Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên" được nghiên cứu với mục tiêu: Tuyển chọn, xác định được đặc tính kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên; Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH KHÁNG TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀ TẠO CHẾ PHẨM PHÒNG TRỪ BỆNH RỄ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY HỒ TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – 2022
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS. Nguyễn Anh Dũng Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Lê Thị Ánh Hồng Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201…. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp có giá trị kinh tế và xuất khẩu cao của Việt Nam. Sản lượng hạt tiêu của Việt Nam chiếm tới 40% tổng sản lượng hạt tiêu toàn cầu. Theo quy hoạch đến năm 2020, tầm nhìn đến 2025, diện tích hồ tiêu của cả nước là 50.000 ha, nhưng chỉ trong vài năm gần đây, riêng Tây Nguyên đã có tới gần 93.000 ha, nâng tổng diện tích hồ tiêu cả nước lên 150.000 ha. Năm 2020, xuất khẩu hạt tiêu ước đạt 288 nghìn tấn, trị giá 665 triệu USD, tăng 1,2% về lượng, nhưng giảm 6,8% về trị giá so với cùng kỳ năm 2019 [1]. Trong những năm gần đây, trước tình trạng diện tích hồ tiêu phát triển quá nhanh, nhiều vườn hồ tiêu được đầu tư thâm canh cao độ, dịch bệnh được xem là yếu tố quan trọng hàng đầu dẫn đến việc nhiều vườn tiêu bị phá hủy. Hiện tượng hồ tiêu chết hàng loạt ở nhiều vùng trên cả nước đặc biệt là Tây Nguyên đã ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển bền vững của ngành hồ tiêu Việt Nam. Theo số liệu thống kê, diện tích hồ tiêu đạt cao điểm vào năm 2017 là 151.982 ha, sau đó giảm dần qua từng năm 2018 và 2019 còn 140.000 ha, giảm 11.900 ha qua hai năm do dịch bệnh. Nguyên nhân diện tích giảm do dịch bệnh chủ yếu là bệnh chết nhanh và bệnh vàng lá chết chậm. Bệnh chết nhanh do Phytophthora capsici và bệnh vàng lá chết chậm do tuyến trùng ký sinh thực vật Meloidogyne kết hợp với nấm Fusarium sp. được xem là bệnh rễ phổ biến và nghiêm trọng nhất trên cây hồ tiêu hiện nay [2-8]. Ba biện pháp được sử dụng nhiều nhất trong quản lý bệnh chết nhanh và bệnh vàng lá chết chậm trên cây hồ tiêu gồm sử dụng các giống kháng, biện pháp canh tác và dùng các thuốc hóa học để diệt nấm [9-11]. Tuy nhiên, việc sử dụng các thuốc hoá học diệt nấm, tuyến trùng sẽ gây ô 1
nhiễm môi trường, giảm chất lượng sản phẩm, giảm sự đa dạng vi sinh vật đất và tăng sự đề kháng của tác nhân gây bệnh [12]. Gần đây, các nghiên cứu sử dụng các tác nhân kiểm soát sinh học thân thiện với môi trường đang được ưu tiên hàng đầu trong các chương trình quản lý dịch hại tổng hợp nhằm thay thế cho hóa chất nông nghiệp. Các tác nhân kiểm soát sinh học như nấm đối kháng, vi khuẩn nội sinh, vùng rễ kháng nấm bệnh, tuyến trùng và kích thích sinh trưởng bộ rễ [13-14]. Trong đó, vi khuẩn vùng rễ (Rhizobacteria) kháng nấm bệnh, kháng tuyến trùng và thúc đẩy sinh trưởng thực vật đang được nhiều nghiên cứu quan tâm [15- 17]. Vi khuẩn vùng rễ cạnh tranh với vi sinh vật gây bệnh tại vùng rễ để làm giảm nguồn bệnh phát sinh từ đất và thúc đẩy sinh trưởng ở thực vật một cách trực tiếp dựa trên hoạt tính cố định N, phân giải P khó tan và sinh tổng hợp IAA. Sử dụng vi khuẩn vùng rễ làm chế phẩm vi sinh được coi là xu hướng trong tương lai vì nó làm giảm đáng kể việc sử dụng hóa chất, phân bón hoá học từ đó góp phần làm tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, góp phần phát triển hồ tiêu một cách bền vững [3], [18-26]. Hướng nghiên cứu về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đến khả năng sinh trưởng và kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu còn được ít quan tâm ở Việt Nam và chưa có nghiên cứu nào một cách hệ thống trên cây hồ tiêu ở khu vực Tây Nguyên. Vì vậy, đề tài nghiên cứu “Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên” là rất cần thiết. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Tuyển chọn, xác định được đặc tính kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên. 2
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án 1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên. 2. Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn. 3. Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm và tuyến trùng từ các chủng vi khuẩn tuyển chọn. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu 1.1.1. Vị trí phân loại Hồ tiêu có tên khoa học là Piper nigrum L., thuộc giới Plantae, lớp Equisetopsida, bộ Piperales, họ Piperaceae. 1.1.2. Đặc điểm thực vật học cây hồ tiêu 1.2. Thực trạng sản xuất hồ tiêu của Việt Nam và các tỉnh Tây Nguyên 1.2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu ở các tỉnh Tây Nguyên Đắk Lắk: Diện tích hồ tiêu năm 2019 là 36.396 ha (bảng 1.2). Năm 2020 diện tích hồ tiêu là 34.500 ha giảm 1.896 ha so với năm 2019, sản lượng 75.818 tấn, tăng 1.696 tấn so với năm 2019 [31]; Đắk Nông: Diện tích hồ tiêu năm 2019 là 32.286 ha (bảng 1.2), tăng lên 34.957 ha (năm 2020), sản lượng đạt 44.750 tấn [30]; Gia Lai: Năm 2019, diện tích hồ tiêu toàn tỉnh đạt 13.731 ha, tuy nhiên đến năm 2020, diện tích hồ tiêu toàn tỉnh đạt 14.682 ha, sản lượng đạt 45.287 tấn [30]. 3
1.2.2. Tình hình sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu ở Tây Nguyên Đắk Lắk: Năm 2020, bệnh vàng lá chết chậm có diện tích nhiễm là 86,8 ha (giảm 423,8 ha so với năm 2019); Bệnh chết nhanh có diện tích nhiễm là 20,3 ha (giảm 766,3 so với năm 2019) [31]; Đắk Nông: Năm 2018, Diện tích nhiễm bệnh chết chậm là 1.289,9 ha, diện tích nhiễm bệnh chết nhanh là 1.026,4 ha và diện tích nhiễm bệnh đen lá là 352.6 ha [32]; Gia Lai: Năm 2020, bệnh vàng lá chết chậm có diện tích nhiễm là 2.281,2 ha (giảm 639 ha so với năm 2019); Bệnh chết nhanh có diện tích nhiễm là 244,7 ha (giảm 1.007,2 so với năm 2019) [33]. 1.3. Bệnh hại rễ cây hồ tiêu Hai loại bệnh hại rễ chính trên cây hồ tiêu bao gồm bệnh chết nhanh do Phytophthora sp. và bệnh vàng lá chết chậm do tuyến trùng kết hợp với nấm Fusarium. Phytophthora sp. là một trong những loại nấm gây hại chính ở rễ tiêu. Quá trình xâm nhập hại rễ và gốc thân diễn ra ở trong đất, tương đối khó theo dõi và phát hiện. Nấm có thể tấn công bất kỳ vị trí nào ở gốc thân và rễ tạo thành vết biến màu và ướt, dần dần vết bệnh ngày càng lan rộng. Tuyến trùng là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng suy thoái về chất dinh dưỡng và gây thiệt hại nghiêm trọng đối với hầu hết các loại cây trồng. Sau khi nở từ trứng, tuyến trùng non xâm nhập vào hệ thống rễ cây đang phát triển, sử dụng các chất dinh dưỡng từ cây và làm hư hại bộ rễ tạo điều kiện cho các sinh vật có hại trong đất tấn công vào bộ rễ. Tuyến trùng Meloidogyne có quan hệ mật thiết với nấm Fusarium. Tuyến trùng chích hút, tạo vết thương vùng rễ tiêu và tạo cơ hội cho nấm Fusarium tấn công rễ, gây bệnh cho cây hồ tiêu. 1.4. Các giải pháp tổng hợp để kiểm soát dịch bệnh trên cây hồ tiêu và sản xuất bền vững Hiện tại không có biện pháp đơn lẻ nào có thể phòng trừ bệnh chết 4
nhanh, chết chậm một cách hiệu. Vì vậy, quản lý bệnh hại tổng hợp là cách duy nhất để hạn chế tác hại của bệnh gây ra. Kiểm soát sinh học là biện pháp đem lại hiệu quả nhất để vượt qua áp lực trong kiểm soát bệnh ở thực vật với mục đích bảo vệ cây trồng an toàn hơn. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh vi khuẩn vùng rễ (PGPR) có khả năng kiểm soát bệnh đồng thời kích thích sinh trưởng ở thực vật. 1.5. Vai trò của các chủng vi khuẩn vùng rễ trong kiểm soát sinh học 1.5.1. Vùng rễ và vi sinh vật vùng rễ Lớp đất mỏng bao quanh rễ cây đóng vai trò cực kỳ quan trọng và tích cực cho hoạt động của rễ và sự trao đổi chất được gọi là rhizosphere. Trong vùng rễ, quần thể vi sinh vật có thể dao động từ vài nghìn đến hàng triệu tế bào. Tương tác giữa vi sinh vật vùng rễ và thực vật mang lại nhiều tác động có lợi đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật của thực vật, ức chế bệnh, tăng sức đề kháng đối với stress phi sinh học và sinh học. Một số lượng lớn các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh và tảo cùng tồn tại trong rhizosphere. 1.5.2. Sự phân bố của vi khuẩn vùng rễ Các vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật ngoại bào sống ở vùng rễ, trên rễ hoặc trong khoảng không gian giữa các tế bào rễ. Nhóm này bao gồm các chi Agrobacterium, Arthrobacter, Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Caulobacter, Chromobacterium, Erwinia, Flavobacterium, Micrococcous, Pseudomonas và Serratia. 1.5.2. Cơ chế kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu của vi khuẩn vùng rễ Cơ chế trực tiếp bao gồm sản xuất kháng sinh, enzyme và gây kích kháng hệ thống của thực vật. Cơ chế gián tiếp: Vi sinh vật vùng rễ thúc đẩy sinh trưởng thực vật 5
bằng cách sản xuất các phytohormone (auxins, cytokines, ethylene, và các hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác) và siderophore, cải thiện sự hấp thu / sẵn có chất dinh dưỡng cho cây bằng cách cố định đạm, hòa tan phốt phát và khoáng hóa các hợp chất hữu cơ. 1.6. Tình hình nghiên cứu hiện nay về vi sinh vật vùng rễ kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu 1.6.1. Trên thế giới Theo Li và cộng sự (2016) tất cả các thành phần dinh dưỡng của đất và các chỉ số đa dạng vi sinh vật trong đất tại vùng rễ cây hồ tiêu đều cao hơn so với đất không phải tại vùng rễ. Các vi sinh vật tại vùng rễ trong đó có vi khuẩn vùng rễ được xem là đối tượng lý tưởng để sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học. Vùng rễ như là tuyến đầu bảo vệ cho rễ chống lại sự tấn công của mầm bệnh. Nhiều nghiên cứu khác nhau được tiến hành nhằm đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh cũng như tuyến trùng sần rễ (Meloidogyne sp.) của các chủng vi sinh vật vùng rễ đặc biệt là chi Bacillus và Pseudomonas trên nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có cây hồ tiêu trong điều kiện in vitro cũng như trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng (Diby, 2005, Dinu, 2007, Aravind, 2010, Yu, 2011, Ann, 2012, Zhang, 2016, Toh, 2016 và Senthikumar 2018). 1.3.2. Trong nước Gần đây, do tình hình dịch bệnh gây hại nghiêm trọng trên các diện tích hồ tiêu đã có một số nghiên cứu về xác định các đối tượng gây hại, nghiên cứu canh tác bền vững và tình hình sử dụng các giống hồ tiêu hiện nay ở Việt Nam. Tuy nhiên, hướng nghiên cứu về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đến khả năng sinh trưởng và kháng Phytophthora sp., Fusarium sp. và tuyến trùng Meloidogyne sp. đang còn ít được quan tâm và chưa tiến hành một cách hệ thống trên cây hồ 6
tiêu ở khu vực Tây Nguyên. Vì vậy, nghiên cứu được tiến hành nhằm giải quyết vấn đề này. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Vật liệu nghiên cứu + Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại 3 tỉnh Tây Nguyên bao gồm Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông. + Các chủng vi khuẩn đã được phân lập từ vùng rễ của cây hồ tiêu. + Nấm bệnh Phytophthora capsici. và Fusarium oxysporium. do Viện CNSH&MT, trường Đại học Tây Nguyên cung cấp, đã được định danh và bảo quản trong glycerol ở nhiệt độ -80oC. + Tuyến trùng Meloidogyne sp. được thu nhận trực tiếp từ rễ cây hồ tiêu bị u sưng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên * Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu rễ cây hồ tiêu: Mẫu rễ được thu ở các vườn hồ tiêu sinh trưởng khỏe, năng suất cao, ổn định, ít bị bệnh rễ hoặc tại các cây tiêu khỏe mạnh trên vườn tiêu bệnh. Thu rễ ở cây hồ tiêu 3 đến 10 năm tuổi. Chọn mẫu rễ non và rễ tơ vì đây là nơi có nhiều vi sinh vật tập trung. Thu rễ phần rìa ngoài cách trụ tiêu bán kính khoảng 1,0 - 1,5 m; độ sâu rễ từ 10 - 20 cm, lấy khoảng 10 cm từ đầu nút của rễ vào. Mẫu rễ sau đó sẽ được giữ trong túi polyethylen vô trùng, chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập ngay. Nếu chưa kịp xử lý, cần bảo quản trong tủ lạnh ở 5 oC cho đến khi tiến hành phân lập. 7
* Phân lập các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu: Phương pháp phân lập vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu được thực hiện theo qui trình của White (2015) có cải tiến cho phù hợp với đối tượng cây trồng. Phương pháp quan sát và mô tả đặc điểm hình thái vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 2009): Mô tả các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn và làm tiêu bản tế bào quan sát trên kính hiển vi. * Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu trong điều kiện in vitro: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng nấm Phytophthora và Fusarium trong điều kiện in vitro theo phương pháp của của Toh và cộng sự (2016) và Dinu và cộng sự (2007). Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng trong điều kiện in vitro được thực hiện theo phương pháp của Aravind cải tiến (2010). * Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu trong điều kiện vườn ươm + Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ có tiềm năng kháng Phytophthora capsici trong điều kiện vườn ươm: Chuẩn bị cây hồ tiêu giống có 4-5 lá. Chuẩn bị tế bào vi khuẩn đạt mật độ 107 CFU/ ml được coi là dịch khuẩn gốc, Phytophthora với mật độ đạt 107CFU/ml được coi là dịch gốc. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo được tiến hành trong nhà lưới, thí nghiệm được bố trí theo kiểu đầy đủ ngẫu nhiên. Tổng số cây thí nghiệm: 9 nghiệm thức (7 nghiệm thức xử lý với các chủng vi khuẩn RB.CS1, RB.CP15, RB.DS29, RB.EK2, RB.EK4, RB.BH15 và RB.CJ35, 2 nghiệm thức đối chứng) x 15 cây/nghiệm thức x 3 lần nhắc lại = 405 cây. Chỉ tiêu theo dõi: Các chỉ tiêu sinh trưởng bao gồm số lá/ cây, chiều cao cây (cm), đường kính thân (mm), khôi lượng tươi 8
của cây (g), Khối lượng rễ tươi (g), chiều dài rễ (cm), hàm lượng diệp lục tố (mg/g). Các chỉ tiêu về bệnh bao gồm: tỉ lệ rễ bệnh, tỉ lệ chết và mật độ Phytophthora trong đất. + Tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng kháng nấm Fusarium trên cây hồ tiêu con trong điều kiện vườn ươm: Chuẩn bị, bố trí thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi tương tự như thực hiện đối với Phytophthora. Thí nghiệm có 8 nghiệm thức (6 nghiệm thức xử lý với vi khuẩn bao gồm RB.DC16, RB.EK2, RB.CJ4, RB.CJ41, RB.CJ12, RB.CJ27 và 2 nghiệm thức đối chứng) x 15 cây/ nghiệm thức x 3 lần nhắc lại = 360 cây. + Tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng tuyến trùng trên cây hồ tiêu con trong điều kiện vườn ươm: Chuẩn bị thí nghiệm tương tự như thực hiện đối với Phytophthora. Thí nghiệm có 8 nghiệm thức (6 nghiệm thức xử lý với vi khuẩn bao gồm RB.BH11, RB.EK2, RB.CJ4, RB.CS30, RB.DS33, RB.EK7 và 2 nghiệm thức đối chứng), 10 cây/ nghiệm thức x 3 lần nhắc lại = 240 cây. Chủng nhiễm 350 tuyến trùng/ lần/ 3 lần, mỗi lần cách nhau 5 ngày vào mỗi bầu. Các chỉ tiêu theo dõi: Chỉ tiêu sinh trưởng tương tự như thực hiện đối với Phytophthora. Chỉ tiêu về bệnh bao gồm số u sưng, tỷ lệ rễ u sưng, mật độ tuyến trùng trong đất (con/50g đất), mật độ tuyến trùng trong rễ (con/5g rễ) của cây hồ tiêu vườn ươm. * Định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu Chủng có khả năng đối kháng cao nhất với Phytophthora, Fusarium và tuyến trùng trong điều kiện vườn ươm được gửi Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh để định danh sinh hóa và sinh học phân tử. 9
2.2.2. Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn * Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn: Phương pháp nghiên cứu điều kiện nhân nuôi được thực hiện với các yếu tố một cách tuần tự bao gồm môi trường, pH, thời gian, nhiệt độ, tốc độ lắc. Kết quả nghiên cứu của yếu tố trước sẽ được sử dụng trong nghiên cứu yếu tố tiếp theo. * Phương pháp xác định đặc tính kháng nấm Phytopthora, Fusarium và tuyến trùng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn + Xác định đặc tính kháng nấm nấm Phytopthora, Fusarium của các chủng vi khuẩn tuyển chọn: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung bào tử Phytophthora, Fusarium, casein, chitin, β-glucan đến khả năng ức chế nấm Phytophthora, Fusarium được thực hiện bằng cách trải dịch lọc trên đĩa môi trường PGA và cấy Phytophthora, Fusarium vào giữa. Chỉ tiêu theo dõi: đường kính tản nấm bệnh; Xác định thành phần hóa học trong dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn vùng rễ khả năng kháng Phytophthora/Fusarium bằng phân tích LC-MS và GC-MS: được gửi phân tích tại Phòng phân tích trung tâm, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh. +Xác định đặc tính kháng tuyến trùng của chủng vi khuẩn tuyển chọn: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, casein, chitin đến khả năng kháng tuyến trùng: được thực hiện với 200 μl dịch nuôi cấy bổ sung khoảng 30 tuyến trùng theo dõi số tuyến trùng chết trong các ống eppendorf ở các thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Sử dụng môi trường và nước cất làm đối chứng. Xác định thành phần hóa học trong dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng bằng phân tích LC-MS VÀ GC-MS: 10
được gửi phân tích tại Phòng phân tích trung tâm, Trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh. * Phân tách, xác định cấu trúc và hoạt tính kháng tuyến trùng, kháng nấm của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi sinh vật tuyển chọn Dịch nuôi cấy của chủng RB.EK7 trong điều kiện thích hợp sau khi loại bỏ vi khuẩn được cô cạn đạt khối lượng 199 g tiến hành trích ly rắn lỏng với các dung môi, hệ dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate, ethyl acetate: methanol (90:10), ethyl acetate: methanol (60 :40), methanol thu được các dịch trích ly và được cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, thu được các loại cao. Cao chiết thô được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng tuyến trùng trong điều kiện in vitro. Các cao chiết thô có hoạt tính kháng cao, khối lượng nhiều được phân tách, tinh sạch và xác định cấu trúc bằng các phổ NMR, HMBC và HSQC tại phòng Phân tích Trung tâm, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh. Các hợp chất tinh sạch được xác định hoạt tính kháng tuyến trùng, kháng Phytophthora và nấm Fusarium. 2.2.3. Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm và tuyến trùng từ các chủng vi khuẩn tuyển chọn Dung dịch vi khuẩn được nuôi cấy trong bioreactor 15 L (Bioflo, NewBrunswick Bioflo, Eppendoft, USA) sử dụng làm chế phẩm cùng các vật liệu phụ gia khác nhau. Chỉ tiêu theo dõi: Xác định mật độ vi khuẩn và hoạt tính trong thời gian 06 tháng bảo quản. 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm xử lý thống kê SAS 9.1. 11
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên Luận án đã phân lập và mô tả hình thái 269 chủng vi khuẩn vùng rễ; trong đó Đắk Lắk 120 chủng, Gia Lai 72 chủng và Đắk Nông 77 chủng. Các chủng chủ yếu được phân lập tại tại vùng rễ của hồ tiêu giống Vĩnh Linh trên nền đất đỏ bazan và được sử dụng làm vật liệu cho các nghiên cứu tuyển chọn tiếp theo. 3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu trong điều kiện in vitro Tuyển chọn được 07 chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng Phytophthora cao bao gồm RB.BH15, RB.EK2, RB.CP15, RB.CJ35, RB.CS1, RB.EK4 và RB. DS29 với hiệu suất đối kháng nấm từ 62,67% đến 65,33%. Tuyển chọn được 06 chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng nấm Fusarium bao gồm RB.DC16, RB.EK2, RB.CP15, RB.CJ35, RB.CS1, RB.EK4 và RB. CJ27 với hiệu suất đối kháng nấm từ 41,25% đến 66,25%. Tuyển chọn được 06 chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng Meloidogyne sp. cao là RB.EK7, RB.CJ4, RB.EK2, RB.DS33, RB.BH11, RB.CS30 với tỷ lệ tử vong trên 90%. 12
3.1.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu trong điều kiện vườn ươm 3.1.2.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ có tiềm năng kháng n Phytophthora capsici trong điều kiện vườn ươm Kết quả bảng 3.8 cho thấy các chủng vi khuẩn tuyển chọn đều ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng của cây hồ tiêu trong vườn ươm và tỷ lệ bệnh rễ giảm từ 23,68% (ĐC2) xuống 14-16%, tỷ lệ chết giảm từ 33,3% (ĐC2) xuống 9,0-26,6% và mật độ nấm Phytophhtora trong đất giảm từ 17,10 x101 CFU/g xuống 2,12 – 16,80 x101 CFU/g ở các công thức có xử lý chủng. Trong bảy chủng thử nghiệm, chủng RB.DS29 có hoạt tính vượt trội hơn so với các chủng còn lại. Vì vậy, chủng này được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn vùng rễ đến một số chỉ tiêu sinh trưởng và kháng bệnh của cây hồ tiêu sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora Mật độ Nghiệm Chiều cao cây Số rễ Tỷ lệ rễ bệnh (%) Tỷ lệ chết (%) Phytophthora thức (cm) (x101 CFU/g) a a b bc RB.EK4 41,30±4,99 4,67±0,59 16,00±0,03 20,00±0,07 2,12 RB.CJ35 31,50±9,34ab 3,33±0,64bc 24,33±0,13a 37,67±0,04a 4,76 RB.EK2 33,90±5,26ab 4,67±0,07a 15,67±0,02b 13,00±0,04cd 11,00 RB.CP15 35,40±8,65ab 4,33±0,30ab 15,67±0,05b 26,67±0,07ab 2,03 RB.DS29 42,80±3,49a 5,00±0,37a 14,33±0,03bc 9,00±0,04cd 10,50 RB.CS1 32,70±6,42ab 4,00±1,12ab 16,33±0,06b 33,33±0,07ab 16,80 RB.BH15 38,70±6,71a 5,00±1,17a 15,33±0,01b 11,00±0,04cd 8,02 ĐC 1 29,37±8,31ab 4,33±0,54ab 11,33±0,10b 4,33±0,08d 2,34 ĐC2 19,33±7,49b 2,33±0,89c 23,68±0,22a 33,33±0,07ab 17,10 P ** * ** ** CV% 1,09 1,09 11,17 25,32 Ghi chú: ĐC1: Đối chứng không lây nhiễm tiêu con với Phytophthora sp.; ĐC2: lây nhiễm nấm Phytophthora sp. * Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 13
p
ĐC2: bổ sung Fusarium. * Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p
khi xử lý thống kê.; ** Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p
3.2. Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng Phytophthora/Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn 3.2.1. Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn Đã nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để nhân nuôi các chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn trong điều kiện in vitro như sau: Chủng RB.DS29 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong môi trường LB có pH = 7, thời gian nhân giống là 24 giờ, lên men 8 giờ, ở nhiệt độ là 35oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Chủng RB.CJ41 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong điều kiện môi trường có thành phần (D-glucose 2 g/l, Pepton 3 g/l, cao thịt 5 g/l (NH4)2SO4 4 g/l, MgSO4 0,5 g/l, pH 6,5, nhiệt độ 37oC, thời gian nhân giống 36 giờ, thời gian lên men 6 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Chủng RB.EK7 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong điều kiện môi trường M2 có thành phần D-glucose 2 g/l, Pepton 3 g/l, (NH4)2SO4 4 g/l, cao nấm men 5 g/l, KH2PO4 6 g/l, pH 7, nhiệt độ 37 oC, thời gian nhân giống 24 giờ, thời gian lên men 10 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút. 3.2.2. Xác định đặc tính kháng Phytophthora, Fusarium của chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.2.2.1. Xác định đặc tính kháng nấm Phytopthora của chủng vi khuẩn tuyển chọn Thành tế bào Phytophthora có chứa chitin, protease và tới 90% β- glucan nên sẽ bị các enzyme phân giải do vi khuẩn tổng hợp phá hủy. Mặt khác, việc bổ sung bào tử nấm cũng có thể coi là chất cảm ứng để vi khuẩn tổng hợp enzyme và một số hợp chất khác. Kết quả bảng 3.23 cho thấy Ở nghiệm thức MT + bào tử Phytophthora có hiệu suất đối kháng cao nhất (24,2%) gấp từ 1,32 17
đến 5,9 lần so với nghiệm thức MT+ chitin (16,7%), MT + β-glucan (10,7%), MT + casein (18,3%). Khi bất hoạt các dịch nuôi cấy bổ sung chất cảm ứng (100 oC trong 1 giờ), hiệu suất đối kháng nấm của các nghiệm thức giảm từ 2,3% - 10,8% (MT + bào tử Phytophthora). Điều này chứng tỏ, hoạt tính kháng nấm Phytophthora của chủng RB.DS29 có thể do enzyme cũng như các hợp chất thứ cấp tác động. Bảng 3.23. Khả năng ức chế nấm bệnh của các dịch nuôi cấy chủng RB.DS29 Hoạt tính Hoạt Hoạt tính HSĐK HSĐK (%) enzyme tính enzyme β- (%) dịch dịch nuôi Nghiệm thức protease enzyme glucanase nuôi cấy cấy bất (UI/ml) chitinase (UI/ml) không hoạt (UI/ml) bất hoạt MT - - - 4,1±1,44d 2,5±0,00b MT + bào tử 0,08±0,01 2,74±0,05 0,03±0,01 24,2±0,76a 10,8±0,76a Phytophthora MT + casein 0,14±0,02 - - 18,3±1,76b 2,3±1,44b MT + chitin - 3,23±0,04 - 16,7±0,76b 4,2±1,50b MT + β- - - 0,07±0,01 10,7±1,04c 2,5±1,44b glucan CV% 10,7 18,5 P ** ** Ghi chú: HSĐK: hiệu suất đối kháng (%); MT: môi trường. Các chữ cái giống nhau trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Rang Test; ** Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p