Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hoá học: Phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus và Toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn Bungarus fasciatus

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:35

Thêm vào BST

Báo xấu

17
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án này nhằm khảo sát hoạt tính và xác định cấu trúc của một số hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp H. laoticus và một số hợp chất có hoạt tính giảm đau và kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus, nhằm ứng dụng trong y dược. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hoá học: Phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus và Toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn Bungarus fasciatus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN VŨ THIÊN PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9 44 01 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC TP.Hồ Chí Minh – 2021
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: TSKH. Hoàng Ngọc Anh Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Phùng Văn Trung Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201…. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
3 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Các độc tố tự nhiên từ cây cỏ, nấm, sinh vật biển, ốc sên hoặc động vật có một vai trò quan trọng trực tiếp hoặc gián tiếp trong sự phát triển thuốc. Nọc độc động vật chứa nhiều độc tố nhằm để săn mồi hoặc tự vệ. Rất khó để có thể xác định chính xác loại nọc độc hoặc số lượng độc tố nó tạo ra. Nọc độc động vật và độc tố của nó (từ rắn, bò cạp, rết, ốc, thằn lằn, ếch, cá và côn trùng) đã được khảo sát để tìm ra hoạt tính sinh học và khả năng trị liệu của nó. Những độc tố đó đã được chỉ ra là thể hiện nhiều hoạt tính dược học như: gây độc cơ, độc thần kinh, hạ huyết áp, xuất huyết, ức chế sự kết tập tiểu cầu, chống đông máu, kháng viêm, giảm đau, kháng ung thư và diệt khuẩn. Bakhle đã cho thấy thuốc Catopril được tạo thành từ nọc loài rắn Brazil, Bothrops juraraca, nổi lên như thuốc kiểm soát hạ huyết áp và trụy tim khi bị nhồi máu cơ tim. Cobrotoxin được phân lập từ loài rắn hổ mang Đài Loan, Naja naja atra , được cho là có ảnh hưởng làm giảm đau. Hanalgesin, một độc tố thần kinh alpha (α-neurotoxin) dây dài từ loài rắn hỗ chúa (King Cobra) thể hiện hoạt tính giảm đau trên chuột, nó tạo ra giảm đau ở nổng độ 16-32 ng/g mà không gây ra nhiều tác dụng phụ lên thần kinh hay cơ. Crotamine cũng được báo cáo là có ảnh hưởng làm giảm đau ở nồng độ thấp nhưng không rõ ràng trong độc tính in vivo. Ảnh hưởng gây giảm đau của Crotamine cao hơn Morphin khoảng 30 lần và được chứng minh là liên quan đến cả cơ chế giảm đau trung ương và ngoại biên. Batroxobin, một enzym từ nọc loài rắn Bothrops atrox (loài rắn lục tìm thấy ở Nam và Trung Mỹ) có đặc tính giống huyết khối có khả năng cầm máu ở nồng độ thấp và chống đông máu ở nồng độ cao. Hoạt tính giảm đau cũng được chứng minh từ nọc bò cạp và những độc tố peptide của nó. Peptide có hoạt tính giảm đau-kháng khối u từ nọc bò cạp Bothus martense thể hiện tính ức chế mạnh trên cả đau nội tạng và ngoài da cũng như hoạt tính kháng khối u trên khối u E. ascites và tế bào xơ hóa S-180. Những độc tố beta (β-toxins) từ nọc bò cạp cũng được sử dụng như công cụ dược lý trong nghiên cứu việc kích hoạt điện áp kênh ion Na+. Cardiotoxin 3 (CTX 3), một polypeptide chứa 60 amino axit với hoạt tính kháng ung thư được phân lập từ rắn Naja naja atra. CTX 3 ức chế sự phát triển của dòng tế bào K562 phụ thuộc vào nồng độ và thời gian khảo sát. Một độc tố protein bền nhiệt (drCT-I) có KLPT 7.2 kDa được phân lập từ loài rắn lục Ấn Độ (Daboia russelli russelli) có hoạt tính chống đông máu, gây độc tế bào chết theo chương trình apoptosis. Phospholipase A2 (PLA2), được phân lập từ nọc loài Bothrops newweidii có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào gây khối u ác tính B16 F10. Nọc độc từ loài bò cạp đen Heterometrus bengalensis ức chế sự phát triển của dòng tế bào U937 và K562. Chlorotoxins lần đầu tiên được phân lập từ nọc của loài bò cạp Leiurus quinquestriatus, có độc tính trên dòng tế bào khối u não, nó có thể liên kết với nhiều khối u não trước khác nhau với tính đặc hiệu trên 90%. Bengalin, một protein có KLPT cao được tách từ nọc bò cạp đen Ấn Độ Heterometrus bengalensis cũng thể hiện hoạt tính kháng ung thư trên dòng tế bào U937 và K562. Xuất phát từ những dược tính nêu trên và nhằm tìm ra các hợp chất có khả năng trị liệu hiệu quả để phát triển việc điều chế thuốc mới trong tương lai, nên luận án này tập trung vào nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của một số chất mới từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus (phân bố ở An Giang) và từ nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus (phân bố ở Vĩnh Phúc). 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
4 Nghiên cứu phân lập, khảo sát hoạt tính và xác định cấu trúc của một số hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp H. laoticus và một số hợp chất có hoạt tính giảm đau và kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus, nhằm ứng dụng trong y dược. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Phân lập và làm sạch một số hợp chất mới từ nọc bò cạp H. laoticus và rắn cạp nong B. fasciatus. Khảo sát hoạt tính chống đông máu, giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư của nọc toàn phần, và các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp H. laoticus và rắn cạp nong B. fasciatus. Xác định cấu trúc của một số hợp chất có hoạt tính sinh học đã được làm sạch bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN Trình bày tổng quan các nghiên cứu trong nước và quốc tế về nọc bò cạp và nọc rắn cùng một số phương pháp được sử dụng để phân lập, làm sạch và xác định cấu trúc bậc một của toxin, peptide, protein tách ra từ nọc bò cạp và nọc rắn. CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là nọc bò cạp đen H. laoticus (An Giang) và nọc rắn cạp nong B. fasciatus (Vĩnh Phúc). 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu và thực nghiệm 2.2.1. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H. laoticus và rắn cạp nong B. fasciatus Hình 2.1. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H. laoticus
5 Hình 2.2. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus 2.2.2. Khảo sát hoạt tính sinh học Khảo sát hoạt tính của các phân đoạn và toxin, protein tách ra trên các mô hình: hoạt tính đông-chảy máu trên mô hình cắt đuôi chuột của Barker [99], Liu [100]; Tác động giảm đau ngoại biên được nghiên cứu bằng mô hình đau quặn bằng acid acetic của Koster [103]; Tác động giảm đau trung ương được nghiên cứu bằng mô hình (kích thích nhiệt) nhúng đuôi chuột của Lanhers và Williamson [103]; Khảo sát khả năng gây độc tế bào ung thư lên tế bào ung thư vú MCF7 và ung thư phổi A549 theo phương pháp khảo nghiệm MTT của Tim Mosmann [104- 106]. 2.2.3. Phân tích thống kê kết quả Các số liệu được thống kê và trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (Standard error of mean: sai số chuẩn của giá trị trung bình). Phần mềm sử dụng thống kê là Minitab 14.0, các biểu đồ được vẽ bằng phần mềm SigmaPlot 11.0. Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05 (độ tin cậy là 95%). 2.2.4. Xác định cấu trúc của các chất có hoạt tính sinh học KLPT và cấu trúc của các chất có hoạt tính chống đông máu tách ra từ nọc bò cạp H.laoticus được xác định bằng phương pháp khối phổ (ESI-MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR) KLPT và trình tự amino acid của các protein tách ra từ nọc rắn B.fasciatus được xác định bằng phương pháp khối phổ MALDI-TOF/TOF-MS, HR-ESI-MS/MS, hệ RP-HPLC ghép nối hệ Q Exactive HF Benchtop Orbitrap MS/MS. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả về bò cạp H. laoticus 3.1.1. Sắc ký lọc gel nọc bò cạp H. laoticus Từ nọc bò cạp H. laoticus thô, tiến hành chạy sắc ký lọc gel Sephadex G-50 thu được 5 phân đoạn (PĐ1 - PĐ5) với sắc ký đồ như Hình 3.1.
6 Hình 3.1. Sắc ký đồ của nọc bò cạp H.laoticus Khối lượng chạy sắc ký lọc gel của từng phân đoạn sau khi đông khô được thể hiện ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Khối lượng 5 phân đoạn nọc bò cạp H. laoticus sau khi chạy lọc gel Lượng nọc % từng phân đoạn/ tổng Phân đoạn thu được (mg) lượng nọc thu được 1 (PĐ1) 66,700 4,348 2 (PĐ2) 126,200 8,227 3 (PĐ3) 188,200 12,269 4 (PĐ4) 451,200 29,415 5 (PĐ5) 701,600 45,740 Trong 5 phân đoạn thu được, phân đoạn 5 (PĐ5) chiếm tỷ lệ cao nhất với 45,740%, kế đến là phân đoạn 4 là 29,415%. Qua kết quả sắc ký lọc gel cùng với kết quả khảo sát tác động chống đông máu của năm phân đoạn (PĐ1 – PĐ5) ở hai liều thử nghiệm là 1/10 LD50 và 1/20 LD50 (PL2) [9] cho thấy, trong 5 phân đoạn (PĐ1 – PĐ5) thì có ba phân đoạn có tác động đến quá trình đông – chảy máu là các phân đoạn: PĐ2, PĐ4 và PĐ5 (Bảng 3.2 và 3.3). Do phân đoạn 5 có hàm lượng nhiều và KLPT tương đối nhỏ nên trong nghiên cứu này đã chọn phân đoạn 5 để tiếp tục phân lập và làm sạch nhằm xác định hoạt chất chính trong các phân đoạn thứ cấp được tách ra bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) và khảo sát tác động chống đông máu của chúng trên chuột. 3.1.2. Tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) Quá trình phân tách phân đoạn 5 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với các thông số của quá trình chạy sắc ký: - Tốc độ dòng : 2 mL/phút. - Thể tích mỗi lần tiêm mẫu : 100 µL - Thời gian rửa giải : 0 – 35% dung môi B trong 70 phút. - Mật độ quang tại bước sóng  : 226 nm. - Cột XDB - C18 (9,4 × 250 mm, 5 µm). Với điều kiện trên, từ phân đoạn 5 đã phân tách thành 24 phân đoạn thứ cấp (Hình 3.2). Các phân đoạn thứ cấp này được thu lại, đông khô và bảo quản để khảo sát tác động đông - chảy máu trên chuột.
7 Hình 3.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) trên cột XDB - C18 (9,4 × 250 mm, 5 µm) của phân đoạn 5 (PĐ5) nọc bò cạp 3.1.3. Tác động của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus lên quá trình đông - chảy máu 24 phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 thu được sau khi chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP- HPLC) được sử dụng để khảo sát tác động chống đông – chảy máu. Qua kết quả khảo sát cho thấy, trong 24 phân đoạn thứ cấp tách ra từ phân đoạn 5 thì có 6 phân đoạn thứ cấp 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 gây ra thời gian chảy máu và thời gian đông máu dài hơn so với chất chứng (PL5), nghĩa là 6 phân đoạn thứ cấp 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 này có hoạt tính tác động lên quá trình đông - chảy máu. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4 và 3.5. Bảng 3.4. Thời gian chảy máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 Thời gian khảo sát (phút) Mẫu 20 30 60 90 120 Thời gian chảy máu (giây) Chứng 64,00±3,06 27,00±0,97 67,00±3,25 69,00±5,78 80,50±2,72 PĐ 5.5 210,00±4,83 41,30±7,90 19,00±1,26 9,67±2,11 12,00±0,37 PĐ 5.10 125,00±4,91 85,00±6,66 18,00±0,52 88,50±5,49 40,00±7,06 PĐ 5.11 123,33±9,82 43,00±4,05 76,70±4,98 36,70±3,21 19,67±3,47 PĐ 5.16 139,00±5,50 54,67±3,75 16,67±1,52 46,00±5,13 30,33±4,40 PĐ 5.19 102,70±4,67 43,00±5,52 35,70±3,15 36,30±3,84 90,33±4,01 PĐ 5.22 180,00±7,42 37,70±3,44 18,00±1,71 53,33±0,56 22,33±2,09
8 Thời gian chảy máu (giây) Thời gian khảo sát (phút) Hình 3.3. Tác động của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 lên thời gian chảy máu Bảng 3.4 và hình 3.3 cho thấy: Các phân đoạn thứ cấp ảnh hưởng đến thời gian chảy máu trên chuột theo chiều giảm dần sau: 5.5 > 5.22 > 5.16 > 5.10 > 5.11 > 5.19, trong đó phân đoạn thứ cấp 5.5 gây ra thời gian chảy máu nhiều nhất, gấp 3,3 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.5: 210,00 giây, lô chứng: 64,00 giây), kế sau phân đoạn 5.5 là phân đoạn 5.22 gây ra thời gian chảy máu gấp 2,8 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.22: 180,00 giây, lô chứng: 64,00 giây), phân đoạn thứ cấp 5.19 gây ra thời gian chảy máu thấp nhất, gấp 1,6 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.19: 102,70 giây, lô chứng: 64,00 giây). Bảng 3.5. Thời gian đông máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 Thời gian khảo sát (phút) Mẫu 20 30 60 90 120 Thời gian đông máu (giây) Chứng 293,00±3,82 287,50±6,88 371,50±0,67 268,50±5,33 366,00±9,34 PĐ 5.5 458,70±9,73 360,33±1,93 341,30±8,59 383,70±8,42 284,30±1,86 PĐ 5.10 630,50±6,35 410,00±3,61 431,00±8,05 400,50±5,36 369,50±2,28 PĐ 5.11 409,00±6,73 427,70±8,27 405,00±6,08 367,30±8,03 266,33±4,51 PĐ 5.16 481,00±6,78 381,30±2,26 424,00±7,72 368,00±5,54 395,00±3,39 PĐ 5.19 470,00±7,89 498,00±5,70 531,00±6,35 445,00±4,23 403,00±7,33 PĐ 5.22 563,70±7,46 372,30±4,44 322,30±8,53 302,33±3,84 373,70±4,63
9 Thời gian đông máu (giây) Thời gian khảo sát (phút) Hình 3.4. Tác động của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính của PĐ5 lên thời gian đông máu Bảng 3.5 và hình 3.4 cho thấy: phân đoạn thứ cấp 5.5 gây ra thời gian đông máu gấp 1,6 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.5: 458,70 giây, lô chứng: 293,00 giây), phân đoạn 5.22 gây ra thời gian đông máu gấp 1,9 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.22: 563,70 giây, lô chứng: 293,00 giây), phân đoạn thứ cấp 5.19 gây ra thời gian đông máu gấp 1,6 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.19: 470,00 giây, lô chứng: 293,00 giây). 3.1.4. Làm sạch hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5.5 và 5.22 Sau khi khảo sát tác động lên quá trình đông – chảy máu của các phân đoạn thứ cấp tách từ phân đoạn 5 thì kết quả thu được là có 6 phân đoạn thứ cấp ảnh hưởng đến thời gian đông - chảy máu trên chuột là: 5.5; 5.10; 5.11; 5.16; 5.19 và 5.22. Do phân đoạn 5.5 và 5.22 có hoạt tính chống đông máu mạnh hơn các phân đoạn còn lại (đã khảo sát ở mục 3.1.3) nên được chọn để tiếp tục tiến hành làm sạch, xác định hoạt chất chính của hai phân đoạn này và khảo sát thêm hoạt tính chống đông máu. 3.1.4.1. Làm sạch phân đoạn 5.5 Quá trình làm sạch phân đoạn thứ cấp 5.5 với các thông số của quá trình chạy sắc ký: - Tốc độ dòng : 1 mL/phút. - Thể tích mỗi lần tiêm mẫu : 40 µL - Thời gian rửa giải : 0 – 10% dung môi B trong 40 phút. - Mật độ quang tại bước sóng  : 210 nm. - Cột XDB - C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm). Hình 3.5. Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.5
10 Tiến hành chạy mẫu thì phân đoạn 5.5 có phân đoạn chính là 5.5.1. Tiếp tục làm sạch phân đoạn 5.5.1 với điều kiện tương tự như phân đoạn 5.5 thu được toxin 5.5.1 có sắc ký đồ là: Hình 3.6. Sắc ký đồ RP-HPLC của chất có hoạt tính chống đông máu 5.5.1 3.1.4.2. Làm sạch phân đoạn 5.22 Quá trình làm sạch phân đoạn thứ cấp 5.22 với các thông số của quá trình chạy sắc ký: - Tốc độ dòng : 1 mL/phút. - Thể tích mỗi lần tiêm mẫu : 40 µL - Thời gian rửa giải : 15 – 30% dung môi B trong 30 phút. - Mật độ quang tại bước sóng  : 226 nm. - Cột XDB - C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm). Hình 3.7. Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.22 Khi chạy sắc ký làm sạch thì phân đoạn 5.22 có phân đoạn chính là 5.22.3. Tiếp tục làm sạch phân đoạn 5.22.3 với điều kiện tương tự như phân đoạn 5.22 thu được toxin 5.22.3 có sắc ký đồ là: Hình 3.8. Sắc ký đồ RP-HPLC của chất có hoạt tính chống đông máu 5.22.3
11 Hai toxin 5.5.1 và 5.22.3 thu được sau quá trình chạy sắc ký RP-HPLC sẽ tiếp tục được khảo sát thêm hoạt tính chống đông máu. 3.1.5. Hoạt tính chống đông máu của phân đoạn 5 và toxin 5.5.1, toxin 5.22.3, 5.21.1 (dipeptide Leu – Trp) Sau khi làm sạch được các hợp chất: 5.5.1, 5.22.3, tiến hành khảo sát hoạt tính chống đông máu của những chất này cùng với chất 5.21.1 (dipeptide Leu-Trp, do tác giả Võ Đỗ Minh Hoàng phân lập được cũng từ bò cạp H. laoticus nhưng từ phân đoạn 5.21 [8]) cùng với phân đoạn 5. Kết quả cho thấy: ● Cả 5.5.1, 5.22.3 và 5.21.1 (dipeptide Leu-Trp) đều thể hiện hoạt tính chống đông máu (Bảng 3.6): Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các hợp chất khảo sát lên quá trình đông máu ở chuột Thời gian sau khi tiêm (phút) Mẫu 20 30 60 90 120 Thời gian đông máu (giây) Chứng 307,7±17,4 290,67±9,58 286,00±6,31 256,3±20,4 229,7±13,2 PĐ 5 422,3± 8,4 * 391,7±48,1 * 387,5±35,0 360,2± 6,5 358,8±26,6 * 5.5.1 442,5±20,6 ** 426,2±25,6 ** 366,2±25,0 ** 428,3±51,1 296,3±37,4 5.21.1 (Leu- 401,5±31,2 340,8±29,1 300,3± 2,1 460,5±41,7 313,3±24,9 * Trp) 5.22.3 556,5±87,2 ** 426,2± 3,7 * 388,0±46,3 * 367,0±25,5 * 261,8±16,4 * p
12 hành khảo sát thêm hoạt tính đông - chảy máu của 5.22.3 ở thời gian ngắn hơn, đó là ngay sau khi tiêm mẫu (phút 0), kết quả được thể hiện ở bảng 3.8 và 3.9: Bảng 3.8. Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu Thời gian sau khi tiêm (phút) Mẫu 0 5 10 20 30 60 90 120 Thời gian chảy máu (giây) 384,5 ± 176,8 ± 120,7 ± 113,8 101,0 ± 83,33 ± 67,83 ± 59,17 5.22.3 68,2** 34,7** 13,8** ± 15,4* 13,0* 7,28* 5,85* ± 5,79 84,33 ± 75,83 ± 71,00 ± 67,83 64,33 ± 60,50 ± 46,83 ± 41,67 Chứng 4,72 2,88 4,57 ± 2,59 2,75 3,37 2,63 ± 7,83 * p
13 Hình 3.10. Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu. Sự sai khác có ý nghĩa thống kê: * p
14 Hình 3.11. Phổ MS của 5.5.1 Phổ NMR của 5.5.1 (PL6) Để xác định cấu trúc của toxin 5.5.1 thì 5.5.1 được đo phổ 1H-NMR và 13C-NMR với dung môi DMSO-d6 trên máy cộng hưởng từ hạt nhân 500 MHz (Bruker AM500 FT-NMR). Thu được kết quả phổ 1H-NMR và 13 C-NMR của 5.5.1 cùng với số liệu phổ tham khảo của Adenosine từ nguồn HMDB, BMRB và ChemicalBook như Bảng 3.10. Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.5.1 và hợp chất tham khảo Hợp chất tham khảo C 5.5.1 Adenosine Adenosine Adenosine (Số) [PL7] [PL8] [PL9] δCa,b δHa,b δC c,d δHa,e δC f,e δHf,b δC c,b δHc,b 2 152,3 8,33(s) 152,0 8,38 155,2 8,28 (s) 155,3 8,19 4 149,0 148,9 151,1 151,2 5 119,3 119,6 121,8 121,9 6 156,1 155,4 158,4 158,4 8 139,8 8,13 (s) 141,4 8,16 143,2 8,11 (s) 143,3 8,31 1’ 87,8 5,87 (d) 88,9 5,90 90,9 6,02 (d) 91,0 6,05 2’ 73,3 4,61(q) 74,3 4,64 76,4 4,80 (s) 73,4 4,43 3’ 70,6 4,14 (m) 71,0 4,17 73,3 4,43 (dd) 76,4 4,79 4’ 85,8 3,96 (q) 86,2 3,99 88,4 4,30 (q) 88,6 4,29 3,55 (m); 3,58 3,94 (dd) 3,88 5’ 61,6 62,0 64,2 64,2 3,65 (m) 3,69 3,85 (dd) 3,88 6-NH2 7,31 (s) 7,41 2’-OH 5,40 (m) 5,51 3’-OH 5,41 (m) 5,24 5’-OH 5,14 (d) 5,48 a,c,f đo trong DMSO-d6, D2O, H2O; b,d,e 500 MHz, 50MHz, 400MHz. [PL7]: Tham khảo dữ liệu phổ từ ChemicalBook. [PL8]: Tham khảo dữ liệu phổ từ HMDB (Human Metabolome Database). [PL9]: Tham khảo dữ liệu phổ từ BMRB (Biological Magnetic Resonance Data Bank). Phổ 1H-NMR cho thấy: các proton ở δH: 3,0 – 4,5 ppm (-O-C-H) là H-C-2’, H-C-3’, H-C-4’, H-C-5’; 0,5 – 6,0 ppm (-OH- Alcol) là C-2’-OH, C-3’-OH, C-5’-OH; Ở 7,3 ppm là proton của amine gắn với vòng
15 Purine (C-6-NH2); Proton (vòng Purine) ở 8 – 8,5 là H-C-2, H-C-8; Do ảnh hưởng của cả N và O nên H-C-1’ ở khoảng  5,9 ppm. Phổ 13C-NMR cho thấy: Năm nguyên tử carbon sp3 liên kết trực tiếp với nguyên tử oxi (50 – 100 ppm) là (C-1’, C-2’, C-3’,C-4’, C-5’) cộng hưởng tại 87,8; 73,3; 70,6; 85,5 và 61,6 ppm, trong đó có bốn carbon methine C-1’, C-2’, C-3’, C-4’ và một carbon methylene C5’. Có năm carbon sp2 C=C (100 – 150 ppm): C-2, C-4, C-5, C-6, C-8 cộng hưởng tại 152,3; 149,0; 119,3; 156,1 và 139,8 ppm, do việc cho điện tử từ hai nguyên tử nitơ nên C-2, C-4, C-6, C-8 có trường thấp hơn C-5 (119,3 ppm). Qua số liệu phổ MS, 1H-NMR và 13C-NMR cùng với so sánh số liệu phổ tham khảo (ChemicalBook, BMRB, HMDB) thì 5.5.1 chính là adenosine với cấu trúc như hình 3.12. NH2 N 6 8 5 N N 4 2 HO 5' N O 4' 1' 3' 2' A OH OH Hình 3.12. Cấu trúc của toxin 5.5.1 (Adenosine) A: Cấu trúc phẳng của Adenosine ; B : Cấu trúc không gian của Adenosine 3.1.6.2. Cấu trúc của toxin 5.22.3 Sau khi làm sạch đươc hợp chất 5.22.3 có hoạt tính chống đông máu và cũng tiến hành xác định KLPT bằng phổ khối lượng (ESI-MS) thì KLPT của 5.22.3 là 317,133 Da (Hình 3.13). KLPT của chất này gần bằng với KLPT của chất 5.21.1 là 317,974 Da (chất 5.21.1 là dipeptide Leu-Trp đã được tác giả Võ Đỗ Minh Hoàng phân lập từ phân đoạn 5.21 bò cạp H. laoticus [8]). Bên cạnh đó chất 5.22.3 cũng được đo thêm phổ 1H-NMR và 13C-NMR để xác định cấu trúc. Hình 3.13. Phổ MS của 5.22.3
16 Phổ NMR của 5.22.3 (PL10) Do 5.21.1 và 5.22.3 có KLPT gần giống nhau là 317 Da nhưng thu được ở hai phân đoạn thứ cấp khác nhau của cùng loài bò cạp H. laoticus (phân đoạn 5.21 và 5.22) khi làm sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC), có nghĩa là các chất 5.21.1 và 5.22.3 là 2 chất đồng phân của nhau. Vì vậy, do hợp chất 5.21.1 đã được xác định là Leu-Trp nên hợp chất 5.22.3 có thể là Ile-Trp. Để xác định chính xác cấu trúc thì hợp chất 5.22.3 được đo phổ 1H-NMR và 13C-NMR trong dung môi DMSO-d6 với máy cộng hưởng từ hạt nhân 500 MHz (Bruker AM500 FT-NMR). Thu được kết quả phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 5.22.3 cùng với số liệu phổ tham khảo của Ile-Trp từ [107] như Bảng 3.11. Phổ 1H-NMR cho thấy: proton (δH): (Alkan) R-CH3 (0,7 – 1,3 ppm) là H-C-5’, và H-C-6’; R-CH2-R (1,2 – 1,4 ppm) là H-C-4’; R3-CH (1,4 - 1,7 ppm) là H-C-3’; Ở 7 - 8 ppm là proton của vòng thơm (H-C-8, H-C-9, H-C-10, H-C-11); N-H (Amid) ở 8 – 9 là (C-2 - NH – C-1’); N-H (Pirol) ở khoảng  11 ppm là (C-5 - NH – C-7). Proton dạng Hα ở -CH-N- (3,5 – 5,0 ppm) là H-C-2 và H-C-2’. Proton dạng Hβ ở -N-C- CH2- (2,0 – 3,0 ppm) là H-C-3. Phổ 13C-NMR cho thấy: Hai nguyên tử carbon sp3 không kề nguyên tử có độ âm điện mạnh dạng R- CH3 (8 – 30 ppm): C-5’, C-6’ cộng hưởng tại 11,1 và 14,6 ppm; carbon sp3 dạng R-CH2-R (15 – 55 ppm): C- 3, C-4’ cộng hưởng tại 36,4 và 23,4 ppm, do ảnh hưởng của vòng Pirol nên C-3 có trường thấp hơn C-4’; carbon sp3 dạng -CH-R3 (20 – 60 ppm): C-3’cộng hưởng tại 26,9 ppm. Carbon sp3 kề nhóm gây hiệu ứng rút điện tử -C-N- (30 – 65 ppm): C-2, C-2’ cộng hưởng tại 56,7; 53,0 ppm (do ảnh hưởng của vòng Pirol nên C-2 có trường thấp hơn C-2’). Hai carbon nhóm C=O dạng acid, amid (155 – 185 ppm): C-1 và C-1’ cộng hưởng tại 172,7 ppm. Có tám carbon sp2 C=C (100 - 150): C-4, C-5, C-7, C-8, C-9, C-10, C-11, C-12 trong đó có ba carbon bị thế hoàn toàn (C-4, C-7, C-12) cộng hưởng tại 109,3; 136,0 và 127,0 ppm và nhờ nối trực tiếp với nitơ nên C-7 (136,0 ppm) có trường thấp hơn hai carbon C-4 và C-12; năm carbon sp2 dạng methine còn lại (C-5, C-8, C-9, C-10, C-11) cộng hưởng tại 123,7; 111,3; 120,9; 118,3 và 118,0 trong đó C-8, C-9, C- 10, C-11 là bốn carbon của nhân thơm (110 – 175 ppm). Qua số liệu phổ MS, 1H-NMR và 13C-NMR cùng với so sánh số liệu phổ tham khảo thì hợp chất 5.22.3 chính là dipeptide Isoleucine – Triptophan (Ile – Trp) với cấu trúc như hình 3.14.
17 Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.22.3 và hợp chất tham khảo Hợp chất tham khảo C 5.22.3 (Số) (Ile -Trp) [107] δCa,b δHa,b δCa,b δHa,b 1’ 172,7 165,2 2’ 53,0 3,58 (d) 63,0 3,78 3’ 26,9 1,81 (t) 39,7 1,97 1,45 (m) 1,55 4’ 23,4 24,5 1,12 (m) 1,24 5’ 11,1 0,82 (t) 11,3 0,92 6’ 14,6 0,91 (d) 15,3 1,01 1 172,7 167,4 2 56,7 4,54 (d) 55,1 4,13 3,17 (m) 3,22 3 36,4 28,8 3,06 (m) 3,07 4 109,3 109,1 5 123,7 7,18 (d) 124,2 7,06 7 136,0 136,5 8 111,3 7,33 (d) 110,6 7,28 9 120,9 7,05 (t) 120,5 7,01 10 118,3 6,97 (t) 118,2 6,93 11 118,0 7,53 (d) 118,9 7,59 12 127,0 128,2 5-NH-7 10,87 (s) 10,83 2-NH-1’ 8,59 (d) 7,96 a đo trong DMSO-d6 ; b 500 MHz. 6' O 3' 1' NH 8 ' ' 4 2 NH 5 7 9 5' NH2 2 4 12 10 HO 3 11 1 A O Hình 3.14. Cấu trúc của toxin 5.22.3 (Ile-Trp) A: Cấu trúc phẳng của Ile – Trp ; B : Cấu trúc không gian của Ile - Trp Như vậy, từ nọc bò cạp H. laoticus đã phân lập được hai hợp chất có hoạt tính chống đông máu đó là: 5.5.1 và 5.22.3. Hai hợp chất này được xác định cấu trúc tương ứng là adenosine và dipeptide Ile – Trp. Cho đến nay trong các tài liệu đã công bố chưa có thông tin về việc phát hiện trong nọc bò cạp H. laoticus có adenosine và các dipeptide Leu-Trp và Ile-Trp hay hoạt tính chống đông máu của các hợp chất này. Vì vậy, đây là lần đầu tiên adenosine và dipeptide Ile – Trp phân lập được từ nọc bò cạp H. laoticus. 3.2. Kết quả về rắn cạp nong B. fasciatus 3.2.1. Sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B. fasciatus
18 Nọc rắn cạp nong B .fasciatus được tiến hành sắc ký trên cột với gel Superdex HR75 tách ra làm 5 phân đoạn (BF1 – BF5) (Hình 3.15). Khối lượng của các phân đoạn sau khi đông khô được trình bày trong bảng 3.12. Bảng 3.12. Khối lượng 5 phân đoạn nọc rắn B. fasciatus sau khi chạy lọc gel. % từng phân đoạn/tổng lƣợng nọc Phân đoạn mg thu đƣơc BF1 7,8026 5,895 BF2 21,5760 16,301 BF3 53,9840 40,786 BF4 11,8528 8,955 BF5 37,1442 28,063 Trong các phân đoạn thu được thì phân đoạn BF3 chiếm nhiều nhất (gần 41%). 3.2.2. Xác định KLPT các phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus bằng phương pháp điện di Khảo sát thành phần protein thì bằng chạy điện di trên gel polyacrylamide 15% có mặt 10% SDS, cho thấy (Hình 3.16): - Phân đoạn 1 (BF1) chứa các protein có KLPT lớn hơn 116,0 kDa, các protein khác có KLPT nằm trong khoảng 66 kDa và nhỏ hơn, ngoài ra còn có các polypeptid có KLPT nằm khoảng 13-15 kDa tương đương với KLPT của enzyme phospholipase A2 - Phân đoạn 2 (BF2) chứa các protein có KLPT nằm trong các khoảng: 66 kDa, 30,0 kDa và 13-15 kDa. - Phân đoạn 3 (BF3) chứa chủ yếu các polypeptide có KLPT 13-15 kDa đó là các phospholipase A2 . - Phân đoạn 4 (BF4) chứa chủ yếu các phospholipase nằm khoảng 13-15 kDa và các neurotoxin của nọc rắn có KLPT khoảng từ 6- 10 kDa. - Phân đoạn 5 (BF5) chứa các phospholipase nằm khoảng 13-15 kDa và neurotoxin nọc rắn có KLPT khoảng 7,0 kDa. Hình 3.15. Hình sắc ký lọc gel của nọc rắn Hình 3.16. Hình điện di nọc rắn cạp nong cạp nong B.fasciatus B.fasciatus
19 Kết quả chạy điện di cho thấy được sơ bộ KLPT của các phân đoạn đã tách ra từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus. Trong đó, thành phần phospholipase với KLPT ở khoảng 13 – 15 kDa có mặt trong tất cả các phân đoạn. 3.2.3. Tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn theo phương pháp gây đau quặn bằng acetic acid Tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong toàn phần và các phân đoạn (BF1 – BF5) được tiến hành thử nghiệm ở liều 0,34 mg/kg theo phương pháp mô tả như ở mục 2.4.4.1. Sau 30 phút cho dùng thuốc, tất cả các chuột được tiêm phúc mô dung dịch acetic acid 0,7%, sau đó quan sát biểu hiện đau quặn của chuột tại các thời điểm 5-10 phút, 20-25 phút, 35-40 phút và ghi nhận đươc kết quả như sau (Bảng 3.13, hình 3.17): Bảng 3.13. Số lần đau quặn của chuột ở liều 0,34 mg/kg do ảnh hưởng của BF1 – BF5. Thời gian khảo sát (phút) Mẫu 5 – 10 20 – 25 35 – 40 Số lần đau quặn Nhóm chứng 15,38 ± 1,93 9,88 ± 1,68 6,63 ± 1,16 (nước muối sinh lý) Nhóm đối chứng 5,38 ± 1,48** 2,13 ± 0,58** 0,38 ± 0,18** (Aspirin 50,0 mg/kg) BF 6,75 ± 2,02** 4,38 ± 1,18* 2,13 ± 0,58*# BF1 3,50 ± 1,35** 3,13 ± 0,99** 0,63 ± 0,26** BF2 6,29 ±1,19** 4,43 ± 1,17* 1,29 ± 0,52** BF3 10,25 ± 2,24 3,25 ± 1,05** 1,75 ± 0,70** BF4 2,43 ± 1,45** 1,00 ± 0, 54** 0,85 ± 0,34** BF5 7,25 ± 1,97* 4,13 ± 1,04* 2,38 ± 1,12* (*) p< 0,05, (**) p
20 Bảng 3.14. Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột ở liều 0,34 mg/kg do ảnh hưởng của BF1 – BF5. Thời gian khảo sát (phút) Mẫu Trƣớc tiêm 30 60 90 120 Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột (giây) C 1,74±0,15 1,55±0,14 1,74±0,10 1,73±0,14 1,73±0,06 ĐC 2,04±0,08 5,31±0,50** 6,51±0,44** 2,96±0,29* 2,17±0,12* BF 1,56±0,08 1,52±0,07 1,47±0,17 1,65±0,18 1,38±0,17 BF1 1,43±0,09 1,45±0,08 1,79±0,10 1,72±0,12 1,73±0,05 BF2 1,33±0,08 1,53±0,13 1,51± 0,17 1,49±0,11 1,41± 0,09 BF3 1,44± 0,07 1,42± 0,07 1,42±0,05*## 1,83±0,14 1,69±0,14 BF4 1,42±0,08 1,29±0,08 1,49±0,07 1,72±0,17 1,58±0,12 BF5 1,56±0,07 1,41±0,05 1,44±0,09 1,48±0,07 1,44± 0,08*## -Nhóm C: nước muối sinh lý -Nhóm ĐC: Morphin Chlorhydrat 5,0 mg/kg (*) p< 0,05, (**) p