát triển khác với trong điều kiện bình thường dẫn đến những thay đổi trong quá trình phân chia tế bào. Khung xương tế bào cũng là một trong những đối tượng chịu ảnh hưởng lớn dưới tác động của vi trọng lực. Bộ khung xương tế bào hình thành cấu trúc chính của tế bào và bao gồm các tương tác giữa các vi ống, vi sợi actin, vi sợi trung gian và các protein liên quan. Do đó, khung xương tế bào có liên quan rất lớn đến hình dạng tế bào. Sự bất thường trong hoạt động của các vi ống và vi sợi trong khung
2 xương tế bào có thể có ảnh hưởng bất lợi lên bản thân mỗi tế bào, thậm chí gây những hậu quả rất lớn khi tế bào ở giai đoạn phôi. Các cơ chế của những thay đổi về tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào dưới tác động của vi trọng lực vẫn chưa được chứng minh rõ ràng. Tế bào gốc trung mô cuống rốn là dòng tế bào tiềm năng và việc thu nhận chúng không vấp phải nhiều vấn đề đạo đức như các dòng tế bào gốc trung mô từ nguồn khác. Hiện nay, vẫn chưa có nhiều báo cáo về tác động của vi trọng lực lên tế bào gốc trung mô cuống rốn, do đó nghiên cứu sử dụng dòng tế bào này làm đối tượng để đánh giá các ảnh hưởng của vi trọng lực. Từ những lý do trên, nghiên cứu sử dụng hệ thống clinostat 3D để tạo ra môi trường vi trọng lực mô phỏng nhằm mục tiêu đánh giá tác động của điều kiện vi trọng lực mô phỏng lên sự tăng sinh và cấu trúc khung xương của tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human mesenchymal stem cells, viết tắt hucMSC. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Mục tiêu của nghiên cứu là tìm ra phương thức tác động của điều kiện vi trọng lực mô phỏng lên sự phát triển của hucMSC, thông qua việc xác định các thay đổi về hình thái tế bào, sự tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào của hucMSC trong điều kiện in vitro. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án ‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên sự tăng sinh tế bào hucMSC. ‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên quá trình apoptosis ở tế bào hucMSC. ‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên sự thay đổi hình thái nhân và tế bào chất ở tế bào hucMSC.
3 ‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên bộ khung xương tế bào ở tế bào hucMSC. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vai trò của các nghiên cứu sinh học trong không gian Phần này nêu tầm quan trọng và liệt kê các hướng nghiên cứu sinh học trong không gian. 1.2. Giới thiệu về vi trọng lực và vi trọng lực mô phỏng Phần này giới thiệu tổng quan và nêu khái niệm về vi trọng lực và vi trọng lực mô phỏng. 1.3. Các hệ thống mô phỏng vi trọng lực Phần này giới thiệu một số hệ thống vi trọng lực mô phỏng và các nghiên cứu được thực hiện trên các hệ thống này. 1.4. Tế bào gốc trung mô cuống rốn Phần này trình bày các đặc tính sinh học của tế bào gốc trung mô cuống rốn và lợi ích của chúng trong nghiên cứu. 1.5. Sự tăng sinh tế bào Trình bày khái niệm về sự tăng sinh tế bào, chu kỳ tế bào và các yếu tố điều hòa chu kỳ tế bào và các nghiên cứu về ảnh hưởng của vi trọng lực lên sự tăng sinh tế bào. 1.6. Quá trình apoptosis Phần này trình bày khái niệm, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình apoptosis và các phương pháp đánh giá apoptosis. 1.7. Nhân và tế bào chất Phần này trình bày khái niệm và các yếu tố ảnh hưởng đến hình thái nhân và tế bào chất ở tế bào. 1.8. Bộ khung xương tế bào
4 Phần này trình bày các thành phần cấu trúc nên bộ khung xương tế bào và các nghiên cứu về ảnh hưởng của vi trọng lực lên bộ khung xương tế bào. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu ‒ Tế bào gốc trung mô cuống rốn người (hucMSC) được cung cấp bởi Viện Sinh học Nhiệt đới. ‒ Hệ thống máy clinostat 3D tạo môi trường vi trọng lực mô phỏng được thiết kế và chế tạo trong đề tài: “Nghiên cứu đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc bộ khung tế bào cơ thể sống trong điều kiện mô phỏng trạng thái vi trọng lực (simulated microgravity)”, thuộc Chương trình Khoa học công nghệ vũ trụ, mã số: VT- CB.15/18-20. 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nuôi cấy tế bào 2.2.1.1. Phương pháp giải đông hucMSC được huyền phù hóa trong môi trường nuôi cấy DMEM/Ham’s F-12 with L-Glutamine (DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) bổ sung 15% FBS (FBS-HI-22B, Capricorn Scientific, Đức) và 1% Pen/Strep (15140-122, Gibco, Mỹ), sau đó ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng để thu tủa tế bào. Tủa tế bào được tái huyền phù trong môi trường nuôi cấy trên và nuôi ở điều kiện 37°C, 5% CO2. 2.2.1.2. Phương pháp cấy chuyền Tế bào hucMSC được xử lý với Trypsin 0,25% (TRY-2B, Capricorn Scientific, Đức) và ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng để thu tủa tế bào. Tủa tế bào được tái huyền phù hóa và nuôi ở nhiệt độ 37°C, 5% CO2.
5 2.2.1.3. Phương pháp đông lạnh Tủa hucMSC sau thu hoạch được huyền phù hóa với 500 μl DMEM/Ham’s F-12 with L-Glutamine (DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) và 500 μl môi trường đông lạnh HyCryo-STEM (SR30002.02, GE Healthcare Life Sciences, Mỹ). Huyền phù tế bào được chuyển vào ống đông lạnh (430663, Corning, Mỹ) và trữ ở - 20°C trong 1 giờ, sau đó trữ ở -80°C qua đêm và cuối cùng chuyển vào nitơ lỏng để lưu trữ. 2.2.2. Đánh giá các chỉ thị marker của tế bào gốc trung mô hucMSC sau giải đông và cấy chuyền được thu hoạch và đánh giá tính gốc bằng phương pháp Flow cytometry sử dụng kit Human MSC analysis kit (562245, BD Biosciences, Mỹ). Mẫu tế bào được phân tích bằng hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Mỹ). 2.2.3. Thử nghiệm vi trọng lực hucMSC được nuôi trong bình nuôi T-25 (160430, Thermo Scientific, Mỹ) và đĩa 96 giếng (161093, Thermo Scientific, Mỹ) với mật độ lần lượt là 105 tế bào/bình nuôi và 2 × 103 tế bào/giếng. Đĩa và bình nuôi tế bào được đổ đầy môi trường nuôi cấy. Tế bào sau đó được chia làm 2 nhóm: nhóm vi trọng lực (SMG-Clinostat) và nhóm đối chứng (Control). Đối với nhóm vi trọng lực, tế bào được nuôi trong hệ thống máy 3D-Clinostat và quay ở chế độ 1,3×10-3G. Tế bào ở nhóm đối chứng được nuôi ở điều kiện trọng lực bình thường (1G). Thử nghiệm vi trọng lực được tiến hành trong vòng 72 giờ. 2.2.4. Đánh giá sự tăng sinh tế bào 2.2.4.1. Đánh giá mật độ tế bào hucMSC được xử lý với dung dịch WST-1 (11644807001, Roche, Thụy Sĩ) trong 3,5 giờ ở 37ºC, 5% CO2. Giá trị OD mỗi giếng được
6 đo bởi máy quang phổ GloMax® Explorer Multimode Microplate Reader (Promega, Mỹ) ở bước sóng 450 nm. 2.2.4.2. Đánh giá chu kỳ tế bào Đánh giá tỉ lệ tế bào đi vào các pha trong chu kỳ: Hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Mỹ) được sử dụng để phân tích những thay đổi trong chu kỳ của hucMSC. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào: RNA tổng của hucMSC được tách bằng kit ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Z6011, Promega, Mỹ). Biểu hiện mức độ phiên mã của các gene CDK2, CDK6, Cyclin A được đánh giá bằng phương pháp Realtime qRT-PCR sử dụng kit 2x qPCR SyGreen 1- Step Go Hi-ROX kit (PB25.32.03, PCRBiosystem, Anh). Chu trình nhiệt được tiến hành như sau: 45°C trong 15 phút, 95°C trong 2 phút, 40 chu kỳ gồm 95°C trong 10 giây và 62°C trong 15 giây, 71 chu kỳ 60°C trong 30 giây, 4°C trong 30 phút. Trình tự mồi bao gồm: CDK2 F: 5’-CCAGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3’, R: 5’- TTCATCCAGGGGAGGTACAAC-3’; CDK6 F: 5’- TCTTCATTCACACCGAGTAGTGC-3’, R: 5’- TGAGGTTAGAGCCATCTGGAAA-3’; Cyclin A F: 5’- GCCATTAGTTTACCTGGACCCAGA-3’, R: 5’- CACTGACATGGAAGACAGGAACCT-3’; GAPDH F: 5’- CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’, R: 5’- AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’. Phương pháp 2-∆∆Ct (Livak) (Real-time PCR Applications Guide – Biorads) được áp dụng để đánh giá mức độ biểu hiện tương đối sự biểu hiện gene. Đánh giá biểu hiện mức dịch mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào: Mức độ biểu hiện của các protein Cyclin A1+A2, CDK4, CDK6 được đánh giá bằng phương pháp Western Blot. Protein GAPDH
7 được sử dụng làm đối chứng. Các kháng thể được sử dụng bao gồm: Anti-Cyclin A1 + Cyclin A2 antibody (ab185619, Abcam, Mỹ), Anti-CDK4 antibody (ab137675, Abcam, Mỹ), Anti-CDK6 antibody (ab124821, Abcam, Mỹ), Anti-GAPDH antibody (ab181602, Abcam, Mỹ). Phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) được dùng để đo cường độ của các vạch protein trong kết quả hiện phim. 2.2.5. Đánh giá quá trình apoptosis 2.2.5.1. Thu hoạch tế bào Tủa tế bào hucMSC được thu hoạch như ở Mục 2.2.1.2. 2.2.5.2. Đánh giá tỉ lệ apoptosis hucMSC sau khi thu hoạch được xử lý với FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Mỹ) và được phân tích bởi hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytomete (BD Biosciences, Mỹ). 2.2.5.3. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis Các gene Bax và Bcl-2 được đánh giá biểu hiện mức phiên mã bằng phương pháp Realtime qRT-PCR. Quy trình thu nhận RNA tổng và phản ứng Realtime qRT-PCR được thực hiện như Mục 2.2.4.2. Chu trình nhiệt được tiến hành như sau: 45°C trong 15 phút, 95°C trong 2 phút, 40 chu kỳ gồm 95°C trong 10 giây và 52,2°C trong 15 giây, 71 chu kỳ 60°C trong 15 giây, 4°C trong 30 phút. Các cặp mồi đặc trưng cho các gene khảo sát bao gồm: Bax F: 5’- CCAGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3’, R: 5’- TTCATCCAGGGGAGGTACAAC-3’; Bcl-2 F: 5’- TCTTCATTCACACCGAGTAGTGC-3’, R: 5’- TGAGGTTAGAGCCATCTGGAAA-3’; GAPDH F: 5’-
8 CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’, R: 5’- AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’. 2.2.6. Đánh giá sự thay đổi hình thái nhân và tế bào chất hucMSC được nhuộm nhân bằng Hoechst 33342 (14533, Sigma- Aldrich, Mỹ) và quan sát dưới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ). Ứng dụng Cell Cycle App được sử dụng để đánh giá hình thái nhân, bao gồm diện tích, cường độ và giá trị hình dạng nhân (nuclear shape value). Phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) được dùng để đánh giá diện tích tế bào. Kích thước của hucMSC cũng được đánh giá bằng phương pháp flow cytometry thông qua kết quả đo chỉ số FSC (Forward Scatter). 2.2.7. Đánh giá sự thay đổi cấu trúc khung xương tế bào 2.2.7.1. Thu hoạch tế bào Tủa tế bào hucMSC được thu hoạch như ở Mục 2.2.1.2. 2.2.7.2. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi Các gene gồm α-tubulin 3 và β-actin được đánh giá biểu hiện mức phiên mã bằng phương pháp Realtime qRT-PCR như Mục 2.2.4.2. Chu trình nhiệt được tiến hành như sau: 45°C trong 15 phút, 95°C trong 2 phút, 40 chu kỳ gồm 95°C trong 10 giây và 60°C trong 15 giây, 71 chu kỳ 60°C trong 15 giây, 4°C trong 30 phút.. Các cặp mồi đặc trưng cho các gene khảo sát bao gồm: α-tubulin 3 F: 5’- CATTGAAAAGTTGTGGTCTGATCA-3’, R: 5’- GCTTGGGTCTGTAACAAAGCAT-3’; β-actin F: 5’- GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3’, R: 5’- AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’; GAPDH F: 5’-
9 CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’, R: 5’- AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’. 2.2.7.3. Đánh giá biểu hiện mức dịch mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi Mức độ biểu hiện của các protein α-tubulin và β-actin, được đánh giá bằng phương pháp Western Blot như ở Mục 2.2.4.2. Các kháng thể được sử dụng bao gồm: Anti-beta Actin antibody (ab8226, Abcam, Mỹ), Anti-alpha Tubulin antibody (ab52866, Abcam, Mỹ), Anti-GAPDH antibody (ab181602, Abcam, Mỹ). 2.2.7.4. Đánh giá sự tái cấu trúc bộ khung vi ống, vi sợi trong tế bào Vi ống được nhuộm với SiR-Tubulin Kit (CY-SC002, Cytoskeleton, Inc., Mỹ). Vi sợi được nhuộm với Phalloidin CruzFluor™ 488 Conjugate (sc-363791, Santa Cruz Biotechnology, Mỹ). Nhân tế bào được nhuộm bằng Hoechst 33342 (14533, Sigma- Aldrich, Mỹ). Tế bào được quan sát dưới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ). Mật độ các bó vi sợi, vi ống trong tế bào được đánh giá bằng cách đo cường độ phát huỳnh quang của protein trong các bó sợi này bằng phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ). 2.2.8. Phương pháp thống kê Phần mềm Sigma Plot (SYSTAT Software, Mỹ) được dùng để phân tích số liệu trong nghiên cứu. Phương pháp One-way ANOVA được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa các nhóm thí nghiệm, trong đó p ≤ 0,05, p ≤ 0,01, p ≤ 0,001 được xem là các khác biệt có ý nghĩa thống kê.
10 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá các chỉ thị marker của tế bào gốc trung mô Biểu hiện của các marker âm tính và dương tính cho tế bào gốc trung mô được thể hiện ở Hình 3.1. Hình 3.1. Đánh giá biểu hiện marker ở hucMSC Kết quả phân tích flow cytometry cho thấy tế bào hucMSC được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện dương tính với các marker đặc trưng cho tế bào gốc trung mô là CD90, CD73 và CD105. (Hình 3.1B2-B4) và biểu hiện âm tính với các marker không đặc trưng cho dòng tế bào này trong PE hMSC Negative Cocktail, bao gồm CD34, CD11B, CD19, CD45, và HLA-DR (Hình 3.1 B1). Việc âm tính với các marker CD34, CD45, CD19 chứng tỏ quần thể tế bào hucMSC không nhiễm các tế bào tiền thân tạo máu, tế bào nội mô hay tế bào bạch cầu. Hơn nữa, sự âm tính với marker CD19 cho thấy tế bào B và tế bào tua (dendritic cells) không tồn tại trong quần thể tế bào hucMSC trên. Ngoài ra, sự âm tính với marker HAL-DR và CD11B chứng tỏ không tồn tại tế bào bạch cầu hay đại thực bào trong quần thể tế bào hucMSC. Các kết quả phân tích trên chứng tỏ quần thể tế bào
11 hucMSC sử dụng trong nghiên cứu vẫn giữ được các đặc tính của tế bào gốc trung mô. 3.2. Đánh giá sự tăng sinh tế bào 3.2.1. Sự thay đổi mật độ tế bào Mật độ quang của hucMSC trong hai nhóm thí nghiệm được tính toán và thể hiện ở Hình 3.2. Theo đó, mật độ quang trung bình ở nhóm thử nghiệm vi trọng lực (SMG) là 0,97 ± 0,05, thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng là 1,09 ± 0,13 (p ≤ 0,001). Điều này cho thấy mức độ tăng sinh của hucMSC giảm khi nuôi cấy trong môi trường vi trọng lực mô phỏng. Hình 3.2. Mật độ quang của hucMSC qua đánh giá bằng phương pháp WST-1. A: Biểu đồ mật độ quang. B: hucMSC trong điều kiện bình thường. C: hucMSC trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG). ***: p ≤ 0,001. Thước đo: 111,82 μm 3.2.2. Sự thay đổi chu kỳ tế bào 3.2.2.1. Tỉ lệ các pha trong chu kỳ tế bào Kết quả phân tích chu kỳ tế bào ở Hình 3.3 cho tỷ lệ tế bào hucMSC bước vào pha nghỉ G0/G1 ở nhóm nuôi cấy dưới điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG) là 85,65 ± 0,65% cao hơn rõ rệt so với nhóm đối chứng là 72,27 ± 1,28%. Đồng thời, tỉ lệ hucMSC đi vào pha phân chia G2/M ở nhóm SMG cũng giảm so với ở nhóm đối chứng (5.65 ± 0.05% ở nhóm SMG và 22,10 ± 1,27% ở nhóm đối chứng).
12 Những khác biệt này đều có ý nghĩa thống kê khi phân tích bằng One- way ANOVA với p ≤ 0,01. Dữ liệu này cho thấy rằng vi trọng lực mô phỏng có thể làm giảm quá trình phân chia và có xu hướng tạo ra giai đoạn bắt giữ chu kỳ tế bào. Hình 3.3. Chu kì tế bào hucMSC qua phân tích flow cytometry 3.2.2.2. Biểu hiện mức độ phiên mã các gene điều hòa chu kì tế bào Biểu hiện mRNA của các gene CDK2, CDK6, Cyclin A ở hucMSC khi nuôi cấy trong môi trường vi trọng lực mô phỏng đều có sự giảm xuống mang ý nghĩa thống kê (Hình 3.4). CDK2 ở nhóm SMG có biểu hiện giảm mạnh còn 0,59 ± 0,07 so với nhóm đối chứng là 1,01 ± 0,13 (p ≤ 0,001). CDK6 giảm biểu hiện nhẹ hơn khi mức độ biểu hiện ở nhóm SMG là 0,68 ± 0,05 so với đối chứng là 1,00 ± 0,14 (p ≤ 0,01). Cyclin A có mức độ hiểu hiện giảm nhẹ nhất trong ba gene với mức độ biểu hiện ở nhóm SMG là 0,83 ± 0,09 và ở nhóm đối chứng là 1,00 ± 0,09 (p ≤ 0,05). Hình 3.4. Biểu hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào. ***: p ≤ 0,001; *: p ≤ 0,05
13 3.2.2.3. Biểu hiện mức độ dịch mã các gene điều hòa chu kì tế bào Biểu hiện các protein Cyclin A1+A2, CDK4 và CDK6 ở hucMSC đều có xu hướng giảm khi nuôi cấy trong môi trường vi trọng lực mô phỏng (Hình 3.5). Cyclin A1+A2 có mức độ biểu hiện giảm rõ nét nhất khi tỉ lệ biểu hiện ở nhóm vi trọng lực (SMG) là 0,34 ± 0,04, bằng một phần ba tỉ lệ biểu hiện ở nhóm đối chứng là 1,00 ± 0,07 (p ≤ 0,001). Mức độ Hình 3.5. Biểu hiện mức dịch biểu hiện CDK4 và CDK6 ở nhóm mã các gene điều hòa chu kỳ SMG lần lượt là 0,79 ± 0,01 và tế bào. ***: p ≤ 0,001; 0,82 ± 0,01, giảm nhẹ so với **: p ≤ 0,01; *: p ≤ 0,05 nhóm đối chứng (1,00 ± 0,06 ở CDK4 và 1,00 ± 0,10 ở CDK6). 3.3. Đánh giá quá trình apoptosis 3.3.1. Tỉ lệ apoptosis Phân tích flow cytometry chỉ ra rằng không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về tỷ lệ sống của các tế bào hucMSC từ nhóm đối chứng (93,20 ± 0,35%) và nhóm vi trọng lực (SMG) (92,85 ± Hình 3.6. Tỉ lệ tế bào sống và 1,15%) (Hình 3.6). Tổng tỷ apoptosis ở hucMSC qua phân lệ apoptosis (apoptosis sớm tích flow cytometry
14 và apoptosis muộn) của các tế bào hucMSC từ nhóm SMG cũng tương tự như đối chứng. 3.3.2. Biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis Kết quả từ Hình 3.7 chỉ ra rằng không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về biểu hiện mRNA của Bcl2 và Bax ở hucMSC giữa nhóm đối chứng và nhóm vi trọng lực Hình 3.7. Biểu hiện mức (SMG). Điều này cho thấy sự chết phiên mã các gene liên của tế bào không dẫn đến sự giảm quan đến apoptosis tăng sinh của các tế bào hucMSC. 3.4. Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào 3.4.1. Sự thay đổi hình thái nhân Hình thái nhân của hucMSC đã có một số thay đổi khi tế bào được nuôi trong môi trường vi trọng lực mô phỏng. Ở Hình 3.8, cường độ nhân của hucMSC có biểu hiện giảm trong môi trường vi trọng lực mô phỏng, ở Hình 3.8. Cường độ nhân nhóm SMG là 5629317 ± 39469 so của hucMSC. ***: p ≤ 0,001 với nhóm đối chứng là 5957254 ± 65063 (p ≤ 0,001). Trong khi đó, diện tích nhân của hucMSC không có sự thay đổi đáng kể khi không tìm thấy sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê nào giữa hai nhóm SMG (314,04 ± 2,55 µm2) và đối chứng (318,07 ± Hình 3.9. Diện tích nhân của hucMSC 1,73 µm2) (Hình 3.9). Giá trị hình
15 dạng nhân biểu thị mức đối xứng của nhân tế bào, nhân càng đối xứng thì giá trị càng tiệm cận đến 1,0. Hình 3.10 cho thấy giá trị hình dạng nhân của hucMSC không có sự thay đổi giữa nhóm SMG (0,89 Hình 3.10. Hình dạng nhân ±0,002) và nhóm đối chứng (0,88 ± của hucMSC 0,003). Sự phân bố các tế bào hucMSC theo hình dạng và cường độ nhân giữa hai nhóm thí nghiệm cũng khá tương đồng (Hình 3.11 và 3.12). Nhóm đối chứng có sự phân bố cường độ nhân vượt qua ngưỡng 1,5 × 107 trong khi đó hầu hết giá trị cường độ nhân nhóm SMG đều nằm dưới ngưỡng 1,5 × 107. Hình 3.11. Sự phân bố nhân Hình 3.12. Sự phân bố trong mối tương quan giữa nhân trong mối tương quan hình dạng nhân và cường độ giữa diện tích nhân và nhân ở hucMSC cường độ nhân ở hucMSC 3.4.2. Sự thay đổi hình thái tế bào chất
16 Hình 3.13A và 3.13B cho thấy hình thái hucMSC ở hai nhóm vi trọng lực (SMG) và đối chứng đều có dạng thuôn dài đặc trưng của tế bào gốc trung mô. Tuy nhiên màng tế bào chất của các tế bào hucMSC ở nhóm SMG có xu hướng trải rộng ra hơn nhiều so với nhóm đối chứng. Nhận định này được bổ sung bằng kết quả đo diện tích tế bào ở Hình 3.13C, trong đó diện tích trung bình của các tế bào hucMSC ở nhóm SMG là 14083,34 ± 1069,38 µm2, cao hơn so với nhóm đối chứng (11368,67 ± 535.27 µm2) (p ≤ 0,05). Các tế bào hucMSC cũng cho thấy sự sinh trưởng bình thường ở cả hai nhóm khi không phát hiện dấu hiệu của các thể apoptotic nào trong quần thể. Hình 3.13. Hình thái tế bào chất của hucMSC. A, B: Hình thái tế bào chất của hucMSC trong điều kiện bình thường (A) và trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng (B). C: Biểu đồ đánh giá diện tích tế bào ở hucMSC. *: p ≤ 0,05. Thước đo: 223,64 µm. Kết quả ở Hình 3.14 cho thấy giá trị FSC của hucMSC ở nhóm SMG tăng lên với giá trị trung bình là 10803988,58 ± 20960,12, cao hơn so với nhóm đối chứng (9829898,02 ± 206370,30) (p ≤ 0,01). Điều này cho thấy điều kiện vi trọng lực mô phỏng đã làm tăng kích thước tế bào ở tế bào hucMSC.
17 Hình 3.14. Giá trị FSC biểu thị kích thước tế bào ở hucMSC. A, B: Biểu đồ thể hiện giá trị FSC của hucMSC ở nhóm đối chứng (A) và nhóm SMG (B). C: Biểu đồ giá trị FSC trung bình. **: p ≤ 0,01 Kết quả phân tích hình thái tế bào chất cho thấy điều kiện vi trọng lực mô phỏng gây ra những thay đổi về mặt hình thái của hucMSC sau 3 ngày nuôi cấy. Cụ thể là các tế bào trong môi trường vi trọng lực mô phỏng có xu hướng mở rộng diện tích hơn so với ở điều kiện bình thường. 3.5. Đánh giá cấu trúc khung xương tế bào 3.5.1. Biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi Kết quả Realtime qRT-PCR cho thấy hai gene α-tubulin 3 và β- actin giảm mức độ biểu hiện mRNA khi tế bào được nuôi cấy trong môi trường SMG (Hình 3.15). Mức độ biểu hiện của β-actin ở nhóm SMG là 0,60 ± 0,03, thấp hơn hẳn so với nhóm đối chứng là 1,00 ± 0,06 (p ≤ 0,001). Sự thay đổi biểu hiện của α-tubulin 3 càng rõ rệt hơn khi mức độ biểu Hình 3.15. Biểu hiện mức hiện ở nhóm SMG là 0,23 ± 0,03 phiên mã các gene mã hóa vi giảm gần năm lần so với nhóm ống, vi sợi. ***: p ≤ 0,001 đối chứng là 1,00 ± 0,08 (p ≤ 0,001).
18 3.5.2. Biểu hiện mức dịch mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi Kết quả Western Blot đánh giá biểu hiện protein của β-actin ở vi sợi và α-tubulin ở vi ống được thể hiện ở Hình 3.16. Theo đó, protein β-actin giảm biểu hiện mạnh trong môi trường vi trọng lực mô phỏng (SMG). Mức độ biểu hiện của β-actin trong nhóm SMG 0,06 ± 0,01, giảm 16 lần so với nhóm đối chứng (1,00 ± 0,02). Biểu hiện protein của α-tubulin cũng giảm khi mức độ biểu hiện ở nhóm SMG là 0,42 ± 0,01 và ở nhóm đối chứng là 1,00 ± 0,02. Các khác biệt này đều có ý nghĩa thống kê qua phân tích bằng One-way ANOVA (p ≤ 0,001). Hình 3.16. Biểu hiện mức dịch mã các protein cấu trúc vi sợi, vi ống bằng phương pháp Western Blot. ***: p ≤ 0,001 3.5.3. Đánh giá sự tái cấu trúc bộ khung vi ống, vi sợi trong tế bào Kết quả ở Hình 3.17 cho thấy hucMSC ở nhóm đối chứng có mật độ vi ống (tubulin) dày hơn và tập trung nhiều xung quanh nhân. Trong khi đó các bó vi ống ở nhóm vi trọng lực (SMG) có mật độ thấp hơn và trải đều khắp tế bào. Qua quan sát, hucMSC ở nhóm đối chứng có hình dạng giống như nguyên bào sợi với các bó vi ống phân bố song song dọc theo chiều dài tế bào. Cách sắp xếp này không được tìm thấy ở nhóm SMG, thay vào đó là sự phân bố đan xen các bó vi ống trong tế bào chất. Hình 3.18 mô tả sự phân bố song song dọc theo chiều dài tế bào của các bó vi sợi trong nhóm hucMSC đối chứng. Quan sát cho thấy