Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

76
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu chiết tách và tinh chế các thành phần hóa học chính của cây rau má Centella asiatica (L.) Urban thu tại một số vùng của Việt Nam; nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic acid và madecassic acid phân lập được từ cây rau má thành các dẫn xuất mới của chúng, thăm dò hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp được để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới và tìm mối tương quan cấu trúc – hoạt tính của chúng. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- VÕ THỊ QUỲNH NHƢ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN (APIACEAE ) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62 44 01 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2017
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Viện Hoá học Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS. TSKH. Trần Văn Sung Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2. TS. Trần Văn Lộc Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Phản biện 1: ............................................................................................................. .............................................................................................................. .............................................................................................................. Phản biện 2: ............................................................................................................. .............................................................................................................. .............................................................................................................. Phản biện 3: ............................................................................................................. .............................................................................................................. .............................................................................................................. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Số 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội. Vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao đã và đang được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y dược, nông nghiệp và đời sống. Có nhiều loại thuốc được phát triển dựa trên cơ sở chuyển hóa hóa học từ các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học lý thú đã và đang có nhiều ưu thế trong việc chữa trị các bệnh thông thường cũng như các bệnh hiểm nghèo. Do đó, các hướng nghiên cứu hiện nay được các nhà khoa học nước ta và trên thế giới rất quan tâm là: Từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu người ta bán tổng hợp, thay đổi cấu trúc hoá học của chúng để tìm ra các hợp chất mới có hoạt tính và tính chất ưu việt hơn những hợp chất ban đầu. Cách tiếp cận này có tính kinh tế tốt hơn, phù hợp hơn với cơ thể sống và thân thiện môi trường hơn. Trong số các hợp chất thiên nhiên, hợp chất triterpene có khung ursane như nhóm ursolic acid và các dẫn xuất của ursolic acid có nhiều hoạt tính sinh học lý thú nên ngày càng được quan tâm nghiên cứu về mặt hoá học và dược lý học. Trong đó hoạt tính gây độc với tế bào khối u phổi dòng A-549, cũng như với tế bào bạch cầu lympho P-388 và L-1210, hoạt tính gây độc với tế bào khối u KB và khả năng ức chế phát triển khối u trên da chuột đã được khẳng định. Trong quá trình tìm hiểu về các cây thuốc cổ truyền Việt nam, chúng tôi thấy cây rau má có tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban thuộc họ Hoa tán (Apiaceae) có chứa nhiều hợp chất triterpene thuộc khung ursane như là asiatic acid, asiaticosid, madecassic acid, madecassoside… với hàm lượng khá cao có hoạt tính độc với tế bào ung thư. Để tận dụng nguồn nguyên liệu này và góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các chất mới có hoạt tính cao, chúng tôi đặt mục đích sử dụng các triterpene tách được từ cây rau má để chuyển hóa chúng tạo thành các dãy dẫn xuất mới và thăm dò hoạt tính kháng ung thư của các chất thu được. Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)”. 2. Nhiệm vụ của luận án 1. Nghiên cứu chiết tách và tinh chế các thành phần hóa học chính của cây rau má Centella asiatica (L.) Urban thu tại một số vùng của Việt Nam. 2. Nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic acid và madecassic acid phân lập được từ cây rau má thành các dẫn xuất mới của chúng. 3. Thăm dò hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp được để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới và tìm mối tương quan cấu trúc – hoạt tính của chúng. 3. Những đóng góp mới của luận án  Đã tiến hành định lượng hai hợp chất triterpene chính là asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má thu tại Sơn Tây (Hà Nội), tỉnh Nam Định và 1
thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp sắc ký cột và phương pháp HPLC. Kết quả cho thấy hàm lượng của hai triterpene trên trong mẫu rau má Sơn Tây là cao nhất: asiatic acid là 0,72%, madecassic acid là 0,89% so với nguyên liệu khô. Mẫu rau má này được lựa chọn làm nguyên liệu để chiết suất asiatic và madecassic acid phục vụ cho các chuyển hóa hóa học.  Đã đánh giá hoạt tính bảo vệ gan của asiatic acid chiết tách từ cây rau má trên mô hình gây độc gan chuột bằng paracetamol. Kết quả cho thấy asiatic acid có hoạt tính bảo vệ gan có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng.  Đã tổng hợp 29 dẫn xuất của asiatic acid bằng biến đổi hóa học tạo amide ở vị trí C-28, và chuyển hóa các nhóm hydroxy ở vị trí C-2, C-3, C-23. Trong số các chất tổng hợp được có 25 hợp chất mới, chưa được công bố trong tài liệu.  Từ madecassic acid đã tổng hợp được 17 dẫn xuất mới thông qua việc tạo ra các amide ở vị trí C-28 và acetyl hóa các nhóm hydroxy ở C-2, C-3 và C-23 của madecassic acid.  Các hợp chất được tổng hợp (28 dẫn xuất của asiatic acid và 14 dẫn xuất của madecassic), được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ưng thư: KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan) và Lu-1 (ung thư phổi). Hầu hết dẫn xuất tổng hợp đều có hoạt tính cao hơn chất đầu. Có nhiều chất có hoạt tính cao hơn chất đầu từ 60 đến gần 100 lần trên cả ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Kết quả này hứa hẹn khả năng tìm ra chất mới có hoạt tính kháng ung thư cao, góp phần phát triển ngành hóa dược.  Đã rút ra được kết luận về mối tương quan Hoạt tính-Cấu trúc của các dẫn xuất của asiatic acid và madecassic acid. Amide hoá nhóm 28-COOH làm tăng hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng ung thư thử nghiệm, và acetyl hóa nhóm 2-OH, 3- OH và 23-OH cũng làm tăng hoạt tính gây độc tế bào ung thư . Bố cục của luận án Luận án gồm 136 trang gồm: Mở đầu (1 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (32 trang), Chương 2: Phương pháp nghiên cứu (3 trang), Chương 3: Thực nghiệm (38 trang), Chương 4: Kết quả và thảo luận (46 trang), Kết luận và kiến nghị (2 trang), Danh mục các công trình đã công bố (1 trang). Phần tài liệu tham khảo có 124 tài liệu về lĩnh vực liên quan đến luận án, được cập nhật đến năm 2017. Phần phụ lục gồm 149 trang gồm các loại phổ của các chất phân lập từ cây rau má, các dẫn xuất tổng hợp được, nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp trên mô hình tế bào (docking phân tử), kết quả thử hoạt tính độc tế bào của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất của chúng. 2
II. NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính cấp thiết và thực tiễn, đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má và hoạt tính sinh học của chúng 1.2. Một số kết quả nghiên cứu chiết tách triterpene và triterpene glycoside từ cây rau má Centella asiatica (L.)Urban. 1.3. Hoạt tính sinh học của cây rau má 1.4. Hoạt tính sinh học của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất 1.5. Một số chuyển hóa của asiatic acid 1.6. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Chƣơng 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất và phân lập chất Phối hợp các phương pháp sắc ký: Sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký cột (CC) trên các loại pha tĩnh khác nhau như silica gel pha thường, sephadex LH-20… 2.2. Các phƣơng pháp phổ Cấu trúc hóa học của các hợp chất được thiết lập dựa trên các dữ kiện phổ (IR, ESI-MS, 1D-, 2D-NMR), cùng với việc phân tích, so sánh với các tài liệu tham khảo. 2.3. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ Các phương pháp tổng hợp hữu cơ đã được sử dụng bao gồm: Phản ứng acetyl hóa nhóm hydroxyl với anhydride và pyridine ở nhiệt độ phòng. Nhóm caboxylic được chuyển hóa thành acid chlorid với oxalyl chloride trong dung môi DCM. Phản ứng amide hóa acid chlorid bằng cách thêm các amin tương ứng và triethylamin (TEA) khuấy ở nhiệt độ phòng trong 20 giờ. Acetyl hóa các amino hoặc OH mạch nhánh của amide thu được bằng acetyl chloride (AcCl) và xúc tác DMAP. Thủy phân để loại bỏ các nhóm chức acetyl bằng KOH 4% trong MeOH. Tạo acetonide ở vị trí 3-OH và 23-OH của asiatic acid bằng phản ứng với 2,2- dimethoxypropane, TsOH.H2O trong DMF để bảo vệ nhóm 3-OH và 23-OH, sau đó thực hiện các phản ứng este hóa ở nhóm 2-OH, loại bỏ nhóm bảo vệ ở vị trí 3- OH và 23-OH bằng phản ứng thủy phân trong acid HCl ở 90 oC. 3
2.4. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium). Giá trị thể hiện hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào). Phép thử được thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học. 2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm Hoạt tính bảo vệ gan được thử nghiệm (in vivo) tại Phòng thí nghiệm thử hoạt tính Sinh học (Viện Hóa học) kết hợp với Phòng thử nghiệm Sinh học (Viện Công nghệ Sinh học) theo mô hình chuột BALB/c gây độc gan bằng paracetamol thông qua việc nghiên cứu sự thay đổi của các chỉ số AST và ALT của các enzyme chức năng gan, khối lượng gan, và hàm lượng MDA (malon dialdehyde) trong gan. 2.6. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc trên hai loại enzyme SIRT1 và 17β-HSD1 (docking phân tử). Trong luận án này chúng tôi đã hợp tác với nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Lê Thị Lý để thực hiện các nghiên cứu docking phân tử 20 dẫn xuất của asiatic acid và 14 dẫn xuất của madecassic acid tổng hợp được trên hai loại enzyme trên. Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM 3.1. Nguyên liệu Mẫu cây rau má Centella asiatica dùng trong nghiên cứu này được thu hái tại Sơn Tây (Hà Nội) và tỉnh Nam Định vào tháng tư năm 2010, các mẫu rau má Thành phố Hồ Chí Minh được thu thập tháng 5 năm 2013. Tên cây do ThS. sinh học Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội xác định tên khoa học. Các tiêu bản CRM1, CRM2 và CRM3 được lưu giữ tại Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học. 3.2. Phân lập chất 3.2.1. Phân lập các thành phần hóa học của cây rau má thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh 4
Rau má khô 1200g RMHCM Cao chiết n- Hexane, Bã n-Hexane, 3×5L, 2h/ lần 29g CH2Cl2 , siêu âm 3×4L, 2h/ lần Bã Cao chiết CH2Cl2 , 33g n- BuOH, siêu âm 3×3L, 2h/ lần Cao chiết Bã n-BuOH, 50g Silica gel CH2Cl2/MeOH 95:5-70:30 madecassic stigmasterol β-Sitosterol asiatic acid (1) acid (10) (44) Hỗn hợp stigmasterol Madecassoside (14) (43) 185 mg 168 mg glucoside và β- sitosterol glucoside (144) Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các chất từ cây rau má [C. asiatica (L.) Urban] thu hái tại Thành phố Hồ Chí Minh Các số liệu phổ của các chất phân lập được trình bày ở phần 3.2.1.2. 3.2.2. Nghiên cứu định lƣợng các thành phần triterpene acid chính trong mẫu rau má thu thập ở một số tỉnh thuộc Bắc bộ và Nam bộ Hàm lượng asiatic acid và madecassic acid được định lượng bằng phương pháp HPLC và phương pháp sắc ký cột để so sánh đối với ba mẫu cây rau má thu tại Sơn Tây (Hà Nội), Nam Định và Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2.1. Xác định hàm lượng asiatic acid bằng phương pháp HPLC 3.2.2.2. Xác định hàm lượng asiatic acid và madecassic acid bằng sắc ký cột 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện chiết xuất đến hiệu quả thu hồi asiatic acid và madecassic acid 3.2.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 3.2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ cồn 5
3.2.3.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết 3.2.4. Phân lập asiatic acid và madecassic acid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban làm nguyên liệu để điều chế các dẫn xuất 3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic và madecassic acid 3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid 3.3.2. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid 3.4. Thăm dò hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro 3.4.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập chất 4.1.1. Thành phần hóa học của cây rau má thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh Từ cao chiết n-BuOH của rau má RMHCM, theo phương pháp phân lập được Sơ đồ 3.1, có 6 hợp chất đã được phân lập gồm: Stigmasterol, β-Sitosterol, asiatic acid, madecassic acid, Hỗn hợp stigmasterol glucoside và β-sitosterol glucoside (1:1) và madecassoside. 4.1.2. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong cây rau má bằng phƣơng pháp CC và HPLC 4.2.3.1. Phương pháp HPLC Bảng 4.1: Tổng hàm lượng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má RMST 4,25 g RMND 4,20 g RMHCM 1,67 g Thành phần % diện % trong % diện % trong % diện % trong tích pic mẫu khô tích pic mẫu khô tích pic mẫu khô Asiatic acid 33,81 0,718 30,49 0,615 28,92 0,241 Madecassic 41,93 0,891 43,02 0,865 28,61 0,239 acid 4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid 4.3. Chuyển hóa hóa học của asiatic acid và madecassic acid 4.3.1. Chuyển hóa của asiatic acid 4.3.1.1. Chuyển hóa hóa học của nhóm COOH vị trí C-28 Như trong sơ đồ 4.1, asiatic acid được chuyển hóa thành các dẫn xuất amide bằng phản ứng với các hợp chất amin bậc 1 và bậc 2 khác nhau. 6
Sơ đồ 4.1: Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) (CH3CO)2O, pyridine, rt., 12 h, 80%, b) oxalyl chloride, DCM, rt., 24 h, c) RNH2, DCM, rt, 24 h, (75-92%), d) AcCl, DMAP, DCM, 2h, 75-80%, e) KOH, MeOH, rt, 16 h, 72-80%, f) acetyl chloride, DMAP, rt, 85%. Trong dãy phản ứng chuyển hóa asiatic acid (1) thành các amide, các nhóm OH vòng A trước hết được bảo vệ với nhóm acetyl. Asiatic acid được xử lý với acetic anhydride trong pyridine tạo thành asiatic acid triacetate (145) với hiệu suất 80%. Cấu trúc của hợp chất 145 được khẳng định qua phân tích phổ IR, ESI-MS và 1D-NMR. Phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 145 cho thấy ngoài các tín hiệu tương ứng của hợp chất 1 đã xuất hiện 3 tín hiệu của 3 nhóm acetyl CH3 tại H (ppm): 1,92 (3H, s, -CH3-CO), 1,96 (3H, s, -CH3-CO), 2,02 (3H, s, -CH3-CO) và C (ppm): 170,83 (CH3CO-), 170,48 (CH3CO-), 170,37 (CH3CO-). Các tín hiệu H- 2β, H-3α và H-23 được dịch chuyển về phía trường thấp hơn ở δH (ppm) 3,51 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,78 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3α) và 5,09 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2β) so với các tín hiệu tương ứng [δH (ppm) 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,38 7
(1H, d, J = 9,5 Hz, H-3α), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2β)] của hợp chất 1. Như vậy cả 3 nhóm OH đều đã được acetyl hóa. Điều này được chứng minh thêm bởi phổ FT-IR của hợp chất 145 với đỉnh hấp phụ đặc trưng cho acetate tại 1746,26 và 1237,00, 1698,88 (-COOH) và phổ khối ESI-MS ion dương tại m/z 615 [M+H]+. Dữ liệu phổ của hợp chất 145 giống với tài liệu tham khảo [96]. Hợp chất 145 được chuyển hóa thành asiatic acid chloride triacetate (146) bằng phản ứng với oxalyl chloride. Sản phẩm trung gian này, không cần tách và tinh chế, được phản ứng với các amin tương ứng trong sự có mặt của triethylaminee làm xúc tác bắt acid HCl. Các phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng với hiệu suất cao từ 75-92% so với nguyên liệu đầu 145 (Sơ đồ 4. 1). Hợp chất 147 cho thấy trong phổ 1H-NMR có các cụm pic mới xuất hiện của các nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,69 (2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-1’), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-7’) và các tín hiệu của 7 nhóm methylene mạch nhánh. Các kết quả trên phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 727 [M+H]+ phù hợp với CTPT C43H70N2O7 của hợp hợp chất 147. Như vậy phản ứng amide hóa của hợp chất 145 với 1,7-heptadiamin đã thành công. Hợp chất 148 cho thấy trong phổ 1H-NMR có các cụm pic mới xuất hiện của các nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1’), 3,12-3,14 (2H, m, 2H-9’). Cấu trúc của hợp chất 148 cũng được khẳng định qua phổ ESI-MS ion dương với pic ion giả phân tử tại m/z 755 [M+H]+ tương ứng với CTPT C47H74N2O7 của hợp chất 148 như trong phản ứng. Hợp chất 149: trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton của nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1’), 3,14-3,11 (2H, m, 2H- 10’). Trên phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu tại C (ppm): 30,33-30,68 và 40,73-41,09 của nhóm methylene mạch nhánh. Kết quả này cũng được khẳng định thêm qua phổ ESI-MS ion dương với pic ion giả phân tử tại m/z 769 [M+H]+, cho thấy hợp chất 149 phù hợp với CTPT C46H76N2O7 như trong phương trình phản ứng. Hợp chất 150: trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton của nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 3,11-3,16 (1H, m, H-1’a), 3,53-3,63 (3H, m, H-1’b, 2H- 3’). Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 672 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H61NO8. Hợp chất 151 cho thấy đỉnh hấp thụ tại ν* (cm-1): 1742 và 1235 của các nhóm acetate và nhiều đỉnh hấp thụ xung quanh vùng 3418 của nhóm -NHNH2. Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 629 [M+H]+ phù hợp với CTPT C36H56N2O7 chứng minh rằng phản ứng của hợp chất 145 với hydrzine đã tạo thành sản phẩm mong muốn 151. Trên phổ 1H-NMR của amide 152 quan sát thấy tín hiệu triplet ở δ (ppm): 6,48 (1H, t, J = 4,0 Hz, -NH-amide), đặc trưng cho liên kết amide. Ngoài các tín hiệu 8
phổ của 145, còn quan sát thấy tín hiệu ở δ (ppm): 3,83 (1H, dd, J = 4,0, 18,5 Hz, H-1’a), 4,05 (1H, dd, J = 5,0, 18,5 Hz, H-1’b), 4,21 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1’’), 1,29 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-2’’) nhóm tín hiệu và hằng số tương tác này đặc trưng cho độ dịch chuyển hóa học của glycine. Trong phổ 13C-NMR có các tín hiệu của nhóm methylene gắn với -COOCH2CH3 của mạch nhánh xuất hiện tại C : 61,48 ppm. Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 700 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H61NO9. Trên phổ 1H-NMR của amide 153 ngoài các tín hiệu của 145, quan sát thấy sự xuất hiện 3 tín hiệu singlet của các proton vòng imidazole tương ứng ở δ (ppm): 7,03 (1H, s, H-2’), 7,54 (1H, s, H-1’), 8,26 (1H, s, H-3’). Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của mạch nhánh ở δ (ppm): 137,08 (C-3’), 129,74 (C-1’), 117,94 (C-2’). Amide 154: quan sát trên phổ 1H-NMR của hợp chất 154 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 4,12 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -NH-CH3), 4,36 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -NH-CH3). Amide 155: quan sát trên phổ khối ESI-MS ion dương có xuất hiện ion giả phân tử tại m/z 672 [M+ H]+ phù hợp với CTPT C39H61NO8 của hợp chất này. Phổ 1 H-NMR của hợp chất 155 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 3,92 (1H, hept, J = 7,0 Hz, H-1’) cùng với tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc 2 xuất hiện chồng lấp với các nhóm methyl của khung asiatic acid từ 1,12-1,05 ppm. Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của nhóm isopropyl trong mạch nhánh ở vùng trường cao chồng lấp với các tín hiệu khác của khung. Như vậy cấu trúc của hợp chất 155 đã được khẳng định như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1). Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 156 xuất hiện thêm tín hiệu tại H (ppm): 3,72 (4H, br s, 2H-2’) và C (ppm): 60,87 (C-2’). Các hợp chất 147-156 đã được chứng minh qua các số liệu phổ 1H-NMR, 13C- NMR, ESI-MS. Kết quả hoàn toàn phù hợp với công thức như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1). Các phản ứng acetyl hóa mạch nhánh Các nhóm chức -NH2 và -OH mạch nhánh của các hợp chất 147-150, 156 được acetyl hóa bằng phản ứng với acetyl chloride (CH3COCl) với sự xúc tác của DMAP trong dung môi dichloromethane (DMC) ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ. Xử lý hỗn hợp sau phản ứng như trong phần thực nghiệm 3.3.1 cho các sản phẩm tương ứng 157-161 với hiệu suất từ 75-80%. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 157 cho các tín hiệu tại H (ppm): 6,05 (1H, t, J = 5,0 Hz, -NH-amide), 4,10 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3’), 3,09 (1H, m, H-1’a), 3,39 (1H, m, H-1’b) cùng với một tín hiệu methyl singlet mới tại H (ppm): 2,1 bên cạnh nhóm methylene còn lại của mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu của nhóm -CH2- khác trong khung cho thấy mạch nhánh đã được gắn vào vị trí C-28. Tín hiệu H-3' trong hợp chất 157 xuất hiện ở dạng một triplet ở δH 4,10 ppm (J = 6,0 Hz) so với tín hiệu hợp chất gốc 150 là multiplet ở δH 3,53 -3,63 ppm, chồng 9
lấp với H-23a, H-2'a. Các tín hiệu -NH của 157 cũng dịch chuyển về phía trường cao tại δH 6,05 (t, J = 5,0 Hz) so với δH 6,18 (t, J = 5,5 Hz) trong hợp chất 150. Điều này được chứng minh thêm qua phổ 13C-NMR với sự xuất hiện tín hiệu tại C (ppm): 62,05 (C-3’) (CH2OAc) so với tín hiệu tại C 59,26 ppm (C-3’) của hợp chất 150. Các kết quả trên cho thấy phản ứng acetyl hóa đã được thực hiện như trong Sơ đồ 4. 1. Hợp chất 158 cho thấy xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng sau đây so với hợp chất 147 H (ppm): 5,61 (1H, br s, 1’-NH-amide), 5,85 (1H, t, J = 5,0 Hz, 7’- NH-), 3,00 (1H, m, H-1’a), 3,30 (1H, m, H-1’b), 3,23 (2H, q, J = 6,5 Hz, H-7’) bên cạnh các tín hiệu của những nhóm methylene còn lại của mạch nhánh trùng lặp với các nhóm methylene trong khung xuất hiện ở dạng multiplet trong vùng từ 1,98-1,38 (ppm), phù hợp với phổ 1H-NMR. Đặc biệt ở đây tín hiệu H-7’ có dạng quartet do tương tác với 2H-6’ và –NH-Ac tương đương về từ. Phổ 13C-NMR cũng cho thêm một tín hiệu của nhóm acetate tại C (ppm): 170,82 và các tín hiệu của nhóm –CH2 mạch nhánh trong vùng từ 44,0-21,0 ppm trùng lặp với các nhóm methylene trong khung. Điều này được khẳng định qua phổ qua phổ ESI-MS với pic ion giả phân tử tại m/z 769 [M+H]+ phù hợp với CTPT C45H72N2O8 của hợp chất 158. Hợp chất 159: Tương tự như vậy phổ 1H-NMR của hợp chất 159 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 5,88 (t, J = 5,0 Hz, 1’-NH-amide), 5,96 (1H, br s, 9’-NH-amide) bên cạnh các tín hiệu tại H (ppm): 3,01 (1H, m, H-1’a), 3,29 (1H, m, H-1’b), 3,22 (2H, m, H-9’), 1,99 (3H, s) cùng với các tín hiệu của nhóm methylene khác trong mạch nhánh chồng lấp với các nhóm methylene khác của khung. Phổ 13C-NMR có thêm một tín hiệu của nhóm acetyl tại 170,68 ppm cùng với các nhóm methylene trong mạch nhánh chồng lấp với các nhóm methylene trong khung. Điều này được khẳng định thêm qua phổ khối ESI-MS ion âm với pic ion giả phân tử tại m/z 795 [M-H]- tương ứng với CTPT C47H76N2O8 của hợp chất 159 như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1). Hợp chất 160: Tương tự như hợp chất 158, 159 cấu trúc của hợp chất 160 được chứng minh qua việc xuất hiện các tín hiệu của mạch nhánh trong phổ 1H-NMR, 13 C-NMR và khẳng định thêm qua phổ khối ESI-MS với pic ion giả phân tử tại m/z 811 [M+H]+ với CTPT C48H78N2O8. Hợp chất 161: Phổ 1H-NMR của hợp chất 161 xuất hiện thêm 2 tín hiệu methyl singlet của nhóm acetyl tại H (ppm): 2,07 và 2,08. Bên cạnh đó, các nhóm methylene mang oxy (-CH2OAc) tại H (ppm): 4,25 (4H, br s, 2H-2’) và các tín hiệu của nhóm methylene khác trong mạch nhánh trùng lặp với nhóm methylene của hợp chất ban đầu. Trong hợp chất 161, tín hiệu của H-2' ở δH 4,25 (4H, br s) thay vì δH 3,72 (4H, br s) trong hợp chất 156. Phổ khối của hợp chất 161 cho pic ion giả phân tử tại m/z 786 [M+H]+ phù hợp với CTPT C44H67NO11 của hợp chất 161. 10
Tương tự như trên cấu trúc của các hợp chất 157-161 cũng được khẳng định bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS đúng như các công thức ở sơ đồ (Sơ đồ 4.1).  Phản ứng thủy phân nhóm acetyl ở vòng A Để so sánh hoạt tính giữa các sản phẩm amide có nhóm OH vòng A bị khóa bởi nhóm aceyl và các nhóm OH tự do, một số sản phẩm 147-156 được lựa chọn để loại bỏ nhóm Acetyl bằng phản ứng thủy phân trong dung dịch KOH ở nhiệt độ phòng, khuấy trong 16 giờ. Xử lý hỗn hợp sau phản ứng như thường quy (phần thực nghiệm 3.3.1) thu được các sản phẩm tương ứng với hiệu suất cao từ 72- 80%. Cấu trúc của các sản phẩm dãy 162-166 được khẳng định thông qua phân tích phổ ESI-MS và 1H-NMR, 13C-NMR. Hợp chất 162: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 162 đã không còn các tín hiệu của các nhóm acetyl. Ngoài ra, thấy có sự chuyển dịch hóa học của các nhóm methyl gắn dị tố oxy về phía trường cao tạiH (ppm): 3,29 (1H, d, J = 10,0 Hz, H- 23a), 3,38 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 5,0, 10,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-12) và H (ppm): 2,86 (2H, t, J = 10,0 Hz, H-1’), 3,14 (2H, m, H-7’). Kết quả này cũng được khẳng định thêm qua phổ 13C-NMR với sự vắng mặt của tín hiệu của các nhóm acetyl carbonyl ở vùng 170 ppm và các nhóm methyl của acetyl ở vùng trường cao. Phổ khối ESI- MS ion dương của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 601 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H64N2O5 của hợp chất 162 như trong Sơ đồ 4. 1. Hợp chất 163: Tương tự như hợp chất 162, trong phổ 1H-NMR của hợp chất 163 đã không còn các tín hiệu cộng hưởng của các nhóm acetyl tại vị trí C-2, C-3, C-23. Đồng thời các tín hiệu của nhóm oxy-methine cũng bị đẩy về phía trường cao hơn và xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) và 2,66 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,13 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-9’) của mạch nhánh. Phù hợp với số liệu này phổ 13C-NMR cũng thấy vắng mặt các tín hiệu của nhóm acetyl carbonyl ở vùng C (ppm): 170 và acetyl methyl ở vùng trường cao. Các kết quả này được minh chứng thêm bởi phổ ESI-MS ion dương của hợp chất 163 với pic ion giả phân tử tại m/z 629 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H68N2O4 của 163 như trong Sơ đồ 4. 1. Hợp chất 164: Cũng tương tự như hợp chất 162, 163 trong phổ 1H-NMR của hợp chất 164 cũng không còn các tín hiệu cộng hưởng của các nhóm methyl acetyl. Đồng thời các tín hiệu của các nhóm oxy methyl cũng dịch chuyển về phía trường cao hơn, xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,80 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,73 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) và 2,74 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-10’) của mạch nhánh. Phổ 13C-NMR cũng vắng mặt các tín hiệu cộng hưởng của nhóm acetyl ở vùng khoảng 170 ppm và vùng trường cao. Phổ khối ESI-MS ion dương 11
của hợp chất này cũng cho kết quả phù hợp với pic ion giả phân tử tại m/z 643 [M+H]+ tương ứng với CTPT C40H70N2O4 của 164 như trong Sơ đồ 4. 1. Cấu trúc của các hợp chất 165, 166 cũng được chứng minh tương tự như trên thông qua phân tích phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chúng. Hợp chất 167 Nhằm tạo ra dẫn xuất amide bậc 1 của asiatic acid, hợp chất 146 đã được phản ứng với dung dịch amoniac đặc ở nhiệt độ phòng trong 20 giờ. Xử lý phản ứng như trong phần thực nghiệm 3.3.1 thu được hợp chất 167 với hiệu suất 88%. Cấu trúc của hợp chất 167 được khẳng định như sau: Phổ 1H-NMR của hợp chất 167 có mặt nhóm –NH2-amide tại H (ppm): 5,48 (1H, br s, -NH2) and 5,83 (1H, br s, -NH2). Các dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 167 phù hợp với tài liệu [97]. Phổ 13C-NMR có tín hiệu của nhóm chức – CONH2 tại C (ppm): 181,01. Trong phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 167 có pic ion giả phân tử tại m/z 615 [M+2H]2+ phù hợp với CTPT C36H55NO7. Tương tự như với dãy hợp chất 162-166, hợp chất 167 được loại bỏ nhóm acetyl bằng phản ứng với dung dịch KOH trong MeOH và khuấy ở nhiệt độ phòng 16 giờ. Xử lý sản phẩm phản ứng như trong phần thực nghiệm thu được hợp chất 168 với hiệu suất 72%. Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 168 không còn xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methyl singlet của các nhóm acetyl, đồng thời các tín hiệu của các nhóm oxymethine và oxymethylene đã dịch chuyển về phía trường cao hơn và xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,37 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2). Phù hợp với phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR cũng cho thấy sự mất đi của tín hiệu các nhóm acetyl (CH3CO-). Phổ khối ion âm ESI-MS của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 523 [M+HCl]- phù hợp với CTPT C30H49NO4 của hợp chất 168. Các dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 168 phù hợp với tài liệu [97]. Điều đó chứng tỏ rằng phản ứng amide hóa triacetate của asiatic acid và thủy phân dẫn xuất amide để thu được dẫn xuất 28-amide đã được thực hiện như trong sơ đồ phản ứng. Trong một hướng nghiên cứu khác để đánh giá hoạt tính của nhóm COOH (C- 28), amide 167 được dehydrat hóa thành nitrile 169 trong sự có mặt của acetyl chloride, và DMAP trong DCM ở nhiệt độ phòng. Acetyl chloride đóng vai trò loại nước. Sản phẩm của phản ứng là acetic acid và HCl. DMAP có vai trò bắt acid HCl tạo thành trong phản ứng này (vai trò xúc tác). Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng và tinh chế sản phẩm đã thu được dẫn xuất nitrile 169. Trên phổ hồng ngoại của 169 thấy xuất hiện tín hiệu ở 2228,9 cm-1 đặc trưng cho nhóm -CN. Phổ 1 H-NMR trong cùng dung môi CDCl3 không thấy xuất hiện tín hiệu của các proton amide bậc 1 ở 5,83 và 5,47 ppm như trong chất 168. Đặc biệt, phổ 13C- NMR xuất hiện tín hiệu ở 122,95 ppm đặc trưng cho nhóm -CN. Điều đó chứng tỏ, phản ứng dehydrat hóa xẩy ra khá dễ dàng với hiệu suất cao. 12
Hợp chất 169 cũng được thủy phân nhóm acetyl trong KOH và MeOH ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ thu được hợp chất 170 với hiệu suất 74%. Phổ 1H-NMR của hợp chất 170 không thấy xuất hiện các tín hiệu methyl singlet của các nhóm acetyl, đồng thời các tín hiệu của các proton gắn với cacbon mang oxi cũng xuất hiện về phía trường thấp hơn so với hợp chất 169 ở H (ppm): 3,30 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,54 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,74 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2). Phù hợp với kết quả trên, phổ 13C-NMR của hợp chất 170 cũng không còn các tín hiệu của các carbon trong nhóm acetyl tại vùng khoảng 170 ppm và vùng trường cao của nhóm methyl. Tín hiệu của nhóm – CN trong phổ 13C-NMR của chất 170 xuất hiện tại C: 126,41 ppm. Phổ khối ESI- MS ion âm có pic ion giả phân tử tại m/z 505 [M+HCl]- phù hợp với CTPT C30H47NO3. 4.3.1.2. Chuyển hóa hóa học vòng A của asiatic acid Sơ đồ 4.2: Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) 2,2-dimethoxypropane, TsOH.H2O, rt., 7 h, 88%, b) succinic anhydride, DMAP, TEA, rt. 12 h, 74%, c) (CH3CO)2O, pyridine, rt. 12 h, 82%, d) 5% HCl, rt. 4h, 90%. Để nghiên cứu ảnh hưởng của các nhóm chức 2-, 3-, 23-hydroxyl đến hoạt tính sinh học của asiatic acid, một số phản ứng hóa học nhằm tạo ra các dẫn xuất có sự thay đổi ở vòng A đã được thực hiện như Sơ đồ 4. 2. Asiatic acid (1) được phản ứng đóng vòng với 2,2-dimethoxypropane có sự xúc tác của p-toluensulphonic acid (PTSA) ở nhiệt độ phòng trong 7 giờ. Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng (xem phần thực nghiệm 3.3.1) thu được hợp chất 3,23-dioxo 171 với hiệu suất cao (88%). Hợp chất 171 khi tác dụng với succinic anhydride trong triethylamine (TEA) và dimethylaminopyridine (DMAP) ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ thì cho hợp chất 172 có nhóm chức succinate ở vị trí C-2 với hiệu suất 74% sau khi tinh chế. Mặt khác, khi cho hợp chất 171 tác dụng với acetic anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ sẽ thu được hợp chất 3,23-dioxo-2-acetate 173 với 13
hiệu suất 82%. Thủy phân hợp chất 173 trong acid hydrochloric ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ sẽ cho dẫn xuất 2-O-acetyl-3,23-dihydroxyasiatic acid (174) với hiệu suất cao (90%). Cấu trúc của các hợp chất 171-174 được khẳng định thông qua phân tích phổ MS và NMR của chúng. Hợp chất 171: Hợp chất này cho phổ 1H-NMR và 13C-NMR tương tự như phổ của asiatic acid (1) ngoại trừ việc trong phổ 1H-NMR của hợp chất 171 có thêm 2 tín hiệu methyl singlet của nhóm dimethyldioxo mới tạo thành xuất hiện tại H (ppm): 1,42 (3H, s), 1,48 (3H, s), đồng thời tín hiệu cộng hưởng của H-23a, H-23b được dịch chuyển về phía trường thấp hơn so với 1 và xuất hiện tại 3,50 ppm (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23a), 3,56 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23b), so với 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b) do ảnh hưởng của nhóm dioxo mới tạo thành. Đối với proton H-3α sự dịch chuyển về phía trường thấp hơn là 0,04 ppm so với asiatic acid và xuất hiện tại H : 3,56 ppm. Trong phổ 13C-NMR của hợp chất 171 xuất hiện thêm tín hiêu của nguyên tử carbon bậc 4 của nhóm dioxo tại C : 100,72 ppm (C-31). Thông qua sự hình thành ketal, tín hiệu C-3, C- 23 được chuyển sang trường thấp hơn và xuất hiện ở δC 83,03 và 73,66 ppm thay vì ở δC 69,68 và 66,31 trong asiatic acid (1) trong khi tín hiệu C-2 được chuyển sang trường cao hơn và xuất hiện ở δC 66,15 so với δC 78,17 ppm trong hợp chất 1. Phổ NMR của hợp chất 171 tương tự như tài liệu tham khảo [94]. Phù hợp với kết quả từ phổ 1H-NMR và 13C-NMR, phổ khối ESI-MS ion âm của hợp chất 171 cho pic ion giả phân tử tại m/z 527 [M-H]- ứng với CTPT C35H52O5 như trong sơ đồ phản ứng. Như vậy phản ứng đã thực hiện như dự đoán. Để có được một dẫn xuất succinate, được cho là có hoạt tính sinh học, hợp chất 171 đã phản ứng với anhydrit succinic trong DMAP và TEA ở nhiệt độ phòng để tạo ra succinat 172. Hợp chất 172: Phổ 1H-NMR của hợp chất 172 tương tự như phổ của hợp chất 171 và có xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng phù hợp với nhóm succinate mới được gắn vào, thể hiện ở tín hiệu tại H (ppm): 2,57 - 2,71 (4H, m, H-35, H- 36). Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 172 có sự xuất hiện thêm 2 tín hiệu carbon cacboxylic tại C (ppm): 178,04 (C-37) và 171,71 (C-34) của nhóm succinat cùng với tín hiệu của 2 nhóm methylene ở vùng trường cao trùng lặp với các tín hiệu trong khung. Phổ ESI-MS ion âm của hợp chất 172 cho pic ion giả phân tử tại m/z 627 [M-H]- phù hợp với CTPT C37H56O8 như trong Sơ đồ 4. 2 cho hợp chất 172. Điều đó chứng tỏ phản ứng tạo succinat đã thành công. Hợp chất 173: Phổ 1H-NMR của hợp chất 173 có thêm một tín hiệu methyl singlet của nhóm 2-O-acetyl xuất hiện tại H (ppm): 2,01 so với phổ 1H-NMR của hợp chất 171. Phổ 13C-NMR thêm một tín hiệu cộng hưởng của nhóm carbonyl ở C 170,62 ppm (CH3COO-) đồng thời xuất hiện thêm một tín hiệu –CH3 tại vùng 14
trường cao C (ppm): 21,15. Phổ khối ESI-MS ion âm m/z 569 [M-H]- phù hợp với CTPT C35H54O6 như trong sơ đồ phản ứng 4.2. Hợp chất 174: Phổ 1H-NMR của hợp chất 174 có thêm 1 tín hiệu methyl singlet của nhóm 2α-O-acetyl tại H (ppm): 2,07 (3H, s, CH3-CO) so với phổ 1H-NMR của asiatic acid (1), đồng thời tín hiệu cộng hưởng của H-2β cũng bị dịch chuyển về phía trường thấp hơn và xuất hiện tại H (ppm): 5,03 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2β) trong khi ở asiatic acid ghi trong cùng dung môi thì H-2β xuất hiện tại H (ppm): 3,71 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2), ΔH = 5,03-3,71= 1,32 ppm. Phù hợp với dẫn xuất acetate tại C-2, phổ 13 C-NMR có xuất hiện thêm 2 tín hiệu thuộc nhóm acetyl tại C (ppm): 78,89 (C-2), 170,62 (CH3COO-). Phổ khối ESI-MS ion âm của hợp chất 174 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 531 [M-H]- phù hợp với CTPT C32H50O6. Như vậy cấu trúc của hợp chất 174 đã được khẳng định. 4.3.2. Các dẫn xuất của madecassic acid Sơ đồ 4.3: Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) (CH3CO)2O, pyridine, rt., 12 h, 80%; b) oxalyl chloride, DCM, rt., 24 h, c) R1NH2, DCM, rt, 24 h; d) AcCl, DMAP, DCM, 2h, 75-80%; e) KOH, MeOH, rt, 16 h. Madecassic acid (10) được acetyl hóa với acetic anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ, xử lý hỗn hợp sau phản ứng như thường quy (xem phần thực nghiệm 3.2.2) sẽ cho madecassic acid 2,3,23-triacetate (175), hiệu suất 85%. Trong phản ứng này nhóm α-hydroxy ở vị trí C-6 không bị acetyl hóa do sự che chắn không gian của các nhóm C-24, C-25, C-26. Điều đó được chứng minh như sau: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 175 ta thấy xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm acetyl methyl đồng thời các methyl proton ở C-2, C-3, C-23 đã được dịch chuyển nhiều về phía trường thấp và xuất hiện tại H (ppm): 3,72 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,93 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,24 (1H, dt, J = 5,0, 10,5 Hz, H-2). So với phổ của madecassic acid (10) các tín hiệu tương ứng xuất hiện tại 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,76 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2), và H-23b bị chồng lấp với tín 15
hiệu dung môi methanol. Trong khi tín hiệu của H-6α trong hợp chất 175 hầu như không thay đổi và xuất hiện tại H (ppm): 4,34 (s), và ở 10 tín hiệu này là 4,40 (br s). Điều đó chứng tỏ nhóm 6-β-OH không bị acetyl hóa. Phù hợp với kết quả này phổ hồng ngoại của hợp chất 175 vẫn cho các đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxy ở 3534 cm-1 bên cạnh 2 đỉnh hấp thụ mạnh ở 1734 cm-1 và 1245 cm-1 của nhóm acetate. Phổ khối ion âm ESI-MS của 175 cho pic ion giả phân tử tại m/z: 629 [M-H]-. Hợp chất 175 được cho tác dụng với oxalyl chloride trong DCM ở nhiệt độ phòng để tạo thành acid chloride 176. Hợp chất 176 không cần tách và tinh chế được cho phản ứng luôn với các amin tương ứng ở nhiệt độ phòng. Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng như trong phần thực nghiệm 3.3.2 thu được các amide tương ứng 177-185. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 177-185 được khẳng định thông qua phổ khối, phổ 1H- và 13C-NMR của chúng. Hợp chất 177: Phổ 1H-NMR của hợp chất 177 có chứa thêm các tín hiệu của mạch nhánh amide thông qua các tín hiệu cộng hưởng của 4 proton trong nhóm – CH2-OH tại H (ppm): 3,73 (4H, br s, H-2', -OH) và tín hiệu của 4 proton của nhóm –NCH2 tại 3,53-3,56 (2H, br s, H-2'); các tín hiệu khác trùng hợp với phổ của 175. Ở phổ 13C-NMR của hợp chất 177 có xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm – CH2OH ở mạch nhánh tại C ppm = 61,53 (C-2'), 60,91 (C-2'). Hợp chất 178: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu của nhóm –NH-CH2- tại H: (7,31 (t, J = 5,5 Hz, –NH) và 7,39 (t, J = 5,5 Hz, –NH) đồng phân) bên cạnh các tín hiệu tại 3,61 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3', -CH2-OH), 3,27-3,36 (1H, m, H-1', -CH2-NH-), 3,18-3,22 (1H, m, H-1', -CH2-NH-). Tín hiệu của nhóm –CH2 còn lại của mạch nhánh xuất hiện trùng với các tín hiệu của khung trong vùng trường cao hơn. Phổ 13C-NMR của hợp chất này xuất hiện các tín hiệu của nhóm methylene xen lẫn với các tín hiệu khác của khung madecassic acid trong vùng trường cao và tín hiệu của -CH2-OH tại C: 61,52 (C-3'). Phổ hồng ngoại của hợp chất này có chứa cụm tín hiệu mạnh của nhóm –OH liên kết cầu hydro tại 3500 và 3379 cm-1 cùng với đỉnh hấp thụ tại 1584 cm-1. Điều đó chứng tỏ hợp chất 178 đã được tạo thành như trong sơ đồ phản ứng. Hợp chất 179: So với phổ 1H-NMR của hợp chất 175 thì trong phổ 1H-NMR của hợp chất 179 xuất hiện thêm các tín hiệu của hai methyl doublet của nhóm isopropyl chồng lấp với các tín hiệu của khung madecassic acid triacetate trong vùng H: 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,07 (3H, s) cùng với các tín hiệu khác của mạch nhánh tại H: 5,59 (1H, d, J = 7,0 Hz, -NH), 3,84-3,88 (1H, m, H-1', -NH- CH-(CH3)2). Phù hợp với phổ 1H-NMR, ở phổ 13C-NMR của hợp chất 179 có chứa các tín hiệu cộng hưởng của carbon tương ứng trong mạch nhánh. Hợp chất 180: Phổ 1H-NMR của hợp chất 180 thấy xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm –NH2 amide tại H (ppm): 5,83 (1H, br s, -NH2) và 6,34 (1H, br s, -NH2) so với hợp chất 175. Phổ hồng ngoại của hợp chất 180 có đỉnh hấp thụ mạnh tại 3478 cm-1 (- NH2) cùng với đỉnh hấp thụ tại 1660 cm-1 (-CN). Trong phổ khối ESI-MS ion dương 16
của hợp chất 180 có pic m/z 652 [M+Na]+ phù hợp với CTPT của hợp chất 180 là C36H55NO8. Như vậy phản ứng đã xảy ra như dự kiến ở Sơ đồ 4. 3. Hợp chất 181: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 181 thấy xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng của mạch nhánh tại H: 2,69 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,12- 3,15 (2H, m, H-7’). Các tín hiệu của các proton còn lại của mạch nhánh trùng lặp với các proton khác trong khung ở vùng trường cao. Phổ 13C-NMR của chất này có xuất hiện các tín hiệu của nhóm –CH2 mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu carbon của khung. Trong phổ khối ESI-MS ion dương thấy xuất hiện mảnh ion tại m/z 743 [M+H]+ phù hợp với CTPT C43H70N2O7 của hợp chất 181. Điều đó chứng minh phản ứng xảy ra như dự kiến. Hợp chất 182: Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 182 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 771 [M+H]+ phù hợp với CTPT C45H74N2O8 của hợp chất 182. Phù hợp với kết quả này trên phổ 1H-NMR của hợp chất 182 xuất hiện cụm tín hiệu tại H: 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,09-3,20 (2H, m, H-9’). Các tín hiệu khác của nhóm methylene mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu của khung madecassic acid trong vùng trường thấp. Phổ 13C-NMR của chất này có xuất hiện thêm các tín hiệu của nhóm methylene mạch nhánh xen lẫn trong vùng tín hiệu của khung. Như vậy cấu trúc của hợp chất 182 đã được khẳng định. Hợp chất 183: Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 183 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 785 [M+H]+ phù hợp với CTPT C46H76N2O8 của hợp chất 183. Phổ 1H-NMR của chất này có các tín hiệu của nhóm –CH2-NH2 tại H: 2,13-2,39 (1H, m, H-1’), 2,55-2,57 (1H, m, H-1’), 3,02-3,09 (2H, m, H-10’). Các tín hiệu proton của các nhóm CH2 khác chồng lấp với các proton của khung trong vùng trường cao. Phổ 13C-NMR cũng phù hợp với cấu trúc trên khi có chứa các tín hiệu của nhóm methylene xuất hiện trùng với các tín hiệu khác của khung. Điều đó chứng tỏ phản ứng tổng hợp 183 đã xảy ra như dự kiến (Sơ đồ 4. 3). Trên phổ 1H-NMR của amide 184 quan sát thấy tín hiệu triplet ở δ (ppm): 5,41 (1H, t-like, -NH) đặc trưng cho liên kết amide. Ngoài các tín hiệu phổ của 175, còn quan sát thấy tín hiệu ở δ (ppm): 3,19-3,20 (1H, m, H-1’a), 3,29-3,30 (1H, m, H- 1’b), 4,12 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1’’) nhóm tín hiệu và hằng số tương tác này đặc trưng cho độ dịch chuyển hóa học nhóm methylene của glycine. Trong phổ 13C-NMR có các tín hiệu của nhóm methylene gắn với -COOCH2CH3 của mạch nhánh xuất hiện tại C : 62,20 ppm (C-1’’). Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 716 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H61NO10. Trên phổ 1H-NMR của amide 185 ngoài các tín hiệu của 175, quan sát thấy sự xuất hiện 3 tín hiệu singlet của các proton vòng imidazole ở δ (ppm): 7,04 (1H, s, H-4’), 7,52 (1H, s, H-2’), 8,24 (1H, s, H-5’). Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của mạch nhánh imidazole ở δ (ppm): 138,05 (C-2’), 129,87 (C-5’), 119,37 (C-4’). Hợp chất 186-191: Từ các hợp chất 177-183 được thủy phân trong dung dịch KOH trong MeOH ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ. Xử lý hỗn hợp phản ứng như 17
trong phần thực nghiệm 3.3.2. Sau khi tinh chế sản phẩm thu được các hợp chất 186-191 với hiệu suất từ 75-90%. Cấu trúc của các hợp chất 186-191 cũng được khẳng định khi phân tích phổ IR, MS, NMR của chúng. Hợp chất 186: Phổ khối ESI-MS của hợp chất 186 có pic ion giả phân tử tại m/z 592 [M+H]+ phù hợp với CTPT C34H57NO7 của hợp chất 186. Phổ 1H-NMR của hợp chất này không thấy sự có mặt của các nhóm methyl singlet của acetyl quanh vùng H khoảng 2 ppm. Thêm vào đó phổ 1H-NMR có các pic của proton gắn với carbon mang oxy tại vị trí C-2, C-3, C-23, C-6 xuất hiện tại H (ppm): 4,00-4,04 (3H, m, H-23a, H-23b,-OH), 4,16-4,17 (1H, m, H-2), 4,24 (1H, br s, H- 6), 4,31 (1H, br s, H-3) ngoài ra còn thấy các tín hiệu cộng hưởng của nhóm –OH tại H là 4,72 (2H, br s, -OH) và 4,03 (1H, br s) bên cạnh các tín hiệu xuất hiện tại H từ 3,10–3,11 (2H, m, H-1’), và 3,19-3,20 (2H, m, H-1’), 3,47-3,49 (4H, m, H- 2’). Phù hợp với kết quả trên, phổ 13C-NMR của hợp chất này cũng không chứa các tín hiệu cộng hưởng của nhóm acetyl carbonyl quanh vùng 170 ppm cũng như các tín hiệu acetyl methyl ở vùng trường cao. Các kết quả trên phù hợp với sản phẩm tạo thành theo Sơ đồ 3. Hợp chất 187: Trên phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 187 có chứa các đỉnh hấp thụ mạnh của các nhóm –OH liên kết cầu hydro từ 3500-3379 cm-1, đỉnh hấp thụ của nhóm chức acetate cũng không xuất hiện trong phổ IR. Trong phổ 1H- NMR không xuất hiện các tín hiệu methyl singlet tại H trong khoảng 2 ppm đồng thời xuất hiện tín hiệu tại 7,28 (t, J = 5,5 Hz, -NH), 7,36 (t, J = 5,5 Hz, -NH), các tín hiệu của H-2, H-3, H-23a và H-23b đã dịch chuyển về phía trường cao và xuất hiện tại H: 3,32-3,33 (H-3’ chồng lấp), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,59- 3,63 (3H, m, H-3, H-23b, H-3’), 3,73-3,76 (1H, m, H-2). Điều đó chứng tỏ phản ứng thủy phân đã xảy ra hoàn toàn. Hợp chất 188: Phổ 1H-NMR của hợp chất 188 có chứa các tín hiệu của proton gắn với carbon mang oxi chuyển dịch về phía trường cao xuất hiện tại H (ppm): 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,79 (1H, m, H-2) trong khi tín hiệu của H-6α không thay đổi xuất hiện tại H: 4,40 ppm (1H, s). Phổ 13C-NMR của hợp chất này cũng không có các tín hiệu cộng hưởng của nhóm acetyl carbonyl trong vùng khoảng 170 ppm, và các nhóm acetyl methyl ở vùng trường cao. Chứng tỏ hợp chất 188 đã được tạo thành. Phổ ESI-MS ion dương cho mảnh ion tại m/z là 488 (100, [M+3-H2O]3+). Phổ hồng ngoại cho thấy cụm đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxyl liên kết cầu hydro trong vùng 3500-3245 cm-1. Như vậy cấu trúc của hợp chất này đã được khẳng định phù hợp với CTPT là C30H49NO5. Hợp chất 189: Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này có pic ion giả phân tử tại m/z là 617 (100, [M+H]+) phù hợp với CTPT C37H64N2O5 của nó. Phổ 1 H-NMR có tín hiệu của nhóm –NH2 tại H: 7,14 (t, J = 5,5 Hz, – NH) và 7,20 (t, J = 5,5 Hz, – NH) và các tín hiệu proton gắn với carbon mang oxy cũng bị dịch 18