Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

11
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam" được hoàn thành với mục tiêu nhằm thiết lập chất chuẩn gốc darutosid và CO1; Ứng dụng chất chuẩn thiết lập được xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời darutosid và kirenol trong dược liệu Hy thiêm; định tính, định lượng CO1 trong dược liệu nụ Vối, lá Vối.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ DƯỢC LIỆU ĐỂ GÓP PHẦN HOÀN THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM Chuyên nghành : Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã số : 9720210 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2023
Công trình được hoàn thành tại: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phương Thiện Thương TS. Nguyễn Thị Liên Phản biện 1:………………………………………… Phản biện 2:………………………………………… Phản biện 3:………………………………………… Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp tại: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Vào hồi:…………giờ……..ngày………..tháng ……năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Dược liệu đóng vai trò quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe con người. Tổ chức y tế thế giới ước tính khoảng 80% dân số trên thế giới hiện nay có sử dụng dược liệu trong chăm sóc sức khỏe. Những thập kỷ gần đây xu thế quay trở lại sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày càng phổ biến làm tăng đáng kể nhu cầu về dược liệu trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, “Chiến lược quốc gia phát triển ngành Dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” theo quyết định số 68/QĐ-TTg ngày 10/01/2014 và “Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030” theo quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 của Thủ tướng Chính phủ hướng đến tăng tỷ lệ thuốc sản xuất trong nước lên 80%, trong đó thuốc từ dược liệu chiếm 30%; 100% nguyên liệu sản xuất thuốc dược liệu được tiêu chuẩn hóa. Hy thiêm Siegesbeckia orientalis (L.) thuộc họ Cúc – Asteraceae và Vối Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim – Myrtaceae được coi là các vị thuốc quý, được nhân dân ta sử dụng lâu đời. Đây cũng là các vị thuốc đã được đưa vào DĐVN V, danh mục thuốc thiết yếu. Tuy nhiên các chuyên luận trong DĐVN V còn đơn giản, chưa có định tính, định lượng các chất đánh dấu như xu hướng chung. Vối chưa thấy được đưa vào Dược điển các nước, trong khi Hy thiêm đã được đưa vào Dược điển Hồng Kông và Trung Quốc với yêu cầu định lượng chất đánh dấu kirenol bằng HPLC. Tuy nhiên một số nghiên cứu chỉ ra rằng Hy thiêm Việt Nam không chứa hoặc chứa rất ít kirenol, trong khi chứa một lượng đáng kể darutosid một diterpenoid được chứng minh có tác dụng tương đương kirenol trong chống viêm, làm lành vết thương. Một số nghiên cứu chỉ ra 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′- dimethylchalcon (CO1) là thành phần flavonoid chính trong Vối, được chứng minh có tác dụng chống viêm, phục hồi tế bào gan, làm giảm hấp thu glucose trên tế bào cơ và tế bào tạo mỡ nuôi cấy. Xuất phát từ thực tế đó luận án “Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam” được thực hiện với một số mục tiêu nghiên cứu như sau: 1
- Chiết xuất, phân lập, tinh chế từ dược liệu Hy Thiêm hợp chất darutosid, từ Vối hợp chất CO1 đủ tinh khiết và đủ khối lượng để thiết lập chất chuẩn gốc. - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn darutosid và CO1 tinh chế được. - Thiết lập chất chuẩn gốc darutosid và CO1 - Ứng dụng chất chuẩn thiết lập được xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời darutosid và kirenol trong dược liệu Hy thiêm; định tính, định lượng CO1 trong dược liệu nụ Vối, lá Vối. 2. Những đóng góp mới của luận án Đã xây dựng được quy trình chiết xuất, tinh chế darutosid hàm lượng trên 95% từ Hy thiêm ở quy mô >10 kg/mẻ. - Đã xây dựng được quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế CO1 hàm lượng trên 95% từ nụ Vối ở quy mô >10 kg/mẻ. - Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu darutosid dùng cho thiết lập chất chuẩn gốc. - Đã xây dựng thường quy kỹ thuật và thực hiện thiết lập 90 lọ chất chuẩn gốc darutosid hàm lượng 95,16 ± 0,05% theo nguyên trạng. Theo dõi độ ổn định trong 9 tháng. - Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu CO1 dùng cho thiết lập chất chuẩn gốc. - Đã xây dựng thường quy kỹ thuật và thực hiện thiết lập 80 lọ chất chuẩn gốc CO1 hàm lượng 96,52 ± 0,05% theo nguyên trạng. Theo dõi độ ổn định trong 30 tháng. - Đã xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC. - Đã xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng CO1 trong nụ Vối và trong lá Vối bằng HPLC. 3. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 131 trang, 41 hình và 49 bảng. Bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (29 trang); Đối tượng nội dung và phương pháp nghiên cứu (15 trang); Kết quả nghiên cứu (64 trang); Bàn luận (20 trang); Kết luận và kiến nghị (1 trang); Danh mục các công trình đã công bố liên quan điến luận án (1 trang); Luận án có 103 tài liệu tham khảo và 289 trang phụ lục. 2
NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Đã tổng quan được các nội dung chính liên quan đến luận án gồm có: - Vai trò của chất chuẩn trong kiểm nghiệm dược liệu và sản phẩm từ dược liệu. Hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới về lựa chọn chất đánh dấu trong dược liệu. - Tổng quan về đối tượng nghiên cứu dược liệu Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., có tài liệu là Sigesbeckia orientalis L.) và dược liệu Vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry): vị trí phân loại, đặc điểm thực vật học và phân bố, thành phần hóa học, tác dụng sinh học, tiêu chuẩn hóa chất lượng. - Từ tổng quan trên, định hướng lựa chọn chất đánh dấu darutosid trong KTCL dược liệu Hy thiêm và CO1 trong KTCL dược liệu Vối và. - Tổng quan về chiết xuất, phân lập, tinh chế darutosid và CO1 từ Hy thiêm và Vối. - Tổng quan về chất chuẩn: khái niệm và phân loại chất chuẩn hóa học gồm: chất chuẩn hóa học gốc (PCRS) và chất chuẩn hóa học thứ cấp (SCRS). Khái niệm về chất đánh dấu sử dụng trong kiểm nghiệm dược liệu, yêu cầu về chất lượng, độ tinh khiết. Tổng quan về hướng dẫn về thiết lập chất chuẩn theo ISO 17034 và ISO Guide 35. - Tổng quan về xác định các đặc tính (characterization) của chất chuẩn gốc hóa học: Theo hướng dẫn của Int’P, EP, USP, WHO các chỉ tiêu xác định đặc tính của chất chuẩn gốc gồm bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc: cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, bộ phổ IR, NMR, MS, UV…; xác định độ tinh khiết chất chuẩn gốc hóa học bằng phương pháp cân bằng khối lượng: xác định tạp chất liên quan bằng kỹ thuật HPLC/DAD, xác định tạp chất vô cơ bằng phương pháp cắn sau nung hay tro sulfat, xác định hàm lượng tạp chất bay hơi bằng mất khối lượng do làm khô hoặc phân tích nhiệt lượng TGA; xác định độ tinh khiết trực tiếp với hợp chất dạng tinh thể bằng kỹ thuật DSC. Xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo theo ISO Guide 35, ISO 13528 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 3
08 mẫu dược liệu Hy thiêm, 08 mẫu dược liệu nụ Vối và 08 mẫu dược liệu lá Vối được thu hái ở các địa phương và thời điểm khác nhau. Bảng 2.1. Mẫu Dược liệu Hy thiêm dùng trong nghiên cứu Hy thiêm Địa điểm, thời gian thu hái HT1 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 6/2019 HT2 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 5/2020 (Vùng trồng của Công ty CP Dược VTYT Thanh Hóa) Đã được định danh tại Viện Dược liệu - Phụ lục 1 HT3 Thành phố Thanh Hóa, tháng 4/2020 (Trung tâm nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ) HT4 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 5/2021 (Vùng trồng của Công ty CP Dược VTYT Thanh Hóa) HT5 Thành phố Thanh Hóa, tháng 5/2021 (Trung tâm nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ) HT6 Huyện Thạch Hà – Hà Tĩnh, tháng 6/2020 HT7 Thành phố Hòa Bình, tháng 6/2021 HT8 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 5/2022 (Vùng trồng của Công ty CP Dược VTYT Thanh Hóa) Bảng 2.2. Mẫu Dược liệu nụ Vối và lá Vối dùng trong nghiên cứu Lá Vối Nụ Vối Địa điểm, thời gian thu hái LV1 NV1 Thành phố Bắc Giang, tháng 5/2021 LV2 NV2 Thành phố Hưng Yên, tháng 4/2019 LV3 NV3 Huyện Cẩm Xuyên - Hà Tĩnh, tháng 4/2021 LV4 NV4 Thành phố Yên Bái, tháng 4/2020 LV5 NV5 Thành phố Thanh Hóa, tháng 5/2019 Đã được định danh tại Viện Dược liệu LV 6 NV6 Huyện Đà Bắc, Hòa Bình, tháng 4/2019 LV 7 NV 7 Huyện Lý Nhân, Hà Nam, tháng 4/2019 LV 8 NV 8 Thành phố Cao Bằng, tháng 5/2020 2.2. HOÁ CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ 2.2.1. Hoá chất - Hoá chất, dung môi để chiết xuất, phân lập, tinh chế đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. Hoá chất, dung môi đạt tiêu chuẩn cho chạy HPLC và NMR. - Kirenol: chất chuẩn Dược điển Trung Quốc, hàm lượng: 100%, SKS: 111726-200601 - Silica gel (cỡ hạt 40-63 µm; 63-200 µm) pha thuận và pha đảo RP18. - Cột sắc ký HPLC RP 18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu 4
- Thiết bị nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và phân tích của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Dược liệu, Viện KHCN Việt Nam - Hàn Quốc, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam. 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: - Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc chất darutosid từ Hy thiêm và CO1 từ nụ Vối và làm nguyên liệu thiết lập chuẩn. - Xây dựng bộ dữ liệu phổ nhận dạng các các chất darutosid và CO1: nhiệt độ nóng chảy, phổ UV, IR, MS, NMR. - Xây dựng phương pháp xác định tạp chất hữu cơ, vô cơ và tạp chất bay hơi của các chất darutosid và CO1. - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng darutosid và CO1. - Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng darutosid và CO1. - Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng darutosid trong Hy thiêm; CO1 trong nụ Vối và lá Vối. - Áp dụng phương pháp đã xây dựng định tính, định lượng darutosid trong 08 mẫu Hy thiêm; CO1 trong 08 mẫu nụ Vối, 08 mẫu lá Vối. 2.3.1. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc của chất tinh khiết - Chiết xuất bằng cách ngâm lạnh với ethanol 96%. Dịch chiết được cất thu hồi dung môi, phân tán lại trong nước và lắc phân đoạn với các dung môi n- hexan, ethyl acetat. Thu được cao ethyl acetat. - Phân lập các chất bằng sắc ký cột cổ điển nhồi silica gel pha thuận và pha đảo RP18 gradient dung môi. - Tinh chế các chất tinh khiết bằng sắc ký cột cổ điển nhồi hạt Silica gel pha đảo RP18 (với chất darutosid) và sắc ký lỏng điều chế (với chất CO1) gradient dung môi. - Xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn bằng HPLC/DAD sử dụng phương pháp chuẩn hoá diện tích. - Xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều (1H- NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ hồng ngoại (IR). 2.3.2. Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng - Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng các chất tinh khiết làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn: Phổ 1H NMR, 13C NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, nhiệt độ nóng chảy,… 5
- Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan (TCLQ) bằng HPLC/DAD, phương pháp xác định hàm lượng tạp chất vô cơ bằng phép thử tro sulfat và tạp chất bay hơi bằng TGA - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng - Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng  Đóng ống chất chuẩn, dán nhãn và bảo quản ống chuẩn, nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn theo hướng dẫn ISO Guide 35  Đánh giá độ đồng nhất trong quá trình đóng ống  Xác định độ tinh khiết sắc kí bằng HPLC/DAD tại 3 PTN đạt tiêu chuẩn GLP và ISO 17025 (Khoa Vật lý đo lường – Cơ sở 1 và Khoa Thiết lập chất chuẩn, Khoa Nghiên cứu phát triển – Cơ sở 2, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương). Mỗi PTN nhận 6 ống chất chuẩn lấy ngẫu nhiên cùng tiêu chuẩn cơ sở để tiến hành phân tích TCLQ. Tập hợp các kết quả của ba PTN tham gia (n = 18), đánh giá kết quả bằng test ANOVA một yếu tố, so sánh 2 giá trị Ftn và Ftb. Khi Ftn < Ftb, kết quả trung bình của 3 PTN khác nhau không có ý nghĩa, giá trị TCLQ được lấy từ kết quả trung bình của 3 PTN.  Độ tinh khiết sắc kí (%) = 100 (%) – hàm lượng TCLQ (%)  Xác định tạp bay hơi bằng TGA, tạp vô cơ bằng phương pháp tro sulfat  Xác định giá trị ấn định công bố trên phiếu kiểm nghiệm COA bằng phương pháp cân bằng khối lượng (mass-balance): Độ tinh khiết = Độ tinh khiết sắc kí × (100- % tạp bay hơi - % tạp vô cơ)/100  Xác định độ không đảm bảo đo: Độ không đảm bảo đo của hàm lượng TCLQ bằng HPLC/DAD. Mỗi chất chuẩn được gửi đến 3 PKN, mỗi phòng 6 ống, tiến hành phân tích 6 mẫu. Xác định độ không đảm đo (loại A) của mỗi PKN: 𝑢 = (N: Số lần lặp lại thí nghiệm; S: Độ lệch chuẩn) √ Độ không đảm bảo đo tổng hợp của 3 PKN (uTH) được theo công thức tính độ không đảm bảo đo loại A của hướng dẫn ISO Guide 35 ( ) ∑( ) 𝑢 = = . (p: số PTN; yi: kết quả của từng PTN) √ √ hoặc theo luật lan truyền độ không đảm bảo đo (theo hướng dẫn của NIST) 𝑢 = . 𝑢 + 𝑢 +⋯+ 𝑢 (p: số PTN; u1, u2,..up: độ không đảm bảo đo của từng PTN) 6
Chọn uTH lớn hơn là độ không đảm bảo đo của giá trị hàm lượng TCLQ và độ tinh khiết sắc ký Độ không đảm bảo đo của hàm lượng tạp bay hơi bằng TGA. Mỗi chất chuẩn được tiến hành phân tích 6 mẫu trên 6 ống. Xác định độ không đảm đo (loại A): 𝑢 = (N: Số lần lặp lại thí nghiệm; S: Độ lệch chuẩn) √ Độ không đảm bảo đo lan truyền của kết quả tro sulfat theo công thức: 𝑢 ố ượ ẫ ử = 𝑢 ố ượ = 𝑢 + 𝑢 𝑢 ố ượ 𝑢 ố ượ ẫ ử 𝑢 à ượ = 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜 × + 𝑚 𝑚 ẫ ử Do hàm lượng tro cuối cùng là trung bình kết quả của 2 mẫu thử nên độ không đảm bảo đo của kết quả hàm lượng tro sulfat là: 1 𝑢 = × 𝑢 à ượ ử + 𝑢 à ượ ử 2 Độ không đảm bảo đo tổng hợp của giá trị ấn định được tính theo công thức: 𝑢 = 𝑢 ạ ấ ê + 𝑢 ạ ơ + 𝑢 Độ không đảm bảo đo mở rộng ở độ tin cậy 95% công bố là UCRS = 2 x uCRS 2.3.3. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời darutosid và kirenol trong Hy thiêm 2.3.3.1. Khảo sát phương pháp chiết Khảo sát sự phù hợp của phương pháp chiết theo Dược điển Trung Quốc trên dược liệu Hy thiêm thu hái ở Việt Nam. Sau khi được chiết theo Dược điển Trung Quốc, bã dược liệu được chiết thêm một lần nữa, cô cạn dịch chiết trên cách thủy, thêm 2 ml methanol, lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiêm sắc ký HPLC. Ghi lại diện tích của các pic quan tâm (nếu xuất hiện), từ đó tính hiệu suất chiết. Điều chỉnh phương pháp chiết nếu hiệu suất chiết thấp. 2.3.3.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng bằng HPLC Xây dựng và thẩm định quy trình định tính định lượng đồng thời thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC với các tiêu chí độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ chính xác, độ chính xác trung gian, độ đúng, giới hạn pháp hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) theo hướng dẫn của ICH Q2(R1)và AOAC. 7
Áp dụng phương pháp đã xây dựng trong định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm thu hái ở các vùng miền và thời điểm khác nhau. 2.3.4. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối. 2.3.4.1. Khảo sát phương pháp chiết Khảo sát chiết bằng dung môi methanol và ethyl acetat bằng cách lắc siêu âm hoặc đun hồi lưu cách thủy. Kiểm tra đến khi dịch chiết không cho phản ứng tạo màu xanh đen với dung dịch sắt (III) clorid 5%. Kiểm tra lại bằng HPLC. Lựa chọn dung môi và phương pháp chiết nhanh, đơn giản, tiết kiệm. 2.3.4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng bằng HPLC Khảo sát sự phù hợp của quy trình định lượng TCLQ trong nguyên liệu thiết lập chuẩn CO1 trong định tính, định lượng CO1 trong Vối nụ và Vối lá, điều chỉnh quy trình (nếu cần) cho phù hợp với đối tượng mẫu là dược liệu. Thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn của ICH Q2(R1) và AOAC. Áp dụng phương pháp đã xây dựng trong định tính, định lượng CO1 trong Vối nụ và Vối lá thu hái ở các vùng miền và thời điểm khác nhau. CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 3.1.1. Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc darutosid Hy thiêm (đã được định danh) được chiết xuất dưới dạng cao ethyl acetat và tinh chế theo sơ đồ bên: Chất tinh chế được tiến hành đo phổ HRESI- MS, IR, 1D và 2D-NMR trùng khớp với dữ liệu phổ của chất darutosid phân lập từ loài Siegesbeckia orientalis L., cho phép xác định chất tinh chế được chính Hình 3.2. Sơ đồ tinh chế darutosid là hợp chất darutosid. 8
3.1.2. Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc CO1 - Nụ Vối (đã được định danh) được chiết xuất, phân lập theo sơ đồ sau: Hình 3.7. Sơ đồ chiết xuất, phân lập CO1 từ nụ Vối - Phân đoạn CO1 (6 g) được tinh chế bằng HPLC điều chế với điều kiện sắc ký như sau:  Cột Shimadzu Shim-pack VX-ODS (10) 250 × 20.0 mm  Pha động: hỗn hợp dung môi ACN – nước (7:3)  Tốc độ dòng: 5 ml/phút Loại dung môi: Cất quay chân không ở 50oC thu được hợp chất CO1 (2,8 g) ở dạng tinh thể màu vàng, dùng để thiết lập chất chuẩn. Xác định độ tinh khiết của chất tinh chế được bằng phương pháp quét nhiệt lượng vi sai (DSC). Kết quả chất tinh chế có độ tinh khiết 96,02%. Kết quả này không dùng để xác định giá trị ấn định của chất chuẩn thiết lập được mà để khẳng định và bổ trợ thêm cho kết quả kiểm tra tạp bằng các phương pháp cân bằng khối lượng. Chất tinh chế được tiến hành đo phổ ESI-MS, IR, 1D và 2D-NMR trùng khớp với dữ liệu phổ của chất CO1 phân lập từ loài Cleistocalyx operculatus, cho phép xác định chất tinh chế được chính là hợp chất CO1 9
Hình 3.6. Công thức cấu tạo của Hình 3.14. Công thức cấu tạo của chất darutosid chất CO1 3.2. XÂY DỰNG TCCL NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN 3.2.1. Nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn gốc định lượng 3.2.1.1. Xây dựng và TĐPP HPLC xác định TCLQ trong nguyên liệu darutosid - Xây dựng phương pháp HPLC xác định độ TKSK và TCLQ của darutosid - Pha động: Thời gian (phút) % Nước % Acetonitril 0 80 20 35 50 50 - Dung dịch thử: Dung dịch Darutoside nồng độ 0,5 mg/ ml trong methanol. - Hệ thống sắc kí: Cột thép không gỉ (25 cm  4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 µm); Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; Detector quang phổ tử ngoại ở bước sóng 210 nm; Thể tích tiêm: 20 µl - Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần đối với dung dịch thử: Hệ số kéo đuôi pic chính (T): 0,8 ≤ T ≤ 1,5; Số đĩa lý thuyết pic chính không ít hơn 50.000; Độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng TKSK không được lớn hơn 2,0%; Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu pic chính không được lớn hơn 1,0 % - Thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và tạp chất liên quan của nguyên liệu darutosid theo hướng dẫn của ICH. A. Mẫu trắng B. Mẫu thử Hình 3.16: SKĐ thẩm định độ đặc hiệu phép thử TCLQ trong darutosid 10
3.2.1.2. Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn định lượng Dựa trên kết quả thực nghiệm định tính xác định cấu trúc darutosid, kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC xác định TCLQ trong nguyên liệu darutosid, kết quả kiểm tra chất lượng nguyên liệu darutosid xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu darutosid. Tính chất: Bột vô định hình màu trắng, rất khó tan trong nước, tan trong methanol. Định tính - Phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS): Trong khoảng bước sóng từ 200 – 400 nm không thể hiện rõ cực đại hấp thụ, hấp thụ cao nhất ở 200 nm và hầu như không hấp thụ quang ở bước sóng lớn hơn 240 nm. - Phổ hồng ngoại (IR): Trong khoảng số sóng từ 4000 đến 400 cm-1 có các đỉnh đặc trưng trong khoảng: 3398, 2937, 2837, 1647, 1457, 1387, 1363, 1079, 1028, 517 (± 20 cm-1) - Phổ khối (MS): Phổ HR-ESI-MS của mẫu thử phải có pic ion m/z 529,30265 [C26H44O8+ HCOO]-. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo trong dung môi CD3OD:  Có các độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δH ppm: 5,18; 4,35; 3,87; 3,73 – 3,66; 3,58; 3,48; 3,43 – 3,35; 3,33 – 3,29; 3,25; 3,18; 2,29; 2,10 – 1,94; 1,79; 1,72; 1,68 – 1,63; 1,62 – 1,53; 1,46 – 1,34; 1,22 – 1,09; 1,06; 0,98 – 0,89; 0,88; 0,85 (± 0,5 ppm).  Có các độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δC ppm: 139,9; 129,5; 101,9; 86,0; 78,3; 77,7; 77,5; 75,2; 71,9; 64,3; 63,0; 56,2; 52,1; 39,4; 39,0; 38,5; 38,1; 37,1; 33,3; 29,2; 24,4; 23,4; 23,1; 19,4; 17,3; 15,3 (± 0,5 ppm) Mất khối lượng do làm khô (Tạp chất bay hơi): Không quá 3,0% Cắn sau nung (Tạp chất vô cơ): Không quá 0,2%. Tạp chất liên quan: Tổng tạp không lớn hơn 5,0% 3.2.2. Nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn gốc định lượng 3.2.2.1. Xây dựng và TĐPP HPLC xác định TCLQ trong nguyên liệu CO1 - Xây dựng phương pháp HPLC xác định độ TKSK và TCLQ của CO1 - Pha động: 11
Thời gian (phút) % Methanol % Nước % Acetonitril 0 40 50 10 40 80 10 10 60 40 50 10 - Dung dịch thử: Dung dịch mẫu thử nồng độ 0,1 mg/ ml trong methanol. - Điều kiện sắc ký: Cột RP18 (25 cm  4,6 mm, 5 µm); Detector quang phổ tử ngoại ở bước sóng 220 nm; Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm: 50 µl - Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần đối với dung dịch thử: Hệ số kéo đuôi pic chính (T): 0,8 ≤ T ≤ 1,5; Số đĩa lý thuyết pic chính không ít hơn 20.000; Độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng TKSK không được lớn hơn 2,0 %; Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu pic chính không được lớn hơn 1,0 % - Thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và tạp chất liên quan của nguyên liệu CO1 theo hướng dẫn của ICH. A. Mẫu trắng B. Mẫu thử Hình 3.20: SKĐ xác định TCLQ trong nguyên liệu CO1 3.2.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn gốc định lượng Dựa trên kết quả thực nghiệm định tính xác định cấu trúc CO1, kết quả xây dựng và TĐPP HPLC xác định TCLQ, kết quả kiểm tra chất lượng nguyên liệu CO1, xây dựng TCCL của nguyên liệu CO1. Tính chất: Tinh thể màu vàng, không tan trong nước, hơi tan trong methanol. Định tính - Điểm chảy: 125-127oC 12
- Phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS): Trong khoảng bước sóng từ 200 – 400 nm cho 2 cực đại hấp thụ (λmax) ở bước sóng 203 và 339 nm ± 2nm (logε ≈ 23.314,6 l mol-1 cm-1). - Phổ hồng ngoại (IR): Trong khoảng số sóng từ 4000 đến 400 cm-1 có các đỉnh đặc trưng trong khoảng: 3328, 2941, 2360, 1628, 1544, 1357, 1167, 1113, 988, 761, 689 (± 20 cm-1) - Phổ khối (MS): Phổ ESI-MS của mẫu thử phải có pic ion m/z 298,9 [M+H]+ và 296,9 [M-H]- . - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo trong dung môi DMSO:  Có các độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δH ppm: 13,60; 7,94; 7,77; 7,72 -7,75; 7,45 - 7,48; 3,61; 2,07; 2,02 (± 0,5 ppm).  Có các độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δC ppm: 192,4; 161,2; 161,1; 158,2; 142,3; 134,8; 130,3; 129,0; 128,3; 126,5; 110,1; 107,8; 107,1; 61,8; 8,9; 8,2 (± 0,5 ppm). Mất khối lượng do làm khô (Tạp chất bay hơi): Không quá 0,5% Cắn sau nung (Tạp chất vô cơ): Không quá 0,2%. Tạp chất liên quan: Tổng tạp không lớn hơn 5,0% 3.3. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN 3.3.1. Đóng lọ và đánh giá đồng nhất quá trình đóng gói Sử dụng buồng đóng chuẩn chuyên dụng (Glove box Labconco) có kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm và nạp khí nitơ buồng đóng. - Đóng lọ thủy tinh màu nâu 2 ml; Khối lượng/lọ: khoảng 10 mg - Điều kiện đóng: Độ ẩm: RH ≈ 4,0 %; Nhiệt độ: khoảng 25 oC; Nạp khí nitơ độ tinh khiết: 99,999 % - Thời gian sản xuất: 01 ngày - Số lượng ống chuẩn CO1: 80 lọ - Số lượng ống chuẩn darutosid: 90 lọ Lấy ngẫu nhiên 10 lọ trong tổng số lọ bán thành phẩm, phân tích bằng phương pháp HPLC theo quy trình đã thẩm định, ghi lại diện tích pic chính. Quy ước hàm lượng của 1 lọ là 100 %, tính hàm lượng của các lọ còn lại theo hàm lượng quy ước dựa vào diện tích pic chính và khối lượng cân mẫu. Kết quả độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của hàm lượng quy ước được tính dựa vào khối lượng mẫu thử và diện tích pic với các nguyên 13
liệu CO1, nguyên liệu darutosid lần lượt là 0,52 % và 0,52% (< 1,0 %). Các lô bán thành phẩm chất chuẩn đồng nhất về hàm lượng, quy trình đóng lọ ổn định. 3.3.2. Xác định giá trị ấn định với chất chuẩn gốc định lượng - Xác định TKSK bằng phương pháp HPLC: Kết quả thu được từ 03 PTN cho thấy hàm lượng TKSK trong chất chuẩn darutosid là 96,96%, với độ không đảm bảo đo u = 0,025%; Hàm lượng TKSK trong chất chuẩn CO1 là 96,67%, với độ không đảm bảo đo u = 0,025%. - Xác định tạp chất bay hơi bằng phương pháp TGA: Hàm lượng tạp chất bay hơi trong chất chuẩn darutosid là 1,82%, với độ không đảm bảo đo u = 0,010%; Hàm lượng tạp chất bay hơi trong chất chuẩn CO1 là 0,00%. - Xác định tạp chất vô cơ bằng phương pháp tro sulfat: Hàm lượng tạp chất vô cơ trong chất chuẩn darutosid là 0,04%, với độ không đảm bảo đo u = 10-7(%); Hàm lượng tạp chất vô cơ trong chất chuẩn CO1 là 0,15%, với độ không đảm bảo đo u = 10-7(%). - Từ kết quả trên xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo mở rộng ở độ tin cậy 95% của 2 chất chuẩn. Chất chuẩn darutosid Chất chuẩn CO1 NSX: 08/11/2021 NSX: 21/02/2020 Lô: E0121382.01 Lô: E0120358.01 HL: 95,16 ± 0,05% HL: 96,52 ± 0,05% theo nguyên trạng theo nguyên trạng Hình 3.24. Các chất chuẩn đã thiết lập được 3.3.3. Theo dõi độ ổn định của các chất chuẩn thiết lập được Theo dõi độ ổn định được tiến hành theo phương pháp truyền thống. Các chất chuẩn được bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC, định kỳ tiến hành kiểm tra xác định hàm lượng TCLQ theo quy trình phân tích HPLC đã được 14
thẩm định. Mỗi lần thực hiện 06 mẫu thử trên 06 lọ chuẩn, đánh giá sự biến đổi về hàm lượng từ đó đưa ra kết luận về độ ổn định của các chất chuẩn đã thiết lập. Theo ISO guide 35, chất chuẩn được xem là ổn định khi thỏa mãn công thức: |𝑥 − 𝑥 | ≤ 𝑘 𝑢 + 𝑢 , k=2 ở độ tin cậy 95% xcrs và xmon tương ứng là hàm lượng TKSK tại thời điểm thiết lập chuẩn và thời điểm kiểm tra độ ổn định; ucrs và umon là độ không đảm bảo đo tương ứng với giá trị xcrs và xmon. Kết quả chất chuẩn CO1 ổn định trong thời gian 30 tháng và chất chuẩn darutosid ổn định trong thời gian bảo quản 09 tháng. 3.4. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG DƯỢC LIỆU NỤ VỐI, LÁ VỐI VÀ HY THIÊM 3.4.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC Đối tượng nghiên cứu: mẫu Hy thiêm đã được định danh tên khoa học tại Viện Dược liệu Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC. Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH và AOAC. - Dung dịch chuẩn: Kirenol và darutosid nồng độ tương ứng khoảng 6 µg/ml và 140 µg/ml trong methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. - Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2 g bột dược liệu Hy thiêm vào bình nón nút mài 100 ml, thêm chính xác 50 ml methanol, cân xác định khối lượng, đun sôi hồi lưu trong cách thủy ở 70oC trong 5 giờ, lau khô bình, để nguội về nhiệt độ phòng, cân, bổ sung methanol nếu cần, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. - Pha động: Thời gian (phút) Nước (% tt/tt) Acetonitril (% tt/tt) 0-40 76 24 40-70 76-50 24-50 70-80 50-76 50-24 - Điều kiện sắc ký: Cột Waters C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm);Detector UV: 215 nm; Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm mẫu: 20 µ.l - Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: 15
Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần với dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hệ số đối xứng (T): 0,8 ≤ T ≤ 1,5; Số đĩa lý thuyết không ít hơn 5000 với pic kirenol và pic darutosid; Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic không được lớn hơn 2,0 %; Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu không được lớn hơn 1,0 %. A. Dung dịch chuẩn B. Dung dịch thử Hình 3.28. SKĐ thẩm định độ đặc hiệu dung dịch thử Hy thiêm Kết quả khảo sát hàm lượng kirenol và darutosid trong Hy thiêm Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng 08 mẫu Hy thiêm thu hái vào thời gian và địa điểm khác nhau, kết quả hàm lượng kirenol và darutosid tính theo dược liệu khô kiệt được trình bày ở bảng sau: Bảng 3.35: Hàm lượng kirenol và darutosid trong Hy thiêm Mẫu Hàm lượng kirenol mg/g) Hàm lượng darutosid (mg/g) HT1 0,429 ± 0,001 (n=3) 0,434 ± 0,001 (n=3) HT2 0,159 ± 0,002 (n=12) 2,325 ± 0,024 (n=12) HT3 < LOD (n=3) 0,479 ± 0,001 (n=3) HT4 < LOD (n=3) 2,602 ± 0,006 (n=3) HT5 0,093 ± 0,002 (n=12) 0,721 ± 0,001 (n=12) HT6 0,036 ± 0,001 (n=3) 1,075 ± 0,001 (n=3) HT7 0,058 ± 0,001 (n=3) 1,213 ± 0,021 (n=3) HT8 < LOD (n=3) 0,837 ± 0,014 (n=3) 3.4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối bằng HPLC Đối tượng nghiên cứu: mẫu lá Vối (LV) và nụ Vối (NV) đã được định danh tên khoa học tại Viện Dược liệu Xây dựng phương pháp định tính, định lượng CO1 trong LV và NV bằng HPLC. Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH và AOAC 16
- Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn CO1 nồng độ khoảng 0,01 mg/ml trong methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. - Dung dịch thử lá Vối: Cân chính xác khoảng 1 g bột lá Vối đã nghiền mịn chiết bằng 25 ml methanol, lắc siêu âm ở 50 ºC trong 30 phút x 3 lần. Gạn dịch chiết vào bình định mức 100 ml. Lọc, hút chính xác 3,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 10 ml và thêm methanol vừa đủ. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. - Dung dịch thử nụ Vối: Cân chính xác khoảng 1 g bột nụ Vối đã nghiền mịn chiết bằng 50 ml methanol, lắc siêu âm ở 50 ºC trong 30 phút x 3 lần. Gạn dịch chiết vào bình định mức 200 ml. Lọc, hút chính xác 5,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 20 ml và thêm methanol vừa đủ. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. - Pha động: Thời gian (phút) % Methanol % Nước % Acetonitril 0 40 50 10 40 80 10 10 60 40 50 10 - Điều kiện sắc ký: Cột RP18 (25 cm  4,6 mm, 5 µm); Detector quang phổ tử ngoại ở bước sóng 220 nm; Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm: 50 µl - Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần đối với dung dịch chuẩn: Hệ số kéo đuôi (T): 0,8 ≤ T ≤ 1,5; Số đĩa lý thuyết pic không ít hơn 20.000; Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic không được lớn hơn 2,0 %; Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu không được lớn hơn 1,0 % SKĐ chuẩn CO1 SKĐ nụ Vối SKĐ lá Vối Hình 3.31. SKĐ các dung dịch thử nụ Vối và lá Vối Kết quả khảo sát hàm lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối 17
Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng 08 mẫu nụ Vối và 08 mẫu lá Vối thu hái ở các vùng miền khác nhau, kết quả hàm lượng CO1 tính theo dược liệu khô kiệt được trình bày ở bảng sau: Bảng 3.43: Hàm lượng CO1 trong các mẫu nụ Vối và lá Vối Mẫu Hàm lượng CO1 (mg/g) Mẫu Hàm lượng CO1 (mg/g) NV1 6,87 ± 0,09 (n=3) LV1 3,34 ± 0,05 (n=3) NV2 10,32 ± 0,17 (n=3) LV2 3,64 ± 0,08 (n=3) NV3 7,54 ± 0,10 (n=3) LV3 1,77 ± 0,03 (n=3) NV4 9,46 ± 0,16 (n=3) LV4 5,28 ± 0,11 (n=3) NV5 8,93 ± 0,03 (n=12) LV5 3,41 ± 0,02 (n=12) NV6 7,15 ± 0,02 (n=3) LV6 3,35 ± 0,01 (n=3) NV7 8,39 ± 0,01 (n=3) LV7 3,11 ± 0,02 (n=3) NV8 7,46 ± 0,05 (n=3) LV8 2,44 ± 0,02 (n=3) Như vậy trong các mẫu đã khảo sát, hàm lượng CO1 trong nụ Vối dao động trong khoảng 6,87-10,32 mg/g; trong lá Vối dao động trong khoảng 1,77 – 5,28 mg/g. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ CÁC CHẤT ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN 4.1.1. Lựa chọn hợp chất trong cây Vối và cây Hy thiêm cần phân lập Tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy diterpenoid là thành phần chính trong Hy thiêm, đến nay khoảng 30 hợp chất diterpenoid. Kirenol được chứng minh có tác dụng chống viêm và giảm đau cục bộ. Darutosid được chứng minh có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương. Năm 2020, Yu-Sang Li và cộng sự đã nghiên cứu so sánh tác dụng chống viêm giảm đau của darutosid và kirenol trên chuột thực nghiệm và tế bào nuôi cấy. Kết quả darutosid và kirenol được chứng minh tương đương nhau trong khả năng làm tăng ngưỡng chịu đau, giảm phản ứng viêm với các mô hình gây viêm trên chuột thí nghiệm, giải phẫu mô bệnh học cho thấy các hợp chất này ngăn cản sự thâm nhiễm của các tế bào viêm bằng cách gắn vào cyclooxygenase-2. Theo Dược điển Trung Quốc hàm lượng kirenol trong Hy thiêm phải không ít hơn 0,050%. Theo Dược điển Hồng Kông, hàm lượng kirenol trong Hy thiêm phải không ít hơn 0,079%. Theo Dược điển Việt Nam V, Hy thiêm chưa được định lượng chất đánh dấu, chỉ định lượng chất chiết 18