Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu sự khác biệt trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị ở các mẫu sen trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:25

Thêm vào BST

Báo xấu

1
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật "Nghiên cứu sự khác biệt trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị ở các mẫu sen trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen" được nghiên cứu với mục tiêu: Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các mẫu sen trồng tại Huế dựa trên một số vùng gene chỉ thị và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen giống sen địa phương.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu sự khác biệt trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị ở các mẫu sen trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nguồn tài nguyên di truyền thực vật đóng một vai trò quan trọng đối với sản xuất nông nghiệp theo hướng đa dạng hóa, hiện đại hóa…Trong công tác khai thác và sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh giá đặc điểm kiểu gene là công đoạn vô cùng quan trọng không chỉ phục vụ cho việc xác định, phân biệt các giống/loài khác nhau mà còn giúp tìm hiểu mối quan hệ di truyền của chúng. Sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu và nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu di truyền về kiểu gene. Hiện nay, phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử trong việc định danh và nghiên cứu di truyền ngày càng được sử dụng phổ biến. Sử dụng vùng gene chỉ thị DNA barcode là một công cụ mới, đang được ứng dụng rộng rãi trên thế giới, dựa trên sự tiến hóa và sự khác biệt trình tự của các nucleotide cho phép phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống/loài khác nhau. N. nucifera là loài sen thuộc nhóm thực vật thủy sinh sống trong các ao hồ, đầm lầy, được trồng ở nhiều nơi trên thế giới. Ở Thừa Thiên Huế, hiện nay có nhiều giống sen màu sắc hoa khác nhau đang được trồng tại nhiều nơi ở các khu vực ngoại thành và nội thành. Sen Trắng Trẹt Lõm là giống sen Huế bản địa xưa, được biết đến như một giống sen cung đình rất nổi tiếng, đã được trồng từ xa xưa trên các hồ sen của khu vực nội thành, hồ lăng tẩm và các hồ sen thuộc vùng di tích của Cố đô Huế. Giống sen này có hương thơm dịu dàng, hoa trắng thanh khiết, củ và hạt sen có hương vị và chất lượng đặt biệt, mang thương hiệu “sen Huế”, rất được du khách ưa chuộng. Trong những năm gần đây, phong trào trồng sen ở Huế đã được đầu tư và phát triển mạnh. Một số địa phương đã chuyển đổi diện tích trồng lúa kém hiệu quả sang trồng sen lấy hạt. Do vậy, ngoài việc trồng các giống sen trắng có nguồn gốc lâu năm ở Huế, người dân cũng đã du nhập một số giống sen hồng từ các địa phương khác nhau về trồng ở Huế, đặc biệt là giống Sen Hồng Cao Sản - một giống sen chuyên cho hạt, mang nhiều đặc
2 tính vượt trội về điều kiện sống và cho năng suất cao hơn các giống sen địa phương. Việc trồng nhiều loại sen nội nhập ở Huế đã dẫn tới hiện trạng gây lẫn giống, thoái hóa giống và có nguy cơ làm giảm đi số lượng các giống sen bản địa, quý hiếm ở Huế. Cây sen đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống như trang trí nghệ thuật, hoa cảnh, văn hóa tâm linh, ẩm thực và y học…Nhiều nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy các bộ phận khác nhau của cây sen có thể được sử dụng làm món ăn và vị thuốc có giá trị trong y học cổ truyền do có chứa nhiều hợp chất có bản chất là alkaloid và flavonoid với nhiều hoạt tính dược lý như chống viêm, chống mất trí nhớ, chống oxy hóa và hoạt tính ức chế khối u, có tác dụng trong việc cải thiện sức khỏe của con người. Vì thế, việc nghiên cứu sự sai khác di truyền giữa các mẫu sen trồng tại Huế dựa trên một số vùng gene chỉ thị, tuyển chọn giống có sự khác biệt di truyền về kiểu gene đặc trưng để đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất tách chiết từ hạt sen của giống sen được tuyển chọn là việc làm rất cần thiết. Xuất phát từ cở sở khoa học nêu trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự khác biệt trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị ở các mẫu sen trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen”. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu về cấp độ phân tử của một số vùng gene chỉ thị, thiết lập mối quan hệ di truyền ở các mẫu sen khác nhau trồng tại Huế, cung cấp dữ liệu khoa học liên quan đến hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen của giống sen địa phương. 2. Mục tiêu của đề tài 2.1. Mục tiêu chung Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các mẫu sen trồng tại Huế dựa trên một số vùng gene chỉ thị và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen giống sen địa phương. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Cung cấp dữ liệu khoa học về sự khác biệt trình tự các nucleotide của các vùng gene chỉ thị thu được từ các mẫu sen trồng ở các địa điểm khác nhau tại Huế, ký gửi dữ liệu và được cấp mã số trên GenBank.
3 - Đánh giá việc ứng dụng một số vùng gene chỉ thị của hệ gene nhân và hệ gene lục lạp trong nghiên cứu phát hiện sự khác biệt trình tự các nucleotide của các vùng gene thu được từ các mẫu sen trồng ở các địa điểm khác nhau tại Huế. Khảo sát qui luật khác biệt, thiết lập mối quan hệ phát sinh dựa trên các vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide giữa một số mẫu sen trồng ở Huế, làm cơ sở khoa học cho việc tuyển chọn giống khác biệt đặc trưng để nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học. - Nghiên cứu phân lập các hợp chất tinh khiết và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất tách chiết từ hạt sen của giống sen khác biệt đặc trưng được tuyển chọn, tạo tiền đề cho việc khai thác và sử dụng bền vững giống sen này tại Huế. 3. Những đóng góp mới của đề tài - Đề tài đã đóng góp một số kết quả mới sau đây: 1. Xây dựng được bộ dữ liệu về sự khác biệt trình tự các nucleotide của 1 vùng gene chỉ thị từ hệ gene nhân và 9 vùng gene chỉ thị từ hệ gene lục lạp của 33 mẫu sen trồng tại các địa điểm khác nhau ở Huế. Từ đó đã ký gửi và được cấp mã số truy cập của 330 trình tự nucleotide của 10 vùng gene chỉ thị thu được từ 33 mẫu sen ở Huế trên GenBank. 2. Bước đầu phát hiện được qui luật khác biệt trình tự các nucleotide của một số vùng gene chỉ thị giữa 33 mẫu sen trồng tại các địa điểm khác nhau ở Huế, xây dựng được cây quan hệ phát sinh giữa 33 mẫu sen dựa trên các vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide, và tuyển chọn được giống Sen Trắng Trẹt Lõm có sự khác biệt đặc trưng về trình tự các nucleotide để nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong hạt sen. 3. Bước đầu phân lập được ba hợp chất tinh khiết từ phân đoạn n- Butanol của hạt Sen Trắng Trẹt Lõm có bản chất alkaloid: nuciferine (C19H21NO2), armepavine (C19H23O3N), và anonaine (C 17H15NO2). 4. Bước đầu ghi nhận ba hợp chất này có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhưng không thể hiện hoạt tính gây độc lên ba dòng tế bào ung thư MKN7, SK-Mel-2 và KB ở các nồng độ được nghiên cứu.
4 4. Cấu trúc lận án Luận án gồm 139 trang. Phần mở đầu 05 trang, kết luận và kiến nghị 02 trang, các công trình đã công bố 01 trang, tài liệu tham khảo 23 trang và phụ lục. Nội dung chính của luận án chia làm 03 chương: Chương 1: Tổng quan gồm 44 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu gồm 18 trang và Chương 3: Kết quả và thảo luận 46 trang. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu mới nhất trong và ngoài nước về các vấn đề ứng dụng chỉ thị phân tử vào phân tích đa dạng di truyền, xác định loài ở thực vật nói chung và ở cây sen (N. nucifera) nói riêng. Các nghiên cứu về chiết tách hợp chất từ các bộ phận khác nhau ở cây sen và thử hoạt tính sinh học của chúng. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu cây sen Nguồn vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu di truyền: Lá của 33 mẫu sen được thu thập ở 33 địa điểm trồng sen khác nhau tại Huế. Các mẫu sen được thu thập dựa trên kết quả công bố của Nguyễn Thị Quỳnh Trang và cs (2017) dựa trên đặc điểm hình thái tập đoàn 66 mẫu sen thu tại Huế. Nguyên liệu sử dụng chiết tách hợp chất: Hạt Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02) thu tại hồ Tịnh Tâm, phường Thuận Lộc, thành phố Huế. 2.1.2. Nguồn vật liệu sử dụng trong sinh học phân tử: Mười cặp mồi barcode đặc hiệu cho 10 vùng gene chỉ thị DNA được tham khảo từ Dong và cs (2012), Cuenoud và cs (2002), White và cs (1990). 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp sinh học phân tử 2.2.1.1. Chiết tách lục lạp: Lá sen được bảo quản ở 4°C trong bóng tối khoảng 1 đến 2 ngày để loại bỏ tinh bột tồn tại trong mô lá. Lục lạp được chiết tách và tinh sạch theo mô tả của Lang và cs (2011).
5 2.2.1.2. Chiết tách DNA từ hệ gene nhân và cpDNA từ lục lạp: Lá sen và lục lạp được sử dụng làm nguyên liệu chiết tách và tinh sạch DNA và cpDNA dựa trên phương pháp CTAB theo mô tả của Doyle (1987). 2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA và cpDNA: Sử dụng phương pháp điện di trên agarose và phương pháp quang phổ trên máy Nanodrop ND1000 (Thermo Scientific). 2.2.1.4. Phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt (MJ - MiniTM Persanol Thermal Cycle, Bio - Rad) theo chu trình nhiệt như sau: biến tính sợi đôi DNA/cpDNA ở 95oC/5 phút, tiếp đến là 30 chu kỳ: 95oC/1 phút, 50 - 55oC/50 giây, 72oC/1 phút, và 72oC/10 phút. 2.2.1.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Kít Isolate II PCR and Gel (Bioline). 2.3.1.6. Phương pháp tạo dòng gene: Tạo dòng gene được thực hiện theo phương pháp TA cloning vào vector pGEM® -T Easy. 2.2.1.7. Phương pháp tinh sạch plasmid: DNA plasmid tái tổ hợp tinh sạch từ các dòng khuẩn lạc dương tính bằng kít EZ-10 Spin Column Plasmid ADN Minipreps kit, BS6141 (BioBase). 2.2.1.8. Phương pháp giải trình tự gene: Các gene mục tiêu được tiến hành giải trình tự dựa trên phương pháp Sanger trên hệ thống phân tích ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer. 2.2.1.9. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền: Các trình tự nucleotide được sắp xếp dựa trên chương trình Clustals và hiệu chỉnh bằng phần mềm BioEdit 7.0.5. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA X trên phương pháp Maximum Like hood (ML). Trình tự nucleotide của các vùng gene được so sánh với các trình tự nucleotide được công bố trên GenBank bằng chương trình BLAST. Phân tích đa hình DNA dựa trên các thông số bao gồm số lượng vị trí đa hình (S), tổng số đột biến (Eta), số lượng các kiểu đơn bội (h), đa dạng các kiểu đơn bội (Hd), số lượng các nucleotide khác biệt trung bình (k), đa dạng nucleotide (π), số lượng sự kiện tối thiểu để xảy ra quá trình tái tổ hợp (Rm). Tính trung lập được kiểm tra dựa trên 5 phương pháp bao gồm
6 Tajima’s D test, Fs, Fu’s statistic; S, Strobeck’s statistic; D * and F *, Fu and Li’s statistics dựa trên phần mềm DNASP 6.0. Thống kê phân hóa dân số FST được ước tính bằng cách sử dụng phương pháp của Hudson và cs (1992). 2.2.2. Phương pháp chiết tách hoạt chất và thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2.2.1. Phương pháp thu cao phân đoạn: Xử lý mẫu, chiết mẫu bằng ethanol 70%, ngâm lạnh ở môi trường acid, chiết thu phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực ethylacetate, n-Butanol. Từ phân đoạn n-Bu của hạt Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02) được thực hiện chiết tách và phân lập hợp chất bằng sắc ký cổ điển cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck). 2.2.2.2. Phương pháp xác định độ tinh khiết và cấu trúc hoạt chất a. Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng các hợp chất phân lập được thực hiện theo mô tả của Bela và Khale (2011). b. Phương pháp phân tích phổ HPLC-MS/MS: Phân tích phổ khối lượng MS/MS trên hệ thống Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer. Dữ liệu phổ MS/MS của các hoạt chất được so sánh với dữ liệu phổ chuẩn trên NIST2017 và những công bố liên quan. 2.2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học a. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết thô và các hoạt chất tinh khiết được thực hiện bằng phương pháp 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) theo mô tả của Vuong và cs (2013). b. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro: Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung 10% fetal bovine serum-FBS. Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2. c. Xác định tính độc tế bào ung thư đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp: Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD-Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB, Sigma, Mỹ). d. Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch (HL-60): Phương pháp sử dụng muối tetrazolium (MTT-(3-(4,5-
7 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) làm thuốc thử trong phép so màu, qua đó đánh giá sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào. 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm thực nghiệm được lặp lại 3 lần. Các giá trị phân tích có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Tất cả các phân tích thống kê đều được thực hiện bằng phần mềm SPSS (Version 20). CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khuếch đại PCR và phân tích trình tự nucleotide một số vùng gene chỉ thị Kết quả sản phẩm khuếch đại PCR 10 vùng gene chỉ thị thể hiện trên điện di đồ ở hình 3.1 cho thấy tất cả các mẫu sen sử dụng nghiên cứu đều cho tỷ lệ khuếch đại PCR 100%, băng DNA rõ nét, có nồng độ cao đảm bảo chất lượng làm nguyên liệu thực hiện các thí nghiệm tiếp theo (hình 3.1). A B C D E F G H I K Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm PCR. M1: Kích thước thang chuẩn DNA; Hình A-K lần lượt là kết quả PCR các vùng gene chỉ thị DNA ITS4-5, rbcL, matK, trnH-psbA, accD-psaI, ndhA, psbE-petL, Rpl32-trnL, trnW-psaJ và trnSGCU-trnGGCC; NC: Kết quả PCR đối chứng âm; Giếng 01 đến 11 kết quả PCR các mẫu sen trắng; Giếng 12 đến 33 kết quả PCR các mẫu sen hồng. Kích thước của 10 vùng gene chỉ thị thu được đối với 33 mẫu sen dao động từ 350 bp đến 1667 bp. Trong đó vùng gene ITS4-5 và trnH-psbA thu được kích thước nucleotide có sự khác biệt giữa các mẫu sen, dao động từ 729 bp đến 744 bp (ITS4-5) và từ 350 đến 410 bp (trnH-psbA) (bảng 3.1).
8 Trình tự nucleotide của mỗi một vùng gene chỉ thị DNA thu được từ 33 mẫu sen so với trình tự nucleotide công bố ở GenBank cho kết quả tương đồng cao với loài sen N. nucifera (Mã số: FJ599761.1 và KF009944.1), mức độ tương đồng dao động từ 96,89-100% và độ bao phủ vùng gene đạt 98-100%. Trình tự nucleotide của 10 vùng gene chỉ thị DNA thu được từ 33 mẫu sen được ký gửi ở GenBank với các mã số tham chiếu lần lượt là ITS4-5 (MT903421-MT903453), rbcL (MN011708-MN068956), matK (MN011719-MN068978), trnH-psbA (MN011730-MN086252), accD-psaI (MN086253-MN086285), psbE-petL (MT901764-MT901796), Rpl32-trnL (MT901731-MT901763), trnW-psaJ (MT905225-MT905257), trnSGCU- trnGGCC (MT905258-MT905290) và ndhA (MZ611976 -MZ612008). 3.2. Kết quả phân tích đặc tính di truyền một số mẫu sen trồng tại Huế dựa trên 10 vùng gene chỉ thị 3.2.1. Kết quả phân tích đặc tính phân tử 10 vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế Vùng gene ITS4-5 thu được từ 33 mẫu sen khác nhau cho thấy Cystein (C) chiếm tỷ lệ cao nhất (trung bình = 30,538%) và thấp nhất là Timin (Uracin) (trung bình = 20,521%), tỷ lệ % (G+C) giữa các mẫu sen đạt trung bình 55,111%. Các vùng gene chỉ thị lục lạp, nucleotide loại A chiếm tỷ lệ cao nhất đối với các vùng gene rbcL, trnH-psbA và psbE-petL, trung bình lần lượt là 28,802%, 45,980% và 33,413%. Timin (Uracil) chiếm tỷ lệ cao nhất đối với các vùng gene còn lại như matK, accD-psaI, ndhA, Rpl32-trnL, trnW-psaJ, trnSGCU-trnGGCC, trung bình thu được lần lượt là 34,612%, 34,724%, 34,922%, 35,072%, 33,396% và 35,137%. Tỷ lệ % (G+C) ở mỗi vùng gene chỉ thị lục lạp đạt trung bình dao động từ 24,121% (trnH-psbA) đến 43,476% (rbcL) và tỷ lệ này đối với các vùng gene accD-psaI, ndhA, psbE-petL và Rpl32-trnL không có sự sai khác giữa các mẫu sen (bảng 3.1). 3.2.2. Kết quả phân tích đặc tính di truyền 10 vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế
9 Bảng 3.1. Kết quả phân tích đặc tính phân tử và đặc tính di truyền 10 vùng gene chỉ thị thu đƣợc từ một số mẫu sen trồng tại Huế Vùng gene Kích Số lƣợng vị S Eta Tỷ lệ % vị trí Trung thƣớc trí nucleotide nucleotide đa bình (bp) đơn hình hình % (G+C ) ITS4-5 729-744 724 5 5 2,688 55,111 rbcL 743 742 1 1 0,135 43,476 matK 936 861 75 76 8,013 36,000 trnH-psbA 350-410 375 0 0 0 24,121 accD-psaI 887 887 0 0 0 30,800 ndhA 1206 1206 0 0 0 33,900 psbE-petL 1667 1667 0 0 0 33,700 Rpl32-trnL 1246 1239 7 7 0,562 30,000 trnW-psaJ 729 728 1 1 0,137 34,200 trnSGCU- 1097 1095 1 1 0,182 31,400 trnGGCC Ghi chú: S: Số lượng vị trí nucleotide biến đổi; Eta: tổng số đột biến nucleotide Kết quả phân tích trình tự nucleotide cho thấy có năm vị trí nucleotide đa hình (S) được tìm thấy trong vùng gene ITS4-5 giữa 33 mẫu sen, chiếm tỷ lệ 2,688% và một trình tự nucleotide khuyết từ vị trí 133 đến 147 gồm có 15 nucleotide ACGTCCAGCATTCCA (hình 3.2 và bảng 3.1). Số lượng các nucleotide khác biệt trung k = 2,688, tương ứng với hệ số đa dạng nucleotide π = 3,140 x10-3 (bảng 3.1 và bảng 3.2). Hình 3.2. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene chỉ thị ITS4-5 giữa một số mẫu sen Vùng gene ITS4-5 có chứa 5 vị trí đột biến (Eta) góp phần phân chia 33 mẫu sen thành 2 kiểu đơn bội khác nhau với hệ số đa dạng các kiểu đơn bội Hd = 0,458 (bảng 3.1 và bảng 3.2). Các vị trí nucleotide có sự sai khác giữa
10 các mẫu sen trắng và các mẫu sen hồng là: 404 (C-T), 625 (G-A) và 626 (A-G), 408 (G-T) và 576 (C-A) (hình 3.2). Các vùng gene thuộc hệ gene lục lạp có số lượng các vị trí nucleotide biến đổi trong tổng chiều dài vùng gene thu được ở 33 mẫu sen có sự khác nhau, dao động từ 0 đến 75 vị trí, tương ứng với tỷ lệ % các nucleotide đa hình xuất hiện trên trình tự nucleotide ở các vùng gene dao động từ 0 đến 8,013% (bảng 3.1). Vùng gene matK có số lượng các vị trí nucleotide biến đổi lớn nhất (75 vị trí), trong đó có 74 vị trí nucleotide đa hình, chiếm 8,013% (bảng 3.1 và hình 3.3). Kết quả phân tích đặc tính di truyền dựa trên các thông số k, π, S, Eta giữa 33 mẫu sen ở mỗi vùng gene lục lạp có sự khác nhau, dao động từ 0,061 đến 20,563 (k), 0,080 x10-³ đến 21,970 x10-³ (π), 0 đến 75 (S) và 0 đến 76 (Eta) (bảng 3.1 và bảng 3.2). Vùng gene rbcL cho thấy các thông số này thu được giá trị thấp nhất (k = 0,061 và π = 0,080 x10-³, S = 1 và Eta = 1), tiếp đến lần lượt là các vùng gene trnH-psbA (k = 0,117 và π = 0,330 x10-³), Rpl32-trnL (k = 0,424 và π = 0,340 x10-³), trnSGCU-trnGGCC (k = 0,504 và π = 0,460 x10-³), trnW-psaJ (k = 0,511 và π = 0,700 x10-³) và vùng gene matK các giá trị này thu được cao nhất (k = 20,563 và π = 21,970 x10-³) (bảng 3.1 và bảng 3.2). Hình 3.3. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene chỉ thị matK giữa một số mẫu sen trồng tại Huế
11 Các mẫu sen phân chia về các kiểu đơn bội ở mỗi vùng gene chỉ thị dao động từ 1 đến 5 kiểu đơn bội, tương ứng với Hd thu được dao động từ 0 đến 0,822 (bảng 3.2). Trong đó vùng gene matK các giá trị này thu được đạt cao nhất tương ứng là h = 5, Hd = 0,822 (bảng 3.2). Các vùng gene chỉ thị lục lạp như rbcL, trnW-psaJ và trnSGCU-trnGGCC có chứa 1 đến 2 vị trí nucleotide biến đổi trong trình tự vùng gene. Tỷ lệ % các nucleotide đa hình của các vùng gene lần lượt là 0,135%, 0,137% và 0,182% (bảng 3.1). Bảng 3.2. Kết quả phân tích đặc điểm di truyền 10 vùng gene và tổ hợp các vùng gene chỉ thị thu đƣợc từ một số mẫu sen trồng tại Huế Vùng gene π (x10-3) k Rm h Hd ITS4-5 3,140 2,292 0 2 0,458 rbcL 0,080 0,061 0 2 0,061 matK 21,970 20,563 0 5 0,822 trnH-psbA 0,330 0,117 0 2 0,117 accD-psaI 0 - - 1 0 ndhA 0 - - 1 0 psbE-petL 0 - - 1 0 Rpl32-trnL 0,340 0,424 0 2 0,061 trnW-psaJ 0,700 0,511 0 2 0,511 GCU GCC trnS -trnG 0,460 0,504 0 2 0,504 ITS4-5 + rbcL 1,600 2,352 0 3 0,477 ITS4-5 + matK 13,730 22,854 0 6 0,845 ITS4-5 + Rpl32-trnL 1,380 2,716 0 3 0,498 ITS4-5 + trnW-psaJ 1,920 2,803 1 4 0,689 ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC 1,530 2,795 1 4 0,699 rbcL + matK + Rpl32-trnL + 4,640 22,063 1 9 0,869 trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC Ghi chú: π: Đa dạng nucleotide (cho mỗi vị trí); k: Số lượng nucleotide khác biệt trung mình; Rm: Số sự kiện tối thiểu xảy ra quá trình tái tổ hợp; h: số lượng các kiểu đơn bội; Hd: hệ số đa dạng các kiểu đơn bội (gene). Mẫu Sen Hồng Cao Sản SH09 có 7 vị trí nucleotide sai khác trong trình tự vùng gene Rpl32-trnL so với các mẫu sen còn lại. Tỷ lệ % vị trí các nucleotide đa hình chiếm 0,562% (hình 3.4B và bảng 3.1). Vùng gene Rpl32-trnL có 7 vị trí đột biến được hình thành với sự phân bố các mẫu sen về các kiểu đơn bội không giống nhau, xuất hiện kiểu đơn bội chỉ chứa một
12 mẫu Sen Hồng Cao Sản SH09 (bảng 3.1). Kết quả sự sai khác nucleotide ở trình tự mỗi vùng gene rbcL, trnW-psaJ và trnSGCU-trnGGCC đã làm cho các mẫu sen có màu sắc hoa khác nhau phân chia về các kiểu đơn bội không rõ ràng. Trong đó vùng gene rbcL xuất hiện kiểu đơn bội có sự khác biệt chỉ chứa 1 mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 (hình 3.4). A B C D Hình 3.4. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide các vùng gene chỉ thị giữa một số mẫu sen trồng tại Huế. A: vùng gene rbcL, B: vùng gene Rpl32-trnL, C: vùng gene trnW-psaJ và D: vùng gene trnSGCU-trnGGCC Vùng gene trnH-psbA với trình tự lặp lại TAAAA có sự khác biệt giữa các mẫu giống sen từ vị trí 242 đến 300, dao động từ 7 đến 19 lần. Trong đó mẫu giống Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02) có 13 lần lặp lại trình tự TAAAA trong vùng gene. Số lần lặp lại này không xuất hiện ở các mẫu giống sen khác sử dụng trong nghiên cứu (hình 3.5). Hình 3.5. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene chỉ thị trnH-psbA giữa một số mẫu sen trồng tại Huế Sự sai khác về số lượng trình tự lặp lại ATAAA trong vùng gene trnH- psbA góp phần phân chia 33 mẫu sen thành 2 kiểu đơn bội khác nhau, và
13 xuất hiện kiểu đơn bội chỉ chứa hai mẫu sen thuộc nhóm sen hồng SH02 và SH13 (bảng 3.2). Các vùng gene accD-psaI, ndhA và psbE-petL cho thấy không có sự sai khác nucleotide trong vùng gene giữa các mẫu sen sử dụng trong nghiên cứu. Kết quả phân tích các đặc tính di truyền (k, π, S, Eta) của 33 mẫu sen dựa trên sự phân tích kết hợp trình tự nucleotide vùng gene ITS4-5 và trình tự nucleotide các vùng gene chỉ thị lục lạp có sự sai khác nucleotide giữa 33 mẫu sen cho thấy có sự thay đổi khác nhau so với kết quả thu được khi phân tích ở mỗi vùng gene chị thị riêng lẻ, dao động từ 2,352 đến 22,854 (k), 1,380 x10-3 đến 13,730 x10-3 (π), 6 đến 85 (S), 6 đến 86 (Eta) (bảng 3.1 và bảng 3.2). Kết quả sự phân bố các mẫu sen về các kiểu đơn bội có sự khác nhau, nhiều kiểu đơn bội mới xuất hiện và chiếm ưu thế về số lượng mẫu sen nghiên cứu, dao động từ 3 đến 9 kiểu đơn bội và hệ số đa dạng các kiểu đơn bội dao động từ 0,477 đến 0,869 (bảng 3.2). Các tổ hợp vùng gene ITS4-5 + rbcL, ITS4-5 + trnW-psaJ, ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC, ITS4-5 + Rpl32-trnL và rbcL + matK + Rpl32-trnL + trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC xuất hiện kiểu đơn bội chỉ chứa một mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 hoặc mẫu sen hồng SH06 hoặc SH09. Số sự kiện tối thiểu xảy ra quá trình tái tổ hợp (Rm) không tìm thấy ở các vùng gene chỉ thị riêng lẻ giữa 33 mẫu sen. Sự kiện này chỉ xảy ra ở một vài tổ hợp vùng gene như ITS4-5 + trnW-psaJ, ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC, rbcL + matK + Rpl32-trnL + trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC (bảng 3.2). Tóm lại. Kết quả phân tích cho thấy 7 vùng gene chỉ thị trong tổng số 10 vùng gene sử dụng trong nghiên cứu có sự sai khác nucleotide giữa 33 mẫu sen trồng ở những địa điểm khác nhau tại Huế. Vùng gene matK cho số lượng vị trí nucleotide sai khác giữa 33 mẫu sen lớn nhất, tiếp đến là vùng gene ITS4-5, vùng gene Rpl32-trnL và thấp nhất là vùng gene rbcL. Các vùng gene cho thấy sự khác biệt theo một quy luật chung giữa các mẫu sen thể hiện qua các vị trí nucleotide tương ứng là: ITS4-5: 404 (C-T), 625 (G-A) và 626 (A-G), 408 (G- T) và 576 (C-A); rbcL: 459 (G-T); trnW-psaJ: 504 (T-G); trnSGCU-trnGGCC: 369 (A-0) và 545 (A-T); Rpl32-trnL: 885 (C-G), 895 (CATC-ATCA), 920 (A-
14 G) và 927 (A-G); matK: 293 (G-A), 323 (G-A-T), 709 (G-T) và 819 (T-G) và số lượng trình tự lặp lại ATAAA của vùng gene trnH-psbA. Kết quả phân tích tính trung lập: Các vùng gene ITS4-5, matK, trnW-psaJ, trnSGCU-trnGGCC và tổ hợp ITS4-5 + matK, ITS4-5 + trnW-psaJ, ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC, rbcL + matK + Rpl32-trnL + trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC thu được giá trị dương đối với các phân tích thống kê D, Fs và D *, F * cho thấy các mẫu sen xảy ra cả hai hiện tượng tần số thấp và tần số cao về số lượng các vị trí đa hình so với kỳ vọng ở mức trung lập, sự thiếu hụt các allen hiếm trên các trình tự nucleotide của các vùng gene thu được từ 33 mẫu sen (bảng 3.3). Trong thời gian gần đây, các mẫu sen nghiên cứu xảy ra quá trình chọn lọc theo hướng cân bằng, dẫn đến số lượng các mẫu sen có xu hướng giảm xuống tại thời điểm thực hiện nghiên cứu. Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra tính trung lập giữa một số mẫu sen trồng tại Huế dựa trên các vùng gene và tổ hợp vùng gene chỉ thị Vùng gene D D* F* Fs S ITS4-5 2,291* 1,1354* 1,724* 7,078 0,009 rbcL -1,1404* -1,7134* -1,7904* -1,290 0,977 matK 0,3664* 1,916** 1,648* 21,765 0 trnH-psbA -0,7924* 0,5844* 0,2314* -0,521 0,927 Rpl32-trnL -2,1793* -3,7212* -3,7972* 1,375 0,549 trnW-psaJ 1,6264* 0,5844* 1,0074* 1,743 0,458 trnSGCU-trnGGCC 1,5804* 0,5844* 0,9924* 1,712 0,465 ITS4-5 + rbcL 1,6484* 0,4154* 0,9194* 4,867 0,037 ITS4-5 + matK 0,5434* 1,9242* 1,724* 20,616 0 ITS4-5 + Rpl32-trnL -0,2614* -1,9074* -1,6294* 5,628 0,020 ITS4-5 + trnW-psaJ 2,498* 1,207 4* 1,8632* 4,049 0,061 ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC 2,484* 1,2074* 1,8582* 4,036 0,062 rbcL + matK + Rpl32-trnL + 0,1544* 1,2244* 1,0204* 13,157 0 trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC Ghi chú: Có ý nghĩa thống kê: *, p < 0,05; Có ý nghĩa thống kê: 2*; p < 0,02, Có ý nghĩa thống kê: 3*, p < 0,01, không có ý nghĩa thống kê: 4*, p > 0,10; D, Tajima’s statistic; Fs, Fu’s statistic; S, Strobeck’s statistic; D * and F *, Fu and Li’s statistics.
15 Trong khi đó, các vùng gene rbcL, Rpl32-trnL, trnH-psbA và tổ hợp vùng gene ITS4-5 + Rpl32-trnL cho thấy số lượng các vị trí nucleotide đa hình so với kỳ vọng ở mức trung lập xảy ra với tần số thấp giữa các mẫu sen nghiên cứu. Số lượng các allen hiếm vượt trội đã làm cho các cá thể sen trong hai nhóm sen có xu hướng chia nhỏ do sự thay đổi sau sự kiện nút thắt cổ chai dưới tác động của quá trình quét chọn lọc hoặc từ quá trình quá giang di truyền làm cho số lượng quần thể sen có xu hướng tăng lên tại thời điểm thực hiện nghiên cứu. Những nhận định này được thể hiện thông qua giá trị âm và giá trị dương thu được từ các phân tích thống kê D, Fs và D *, F * (bảng 3.3). Tuy nhiên, kết quả phân tích xác suất quan sát toàn bộ phạm vi của các kiểu đơn bội trong bất kỳ chọn lọc ngẫu nhiên cho thấy đa số các vùng gene và tổ hợp vùng gene chỉ thị thu được từ 33 mẫu sen đều cho giá trị S thấp (S < 0,5), dao động từ 0,000 đến 0,465. Kết quả cho thấy xuất hiện một số kiểu đơn bội mới chiếm ưu thế về số lượng mẫu sen nghiên cứu và xác suất nhận được tất cả các kiểu đơn bội này thấp theo chọn lọc ngẫu nhiên. Các vùng gene rbcL, trnH-psbA, Rpl32-trnL thu được giá trị S cao, dao động từ 0,549 đến 0,977 cho thấy xuất hiện một số kiểu đơn bội hiếm chỉ chứa 1 đến 2 mẫu sen có sự khác biệt di truyền lớn so với các mẫu sen còn lại (bảng 3.3). 3.3. Kết quả phân tích đặc tính di truyền giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng dựa trên tổ hợp 9 vùng gene chỉ thị lục lạp Tỷ lệ % (G+C) chứa trong tổ hợp 9 vùng gene lục lạp không có sự khác biệt lớn giữa hai nhóm sen, 33,4% (sen trắng) và 33,5% (sen hồng). Kết quả phân tích các thông số di truyền k, π, S, Eta nhóm sen trắng thu được kết quả các giá trị này thấp hơn so với nhóm sen hồng. Nhóm sen trắng phân chia thành 3 kiểu đơn bội khác nhau, tương ứng Hd = 0,618 và nhóm sen hồng phân chia thành 7 kiểu đơn bội khác nhau, tương ứng Hd = 0,818 (bảng 3.4). Bảng 3.4. Kết quả phân tích đặc tính di truyền giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng Nhóm n % (G+C) S Eta h Hd k π (x10-3) Sen trắng 11 33,400 5 5 3 0,618 1,564 0,180 Sen hồng 22 33,500 84 85 7 0,818 29,082 3,280
16 Kết quả phân tích thống kê D, D * và F * đối với nhóm sen trắng cho thấy số lượng các vị trí nucleotide đa hình so với kỳ vọng ở mức trung lập xảy ra với tần số thấp giữa các mẫu sen. Trong thời gian gần đây, trình tự tổ hợp vùng gene có nhiều biến thể nucleotide hiếm xuất hiện đã làm gia tăng số lượng các kiểu đơn bội, số lượng quần thể có xu hướng tăng lên do sự chia nhỏ số lượng mẫu sen trong nhóm sen nghiên cứu dưới tác động của chọn lọc nền. Các nhận định này được thể hiện thông qua giá trị âm thu được của các phân tích thống kê D, D * và F * và giá trị dương thu được của Fs (bảng 3.5). Trong khi đó, nhóm sen hồng, các mẫu sen xảy ra cả hai hiện tượng tần số thấp và tần số cao về số lượng các vị trí đa hình so với kỳ vọng ở mức trung lập, có sự thiếu hụt các allen hiếm trên trình tự nucleotide của tổ hợp 9 vùng gene chỉ thị lục lạp ở 33 mẫu sen. Trong thời gian gần đây, các mẫu sen xảy ra quá trình chọn lọc khắc khe, dẫn đến số lượng các mẫu sen có xu hướng giảm xuống tại thời điểm thực hiện nghiên cứu. Các nhận định này được thể hiện thông qua giá trị dương thu được từ thống kê D, D * và F * (bảng 3.5). Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra tính trung lập giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng Nhóm Fs D D* F* S Sen trắng 1,545 - 0,322* - 0,764* - 0,736* 0,446 Sen hồng 14,465 0,993* 1,134* 1,277* 0 Tuy nhiên, xác suất quan sát toàn bộ phạm vi của các kiểu đơn bội trong bất kỳ chọn lọc ngẫu nhiên nào của hai nhóm sen đều thu được giá trị S thấp (S < 0,5), dao động từ 0 đến 0,446 (bảng 3.5). Giá trị Fst với khoảng cách di truyền lớn nhất quan sát được giữa hai nhóm sen là 0,00233 (p < 0,05) (bảng 3.6). Giá trị này cho thấy sự khác biệt di truyền không đáng kể giữa hai nhóm sen nghiên cứu thu ở những địa điểm khác nhau tại Huế. Bảng 3.6. Kết quả giá trị Fst giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng Nhóm Sen trắng Sen hồng Sen trắng - 0,00032 Sen hồng 0,00233* - Ghi chú: Giá trị Fst có ý nghĩa tại p < 0,05; -: không có dữ liệu
17 3.4. Phân tích quá trình tiến hóa của một số mẫu sen trồng tại Huế dựa trên 10 vùng gene chỉ thị 3.4.1. Chỉ thị vùng gene nhân Kết quả cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gene chỉ thị ITS4-5 cho thấy, các mẫu sen thuộc cùng nhóm thì chúng có quan hệ di truyền gần gủi nhau và tách riêng thành một nhánh tiến hoá riêng biệt (hình 3.6). Hình 3.6. Cây quan hệ phát sinh dựa trên vùng gene chỉ thị ITS4-5 giữa một số mẫu sen trồng tại Huế 3.4.2. Chỉ thị vùng gene lục lạp Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các vùng gene chỉ thị lục lạp riêng lẽ cho thấy 33 mẫu sen đều có sự phân hoá di truyền chưa được thể hiện rõ ràng khi chúng phân chia về các nhánh khác nhau, ngoại trừ mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 và mẫu Sen Hồng Cao sản SH09 (phụ lục 5.1-5.8). Hình 3.7. Cây quan hệ phát sinh dựa trên tổ hợp 5 vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide giữa một số mẫu sen trồng tại Huế Các mẫu sen nghiên cứu có sự phân chia về các nhánh tiến hoá được thể hiện rõ ràng hơn, xuất hiện nhiều kiểu đơn bội chỉ chứa một mẫu sen trong
18 nhóm sen nghiên cứu khi có sự phân tích kết hợp một hay nhiều trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị lại với nhau như ITS4-5 + trnW-psaJ, ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC, ITS4-5 + rbcL, ITS4-5 + Rpl32-trnL tổ hợp rbcL + matK + Rpl32-trnL + trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC và tổ hợp rbcL + matK + trnH-psbA + accD-psaI + ndhA + psbE-petL + Rpl32-trnL + trnW- psaJ + trnSGCU-trnGGCC (phụ lục 5.1 đến phụ lục 5.8, hình 3.7 và hình 3.8). Hình 3.8. Cây quan hệ phát sinh dựa trên tổ hợp 9 vùng gene chỉ thị lục lạp giữa một số mẫu sen trồng tại Huế Các mẫu Sen Hồng Cao Sản SH06 và SH09 phân bố thành nhánh phụ riêng biệt và có khoảng cách di truyền khác biệt và lớn hơn so với các mẫu sen hồng phân bố trong cùng một nhánh với nhau, trong đó mẫu Sen Hồng Cao Sản SH09 có khoảng cách di truyền lớn nhất. Mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 tách thành một nhóm phụ và có khoảng cách di truyền lớn hơn các mẫu sen trắng còn lại phân bố trong cùng một nhánh. Mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 thuộc nhóm sen địa phương được thu tại hồ Tịnh Tâm, phường Thuận Lộc, thành phố Huế. Đối với người dân trồng sen vì lợi ích kinh tế, thì sen trắng là giống sen được ưu tiên lựa chọn vì vừa có thể khai thác hoa và hạt với giá thành rất cao. Hạt sen trắng nổi tiếng với hương vị thơm ngon mà các giống sen khác không có được. Mặt khác, Theo Nguyễn Thị Quỳnh Trang và cs (2017), nhóm tác giả cũng xác định được giống Sen Trắng Trẹt Lõm là giống sen địa phương có giá trị về màu sắc hoa, năng suất, chất lượng và có tiềm năng trong sản xuất để bảo tồn, khai thác và phát triển. Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của Lê Công Sơn (2008), giống Sen Trắng
19 Trẹt Lõm là giống đặc trưng của Huế, có màu hoa trắng, nụ hoa dài, chóp nhọn, gương phẳng, hoặc lõm, hạt nhỏ nhưng nhiều và còn được chú trọng trồng tại các di tích Huế thuộc khu vực nội thành, thành phố Huế. Chúng được ví như biểu tượng văn hóa và những ý nghĩa lịch sử mà nó mang lại. Chính vì những đặc điểm ưu việt đó, và sự khác biệt đặc trưng về khoảng cách di truyền dựa của mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 dựa trên trình tự nucleotide của 10 vùng gene chỉ thị so với các mẫu sen khác trong nghiên cứu, tôi chọn mẫu giống Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 để thu hoạch hạt sen làm nguyên liệu tiến hành thí nghiệm chiết tách, phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất tinh khiết là rất cần thiết để phục vụ cho việc khai thác tiềm năng của cây sen và bảo tồn các giống sen quý. 3.5. Kết quả khảo sát dung môi chiết cao tổng số từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Trong 100 g nguyên liệu bột hạt Sen Trắng Trẹt Lõm, cao tổng số thu được trong dung môi nước và ethanol với các nồng độ khác nhau thì có sự khác nhau, dao động từ 0,604 đến 1,703 g. Trong đó, dung môi ethanol ở nồng độ 70% cho hiệu quả thu cao tổng số, các nhóm hợp chất alkaloid và flavonoid cao nhất, chiếm 1,703 g (bảng 3.7). Bảng 3.7. Kết quả chiết cao tổng số, định tính alkaloid và flavonoid từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Dung môi Hàm lƣợng cao tổng số (g) Alkaloid Flavonoid Nước 0,865c ± 0,057 + + Ethanol 30% 1,142d ± 0,061 + + Ethanol 50% 1,161d ± 0,009 ++ ++ Ethanol 70% 1,703e ± 0,068 +++ +++ Ethanol 90% 0,783b ± 0,009 ++ ++ Ethanol 96% 0,604a ± 0,011 ++ ++ Chi chú: + : biểu hiện yếu; ++: biểu hiện trung bình; +++: biểu hiện mạnh; Các chữ cái khác nhau trên cùng một hàng chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 3.6. Kết quả định tính và định lƣợng alkaloid và flavonoid trong một số cao chiết thu đƣợc từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Kết quả định lượng alkaloid và flavonoid thể hiện ở bảng 3.8 cho thấy phân đoạn n-Bu cho hàm lượng alkaloid cao nhất chiếm 209,667 mg NU/g cao tinh
20 sạch và phân đoạn NE cho hàm lượng flavonoid cao nhất chiếm 414,300 mg CE/g cao tinh sạch (bảng 3.8). Từ những kết quả này tôi tiếp tục chọn phân đoạn n-Bu để thực hiện quá trình phân lập các hợp chất tinh khiết. Bảng 3.8. Kết quả định lƣợng alkaloid và flavonoid trong cao tổng số và các cao phân đoạn tinh sạch thu đƣợc từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Phân đoạn flavonoid toàn phần (mg CE/g) alkaloid toàn phần (mg NU/g) Cao tổng số 19,790b ± 0,385 0,718a ± 0,041 NE 414,300d ± 1,500 52,571d ± 0,025 n-Bu 118,000c ± 11,456 209,667e ± 0,041 NP 9,050a ± 0,250 6,676b ± 0,004 P 6,550a ± 0,250 6,771c ± 0,019 3.7. Kết quả phân lập hợp chất tinh khiết ở phân đoạn n-B thu đƣợc từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Kết quả ở phân PĐ3, PĐ4 và PĐ5 phân lập thu được 3 hợp chất có ký hiệu NH2 (136 mg), NH8 (150 mg) và NH11 (217 mg). Giá trị Rf thu được tương ứng là 0,651, 0,724 và 0,651. Cả 3 hợp chất đều cho mầu nâu đỏ đặc trưng của alkaloid khi nhuộm với Bouchardat và sấy ở 105oC (bảng 3.9). Bảng 3.9. Kết quả tính chất của các hợp chất phân lập từ phân đoạn n- Bu của hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Ký Khối lƣợng Hệ dung môi Thuốc thử Rf Biều hiện hiệu (mg) màu CHCl3:Acetone:MeOH NH2 136 Bouchardat 0,651 Màu nâu đỏ (50:50:0,5) CHCl3:MeOH:NH4OH NH8 150 Bouchardat 0,724 Màu nâu đỏ (96:4:0,5) CHCl3:MeOH:NH4OH NH11 217 Bouchardat 0,651 Màu nâu đỏ (96:4:0,5) Kết quả phân tích phổ khối lượng dựa trên phương pháp HPLC-MS/MS của các hợp chất tinh khiết thể hiện ở bảng 3.10 và phụ lục 6.2 đến 6.4 cho thấy như sau: Khối phổ phân giải cao ghi nhận ion dương [M+H]+ đối với hoạt chất NH2 : m/z = 318,9372 tương ứng [C19H21NO2 + H]+ ; NH8 : m/z = 314,1750 tương ứng [C19H23NO3 + H]+ và NH11 : m/z = 266,1595 tương ứng [C17H15NO2 + H]+ phù hợp với công thức phân tử C19H21NO2 , C19H23NO3 và C17H15NO2 tương ứng.