Tóm tắt luận án tiến sĩ: Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ở lợn

Chia sẻ: Trần Văn Yan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung của đề tài nhằm nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2; Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2; Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể chống Streptococcus suis type 2 và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 (S. suis type 2). Luận án sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu CPS2 để xác định tình hình nhiễm vi khuẩn Streptococcus suis type 2 ở lợn khỏe tại một số địa điểm giết mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án tiến sĩ: Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ở lợn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ QUỐC VIỆT NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 Ở LỢN Ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019
Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. ĐINH THỊ BÍCH LÂN 2. PGS.TS. BÙI TRẦN ANH ĐÀO Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: TS. Trần Thị Lan Hương Hội Thú y Phản biện 3: PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ Học viện Nông nghiệp Việt Nam Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Một trong những căn bệnh lây nhiễm từ thịt heo có thể gây nguy hiểm cho con người là bệnh liên cầu khuẩn lợn. Đây là một bệnh truyền nhiễm do loại liên cầu khuẩn Streptococcus suis (S. suis) gây ra. Bệnh có thể xảy ra ở hầu hết các loài động vật máu nóng, trong đó lợn và người là chủ yếu. Dựa vào đặc điểm của các polysaccharid ở lớp vỏ bọc vi khuẩn, người ta đã xác định vi khuẩn liên cầu lợn có 35 type huyết thanh. Trong đó, S. suis type 2 thường gây bệnh ở người và động vật (Smith et al., 1999). Vi khuẩn gây hai bệnh cảnh chính là viêm màng não và nhiễm khuẩn huyết, nặng có thể gây sốc nhiễm khuẩn, suy đa phủ tạng, viêm nội tâm mạc... Nếu không được phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời thì người bệnh có thể tử vong. Cho dù bệnh nhân hồi phục, bệnh vẫn có thể để lại những di chứng nặng nề như bị ù tai, giảm thính lực, điếc hoàn toàn… (Vecht et al., 1992). Các phương pháp chẩn đoán bệnh do liên cầu khuẩn lợn gây ra thường dùng là phương pháp nhuộm gram, phương pháp phân lập vi khuẩn trên các môi trường chuyên dụng, phương pháp PCR. Trong những năm gần đây, trên thế giới đã phát triển loại KIT chẩn đoán nhanh dựa trên phương pháp sắc kí miễn dịch có độ đặc hiệu, độ chính xác cao, không cần phòng thí nghiệm, không cần thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ cao, giúp phát hiện bệnh sớm, điều trị kịp thời, giảm thiểu được thiệt hại cho người bệnh. Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có tác giả nào nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn type 2 ở người và động vật. Vì vậy, chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn type 2 mang tính cấp thiết và có ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn. KIT chẩn đoán nhanh sẽ đáp ứng tốt nhu cầu phát hiện bệnh sớm cũng như kiểm soát tình trạng mang mầm bệnh ở gia súc, kịp thời có biện pháp bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng, nâng cao hiệu quả chăn nuôi. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn S. suis type 2 ở lợn. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: lợn tại các lò giết mổ; vi khuẩn Streptococcus suis type 2 phân lập được từ mẫu dịch mũi lợn. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2017. Địa điểm nghiên cứu: + Các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế; + Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; 1
+ Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn S. suis type 2 trên lợn giết mổ tại địa bàn Thừa Thiên Huế. Mẫu vi khuẩn S. suis type 2 phân lập được phân tích đặc tính sinh học và sinh học phân tử. KIT chẩn đoán S. suis type 2 do đề tài nghiên cứu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả tương tự với KIT chẩn đoán S. suis type 2 do Ju et al. (2010) đã công bố. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên cứu về bệnh do vi khuẩn S. suis type 2 gây ra ở lợn trong các Trường, Viện nghiên cứu chuyên ngành thú y. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã thu thập mẫu phân tích tình hình nhiễm S. suis type 2 trên lợn khỏe tại các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế, đây là cơ sở để đánh giá mức độ nguy hiểm và nguy cơ lây nhiễm bệnh do vi khuẩn liên cầu lợn type 2 gây ra ở người và động vật. Sản phẩm KIT chẩn đoán vi khuẩn S. suis type 2 có độ nhạy và độ mẫn cảm cao thích hợp cho công tác chẩn đoán lâm sản trên thực địa, từ đoán cán bộ thú y và người làm công tác dịch tễ có thể đưa ra chương trình phù hợp cho việc phòng tránh lây nhiễm bệnh do liên cầu lợn type 2 từ lợn và các sản phẩm của lợn. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước và trên thế giới 2.1.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trên thế giới S. suis được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới tại những nơi chăn nuôi lợn như: Hồng Công, Hà Lan, Anh, Thái Lan và Trung Quốc… (Vecht et al., 1985; Touil et al., 1988; Yu et al., 2006). Từ năm 1983 đến năm 1995 đã có 32 trong số 35 type Streptococcus được phân lập. Hầu hết các chủng phân lập được từ lợn bệnh chỉ thuộc một số type nhất định, từ 1 – 8. Với mục đích phòng chống bệnh do liên cầu lợn gây ra, nhiều công trình nghiên cứu đã tập trung vào việc nghiên cứu phương pháp xâm nhập của vi khuẩn S. suis vào tế bào não lợn (Vanier et al., 2004), phương pháp chẩn đoán bệnh liên cầu lợn type 2 (Yang et al., 2007; Tan et al., 2008a; Lomthaisong et al., 2010; Mandanici et al., 2010). Nghiên cứu các protein kháng nguyên bề mặt nhằm tạo vắc xin (Li et al., 2006; Li et al., 2011). 2
2.1.1.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), Nguyễn Như Thanh và cs. (2001), vi khuẩn liên cầu lợn có khắp nơi trong tự nhiên, ổ chứa là lợn nhà. Cả lợn rừng, ngựa, chó, mèo và chim cũng có thể mang vi khuẩn liên cầu lợn. Hiện có 2 type liên cầu lợn thường gây bệnh ở lợn, type 1 hay gây dịch bệnh lẻ tẻ ở các đàn lợn dưới 8 tuần tuổi, type 2 gây bệnh ở nhiều lứa tuổi khác nhau. Cả 2 type này đều cư trú ở amidal. Lợn trưởng thành có tỷ lệ mang vi khuẩn cao nhất (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh và cs., 2001). S. suis type 2 có thể tồn tại kéo dài hơn 1 năm tại amiđan của lợn mang mầm bệnh kể cả khi được điều trị bằng penicilline. Ngo Thi Hoa et al. (2011) cho biết rằng, ở miền nam Việt Nam, lợn giết mổ mang vi khuẩn S. suis lên đến 41%, trong đó 8% là S. suis type 2. 2.2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN LIÊN CẦU LỢN 2.2.1. Đặc điểm hình thái Vi khuẩn S. suis có hình cầu, hình trứng, đường kính có khi đến 1 μm, chúng được xếp thành chuỗi như chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau, có thể từ hai vi khuẩn tạo thành song cầu khuẩn cho đến chuỗi có 6 - 10 vi khuẩn hay dài hơn. Vi khuẩn bắt màu dễ dàng với một số loại thuốc nhuộm thông thường, với thuốc nhuộm Gram, chúng bắt màu Gram (+) (Mahon et al., 2000; Tan et al., 2008a). Hình 2.1. Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S. suis Nguồn: Hughes et al. (2009) 2.2.2. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa Vi khuẩn S. suis có khả năng lên men các loại đường glucoza, lactoza, saccaroza, trehaloza, maltoza, fructoza, không lên men các loại đường: sorbit, dextroza, mannit, xyloza, glycerol, innulin. Tính chất không lên men đường innulin là đặc tính để phân biệt tính chất độc của chủng gây bệnh (Smith et al., 1999). S. suis có thể tăng trưởng ở kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng không thể tăng trưởng ở 6,5% dung dịch NaCl. S. suis không chứa men catalaza và oxidaza vì vậy phản ứng catalaza (-), oxidaza (-), phản ứng indol (-). Vi khuẩn không di động. Vi khuẩn có kháng nguyên giáp mô và sinh ra hai loại men streptokinaza (diệt bạch cầu), hyaluronidaza phân hủy acid hyaluronic gây nhão mô (Biền Văn Minh, 2003). 3
2.2.3. Sức đề kháng Những nghiên cứu của các tác giả khẳng định rằng nhóm vi khuẩn không hình thành nha bào, đa số hình thành giáp mô, sự hình thành giáp mô có thể xác định được khi chúng sinh sống trong các mô hoặc mọc trong các môi trường nuôi cấy có chứa huyết thanh(Enright et al., 1987). Vi khuẩn dễ bị diệt bởi các chất sát trùng thông thường như cồng, phenol, iod, formol, tím genetian (Trịnh Phú Ngọc và cs., 1999). Vi khuẩn S. suis rất mẫn cảm với các loại thuốc kháng sinh: penicillin, oreomycin, tetracylin, sulfadiazin, optoclin (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987). 2.2.4. Cấu trúc kháng nguyên • Thành phần kháng nguyên thân có ý nghĩa quan trọng, quyết định tính độc lực của vi khuẩn S. suis và nó nằm ở thành vi khuẩn; • Kháng nguyên giáp mô; • Kháng nguyên bám dính. Theo Jacques et al. (1990) Vi khuẩn S. suis là một trong số ít các loại vi khuẩn Gram dương có mang cấu trúc này. So với các loại vi khuẩn khác thì kháng nguyên bám dính của vi khuẩn S. suis có cấu trúc mỏng, ngắn, đường kính khoảng 2 nm và dài lên đến 250 nm. 2.2.5. Khả năng gây bệnh 2.2.5.1. Nguồn bệnh Liên cầu lợn luôn có mặt trong môi trường và ký sinh bình thường ở lợn nhưng không gây bệnh, hoặc chỉ gây các bệnh viêm nhiễm không thành dịch như viêm họng, nhiễm trùng mủ, nhiễm trùng phổi. Nơi cư trú của liên cầu lợn ở lợn là ở đường hô hấp trên đặc biệt là ở mũi, đường tiêu hoá và sinh dục. Vi khuẩn S. suis cũng thường xuyên phân lập được ở vòm họng và đường hô hấp trên của lợn khỏe, có thể tồn tại ở họng, xoang mũi (Almeida et al., 2006). 2.2.5.2. Đường lây truyền Bệnh lây truyền qua đường hô hấp do lợn khoẻ hít thở không khí có mầm bệnh, do tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khoẻ, do lợn ăn phải thức ăn và nước uống có mầm bệnh. Vi khuẩn cũng có thể xâm nhập qua các vết thương, các vết trầy xước để gây bệnh. Điều cần đặc biệt quan tâm là bệnh liên cầu khuẩn có thể lây truyền từ lợn ốm sang người và ngược lại. Vi khuẩn xâm nhập cơ thể người nếu có sự tiếp xúc với lợn, thịt lợn nhiễm bệnh chưa nấu chín kỹ. Vi khuẩn liên cầu lợn đi vào người qua các vết thương hở trên da hoặc niêm mạc mũi, miệng. Hiện nay chưa có bằng chứng nào về việc bệnh liên cầu khuẩn có thể lây trực tiếp từ người sang người (Tan et al., 2008a). 2.3. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH CỦA BỆNH DO VI KHUẨN S. SUIS GÂY RA 2.3.1. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn Lợn bị liên cầu khuẩn có thể có các biểu hiện sau: da lợn có thể có các màng đỏ, sần, các hạch lympho bị sưng, sung huyết, bao khớp dày lên, khớp bị 4
sưng và có dịch, màng não và não có thể bị tổn thương dạng phù nề, dịch não tuỷ đục, phổi bị tổn thương với nhiều dạng khác nhau như đông đặc, có mủ, viêm phế quản, viêm phổi, sốt cao. 2.3.2. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở người Nhiễm Streptococcus suis có thể gây ra những bệnh rất nặng và nguy hiểm đến tính mạng bệnh nhân. S. suis không chỉ là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não, viêm khớp ở lợn mà còn gây viêm nội tâm mạc ở người, một số trường hợp tiến triển tối cấp rất nhanh dẫn đến sốc nhiễm độc khuẩn gây suy đa phủ tạng và tử vong mà không kịp điều trị gì. Thời kỳ ủ bệnh kéo dài từ vài giờ đến 3 ngày. Người mắc liên cầu lợn chủ yếu chia làm hai thể là thể tối cấp: nhiễm trùng huyết, sốt cao, nhanh chóng xuất hiện các tử ban (xuất huyết hoại tử dưới da); và thể viêm màng não: sốt cao, đau đầu, nôn (Arends and Zanen, 1988). 2.4. CHẨN ĐOÁN Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm Gram, phát hiện cầu khuẩn Gram dương xếp thành chuỗi hoặc đứng đôi. Sau khi chẩn đoán xác định vi khuẩn, có thể cần tiến hành thử nghiệm PCR (TCVN 8400-2:2010), ELISA. 2.4.1. Chẩn đoán bằng phương pháp PCR Phương pháp PCR đã được Silva et al. (2006) sử dụng với cặp mồi CPS2 đặc hiệu cho việc xác định đoạn gene có kích thước 498 bp để xác định vi khuẩn Streptococcus suistype 2 trong mẫu bệnh phẩm. 2.4.2. Chẩn đoán bằng phương pháp ELISA Hiện nay, trên thị trường thế giới đã có một số công ty cung KIT ELISA chẩn đoán bệnh S. suis type 2 như Wuhan Unibiotest Co.,Ltd; Công ty antibodies-online. 2.5. ĐIỀU TRỊ 2.5.1. Điều trị bằng thuốc kháng sinh Trong thực tế dùng kháng sinh để điều trị bệnh luôn đem lại kết quả tốt. Khi dùng kháng sinh để điều trị bệnh phải dùng sớm, chỉ có hiệu quả tốt khi con vật chưa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng. Nếu điều trị muộn thì hiệu quả sẽ rất kém hoặc không có hiệu quả (Phạm Sĩ Lăng và cs., 2002; Hoàng Văn Năm, 2009). 2.5.2. Điều trị bệnh bằng huyết thanh Ngoài việc dùng kháng sinh và các hóa dược để điều trị bệnh do Streptococcus suis gây ra, thì việc dùng huyết thanh đặc hiệu để điều trị đã được các nhà khoa học trên thế giới đề cập đến từ lâu và nhiều nước đã dùng huyết thanh đặc hiệu điều trị bệnh do S. suis gây ra có hiệu quả tốt (Khương Bích Ngọc, 1996). 2.6. GIỚI THIỆU VỀ HẠT NANO VÀNG VÀ KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH 2.6.1. Tổng quan về hạt nano vàng Khi vàng khối thông thường được chế tạo ở kích thước nhỏ mức nano mét,chúng được gọi là các cấu trúc nano vàng. 5
2.6.2. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 2.6.2.1. Giới thiệu Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay (ICA)) dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể mà một trong hai thành phần này được gắn cộng hợp (conjugate) để phát hiện thành phần kia, sau đó nhờ phức hợp này chuyển dịch do tác dụng mao dẫn trên màng, để rồi được tóm bắt bằng kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện. Đây là công nghệ được mở rộng từ kỹ thuật ngưng kết hạt latex lần đầu tiên được phát triển vào năm 1956 bởi Singer and Plotz (1956). 2.6.2.2. Cấu tạo của KIT chẩn đoán nhanh Một que thử nhanh điển hình bao gồm có: màng nitroncellulose (NC), đệm mẫu (sample pad), đệm kháng thể cộng hợp (conjugate pad) và đệm hút (adsorbent pad). Màng NC được phun 2 loại kháng thể khác nhau tạo thành 2 đường song song là đường kiểm tra (vạch T) và đường đối chứng (vạch C) (hình 2.2) Hình 2.2. Cấu trúc que thử nhanh Nguồn: O’Farrell (2008) 2.6.2.3. Nguyên tắc hoạt động và đánh giá kết quả Mẫu bệnh phẩm xử lý bằng dung môi phù hợp được nhỏ vào đệm mẫu (sample pad). Toàn bộ huyễn dịch sẽ được chuyển dịch theo mao dẫn xuyên qua tấm cộng hợp, đến vạch T và vạch C và đi về phía đệm hút (Hình 2.3), có 2 trường hợp xảy ra: a) Nếu trong mẫu kiểm tra có kháng nguyên thì sẽ xuất hiện màu ở vạch T và vạch C. b) Nếu trong mẫu kiểm tra không có kháng nguyên thì chỉ xuất hiện màu ở vạch C. Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của KIT chẩn đoán nhanh Nguồn: Lee et al. (2013) 6
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Chuột nhắt trắng swiss albino (SA) 10 tuần tuổi, có khối lượng 30-32g/con được nuôi trong chuồng nhựa có lớp trấu đã hấp khử trùng, nhiệt độ phòng nuôi duy trì ở 25oC. Chuột được cho uống nước vô trùng và ăn thức ăn tổng hợp AniFood (Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế). Các chất bổ trợ khác nhau dùng trong sản xuất vắc xin: Freund's adjuvant (Sigma Aldrich), Montanide ISA 201 VG (Seppic, Pháp), Montanide ISA 50V2 (Seppic, Pháp). Các hóa chất và vật dụng chế tạo Kit chẩn đoán nhanh: Gold colloid 40nm (DCN, Mỹ), Đệm mẫu và đệm hút (whatman, Anh), sợi thủy tinh (whatman, Anh), màng nitrocellulose (whatman, Anh) Vật liệu, dụng cụ, máy móc phòng thí nghiệm: Tăm bông vô trùng lấy mẫu, ống falcon 15 ml, máy ly tâm Eppendorf (Centrifuge 5415D), máy PCR (PTC- 100) của MJ. Research Inc (Mỹ), máy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), tủ ấm CO2, tủ cấy vô trùng, Máy ELISA tự động BIO-RAD Coda Automated EIA, Bộ tinh sạch kháng thể IgG Econo-Pac protein A Kit (Bio-Rad, Mỹ) máy phun Biodot XYZ3060D0003, máy Strip Guillotine Cutter ZQ4000. Môi trường, hóa chất thí nghiệm Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Brain heart infusion (BHI, Eiken chemical), thạch máu, môi trường bile esculin agar, môi trường Todd Hewitt Broth (THB), thuốc thử Kovac (Biomerieux, Pháp), môi trường Kligler iron agar (KIA – Biomerieux, Pháp), dung dịch 3% H2O2, môi trường kiểm tra tính di động của vi khuẩn (Pepton: 10g, cao thịt: 3g, NaCl: 5g, agar: 4g, genlatin: 80g, nước cất: 1000ml). 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 + Xác định tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ; + Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2; + Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S. suis type 2. 3.2.2. Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2 + Xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên; + Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột nhắt trắng thí nghiệm; + Xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột nhắt trắng thí nghiệm; + Chế tạo, tách chiết và định lượng kháng thể IgG kháng S. suis type 2. 3.2.3. Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suistype 2 + Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt nano vàng; + Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 thích hợp để phản ứng với dung dịch gold colloid; + Chế tạo kháng thể cộng hợp. 7
3.2.4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 + Xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp phủ lên màng NC; + Xác định độ nhạy của KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn S. suis type 2; + Xác định độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn S. suis type 2. 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 3.3.1.1. Phương pháp xác định tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ Mẫu dịch mũi lợn tại các lò mổ (Bạch Yến, Bãi Dâu và Xuân Phú) được thu thập bằng cách lấy tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào mũi và cho mẫu vào 5 ml môi trường BHI, nuôi trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC trong 16 giờ rồi tiến hành tách ADN. a. Chuẩn bị dung dịch lysis mẫu - Dung dịch 1: 10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM KCl, 2,5 mM MgCl2; - Dung dịch 2: 10 mM Tris HCl (pH 8.3), 2,5 mM MgCl2, 1% Tween 20, 1% Triton X-100, 0,01% Nonidet P-10 (Marois et al., 2004). b. Tiến hành tách ADN Ly tâm ống nuôi 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn, sau đó giết vi khuẩn bằng cách cho ống fancol 15 chứa dịch vi khuẩn vào 100oC ủ trong 10 phút. Mẫu được hút cho vào ống eppendorf để tiến hành tách ADN. c. Trình tự primers Primer CPS2F: 5’-TTTGTCGGGAGGGTTACTTC-3’; Primer CPS2R: 5’-TTTGGAAGCGATTCATCTCC-3’. Với các cặp mồi được thiết kế ở trên, đoạn ADN cần nhân lên có độ dài khoảng 498 bp (Silva et al., 2006). d. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho PCR ADN của mẫu sau khi tinh sạch thì được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gene. Phản ứng PCR được thực hiện với 30 chu kỳ và nhiệt độ bắt mồi là 58oC. 3.3.1.2. Phương pháp phân lập, và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2 a. Phương pháp phân lập vi khuẩn S. suis type 2 Dịch nuôi của mẫu được xác định dương tính với S. suis type 2 bằng phương pháp PCR được cấy ria trên môi trường thạch máu cừu 5%, nuôi 16 giờ trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC. Sau khi nuôi, chọn ngẫu nhiên vài khuẩn lạc tròn lồi, khô, màu xám, nhỏ đặc trưng của Streptococcus spp để kiểm tra bằng phản ứng catalase và thử nghiệm bile esculin và các phản ứng sinh hóa khác. Bảo quản mẫu vi khuẩn để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. b. Phương pháp PCR xác định đặc tính sinh học phân tử + Trình tự primers 6PGD Primers 6PGD được thiết kế dựa vào trình tự ADN trên ngân hàng gene (gb/CP000407) (Tan et al., 2008b). 8
Primer 6PGD F: 5- GCG GAT CCA TGA CTA AAG CAA ATT TTG-3; Primer 6PGD R: 5- CCG TCG ACC TAT TTT GAT TCG CTA TAC-3. + Phản ứng PCR với Gotaq Green Mastermix Kit (promega, Mỹ) Với các cặp mồi được thiết kế ở trên, đoạn ADN cần nhân lên có độ dài khoảng 1428 bp. ADN của mẫu sau khi tinh sạch thì được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gene. Phản ứng PCR được thực hiện với 30 chu kỳ và nhiệt độ bắt mồi là 55oC. c. Tinh sạch sản phẩm PCR Sau khi thực hiện phản ứng PCR, một số lượng lớn các phân tử ADN của vùng cần nghiên cứu đã được nhân lên. Sản phẩm tinh sạch có thể được dùng để giải trình trình tự trực tiếp hoặc dòng hóa vào plasmid vector với hiệu suất tiếp nhận cao hơn. Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng KITWizard®SV Gel and PCR CleanUp System của hãng Promega (Mỹ) (xem Phụ lục 1). d. Phương pháp tạo dòng và phân tích trình tự gene +. Tạo vector tái tổ hợp Sản phẩm PCR sẽ được gắn vào vector pGEM® -T Easy Vector System theo phương pháp dòng hóa TA (TA-cloning), có enzyme T4 ADN ligase làm enzyme nối. Phản ứng nối ADN ngoại lai - sản phẩm của PCR được thực hiện ở 16ºC trong 16 giờ. +. Biến nạp vào tế bào Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt. +. Tách ADN plasmid tái tổ hợp Sử dụng bộ hóa chất tách chiết plasmid tái tổ hợp của hãng Invitrogene (Mỹ) (PureLink® Quick Plasmid ADN Miniprep Kits) được sử dụng hiện nay (xem Phụ lục 2). +. Kiểm tra ADN tái tổ hợp Sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi M13 và cặp mồi 6PGD được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của ADN ngoại lai trong plasmid. + Phương pháp kiểm phân tích trình tự của gene 6PGD Trình tự nucleotide của gene 6PGD được gửi phân tích ở Công ty 1st BASE, Malaysia thông qua Công ty TNHH phát triển Công nghệ ứng dụng Việt Nam VNDAT bằng phương pháp dideoxy terminator trên máy 3031 Analysis. Kết quả giải trình tự gene được phân tích bằng phần mềm BioEdit và so sánh mức độ tương đồng với trình tự đã được công bố trên ngân hàng gene NCBI. 3.3.1.3. Phương pháp chế tạo kháng nguyên từ vi khuẩn S. suis type 2 Chủng vi khuẩn S. suis 2 thuần được nuôi trong môi trường Todd Hewitt Broth trong 7 giờ, sau đó được thu và tái huyền phù với nước cất vô trùng; cấy lên đĩa thạch máu để đếm khuẩn lạc. Phần vi khuẩn còn lại được bất hoạt trong 1% formaldehyde ở 37oC trong 7 ngày (Ju et al., 2010). Vi khuẩn đã bất hoạt được thu và rửa 3 lần với PBS để loại bỏ formaldehyde. 9
3.3.2. Phương pháp chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng S. suis type 2 3.3.2.1. Thí nghiệm xác định tính sinh miễn dịch kháng nguyên S. suis 2 bất hoạt Để kiểm tra tính sinh miễn dịch của kháng nguyên S. suis 2, thí nghiệm được thực hiện trên 2 nhóm chuột chuột, mỗi lô 5 con; Nhóm được tiêm kháng nguyên: tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp vi khuẩn (1x108CFU) và montanide ISA 50V2 (200µl); Nhóm đối chứng: tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp PBS và montanide ISA 50V2; Chuột được tiêm 2 lần cách nhau 14 ngày, và tiến hành lấy máu kiểm tra vào ngày thứ 19 tính từ mũi tiêm lần 1. 3.3.2.2. Thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch Xác định lượng kháng nguyên thích hợp gây tối miễn dịch được thực hiện trên 3 nhóm chuột SA (4 con/nhóm) được tiêm phúc mạc 400 µl hỗn hợp kháng nguyên với liều khác nhau (2x108 CFU/chuột, 1,5x108 CFU/chuột và 1x108 CFU/chuột)và chất bổ trợ montanide ISA 50V2 (200µl). Chuột được tiêm 3 lần, cách nhau 14 ngày/lần. Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch Nội dung Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Số chuột thí nghiệm (con) 4 4 4 Lượng kháng nguyên 2x108 1,5x108 1x108 (tế bào vi khuẩn/chuột) Montanide Montanide ISA Montanide ISA Chất bổ trợ ISA 50V2 50V2 50V2 3.3.2.3. Thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch Xác định chất bổ trợ thích hợp (Freund's, Montanide ISA 201 VG và Montanide ISA 50V2) được thực hiện trên ba nhóm chuột SA (4 con/nhóm) với liều kháng nguyên được xác định căn cứ vào kết quả của thí nghiệm xác định lượng. Chuột được tiêm 3 lần, cách nhau 14 ngày/lần. 3.3.2.4. Phương pháp tách chiết và định lượng kháng thể kháng S. suis type 2 a. Phương pháp chế tạo kháng thể kháng S. suis type 2 Kháng thể kháng S. suis type 2 được chế tạo bằng cách tiêm vào phúc mạc chuột 15 con chuột SA 400 µl huyễn dịch gồm 200 µl kháng nguyên và 200 µl chất bổ trợ. Lượng vi khuẩn bất hoạt và chất bổ trợ thích hợp được xác định theo các thí nghiệm trên (mục 3.3.2.2 và mục 3.3.2.3). Nhóm đối chứng gồm 3 con chuột được tiêm tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp gồm 200 PBS và 200 chất bổ trợ tương tự. Chuột được tiêm 3 lần, mỗi lần cách nhau 14 ngày. b. Tách chiết kháng thể kháng S. suis type 2 Để tinh chế kháng thể IgG kháng S. suis type trong huyết thanh chuột, nghiên cứu này sử dụng KIT Econo-Pac protein A (Biorad) (xem phụ lục 3). c. Phương pháp định lượng kháng thể kháng S. suis type 2 sau tinh sạch + Phương pháp định lượng kháng thể BCA Sau khi tách chiết, hàm lượng kháng thể được xác định bằng Pierce BCA Protein Assay Kit của hãng Thermo. 10
+ Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể Hiệu giá kháng thể kháng S. suis type 2 được xác định bằng phương pháp ELISA gián tiếp. Mẫu kháng thể được pha loãng dẫn theo cấp số 2. Hiệu giá kháng thể được xác định bằng độ pha độ pha loãng cao nhất của mẫu mà ở đó vẫn xuất hiện phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể. c. Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể Độ tinh sạch của kháng thể sau lọc được kiểm tra bằng điện di polyacrylamide gel 15% có SDS ở 80 V. Sau đó, gel được nhuộm với dung dịch Coomassie Blue R250. Phân tích kết quả điện di dựa theo sự xuất hiện và kích thước của các băng protein được nhuộm so mới thang protein chuẩn (marker). d. Phương pháp ELISA gián tiếp Phủ đĩa với kháng nguyên vi khuẩn S. suis 2 bất hoạt đã được pha loãng với dung dịch carbonate-bicarbonate buffer (Sigma) với nồng độ 2,5x107 vi khuẩn/ml. Cơ chất được sử dụng là OPD. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 492 nm theo đề nghị của nhà sản xuất cơ chất OPD. Mẫu dương tính khi giá trị OD> giá trị giới hạn (Cut off). Giá trị giới hạn = trung bình OD của nhóm đối chứng + (3x Sai số chuẩn của nhóm đối chứng) (Classen et al., 1987). 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể chống Streptococcus suis type 2 3.3.3.1. Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt nano vàng pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano được xác định bằng cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid (pH từ 6.5 - 8.5) với 25 µl dung dịch kháng thể kháng S. suis type 2 (C= 500 µg/ml), lắc nhẹ trong 30 phút, sau đó thêm 250 µl dung dịch NaCl 10%. Ủ 10 phút và quan sát. pH thích hợp để gắn là pH mà ở đó hỗn hợp dung dịch trên vẫn giữ được màu hồng tươi. Màu hồng tươi được phát hiện ở bước sóng 520 nm (Paek et al., 2000). 3.3.3.2. Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 thích hợp để phản ứng với dung dịch colloidal gold Nồng độ kháng thể kháng S. suis 2 tối ưu để gắn với hạt vàng nano vàng trong dung dịch đươc xác định bằng cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid với 25 µl dung dịch kháng thể kháng S. suis type 2 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600 µg/ml) lắc nhẹ trong 30 phút, sau đó thêm 250 µl dung dịch NaCl 10%. Ủ 10 phút và quan sát ống có nồng độ thấp nhất không bị đổi từ màu hồng sang màu xanh (đo ở bước sóng 520 nm). Nồng độ protein của ống đó chính là nồng độ protein tối thiểu cần để gắn với gold colloid. 3.3.3.3. Phương pháp chế tạo kháng thể cộng hợp Kháng thể cộng hợp được chế tạo bằng cách ủ kháng thể kháng S. suis 2, với gold colloid (DCN, 40 nm, Mỹ) với tỷ lệ (1:10, vol/vol) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó thêm 10% albumin huyết thanh bò (BSA) để cố định các phân tử đã gắn kết. Ly tâm 12.000 vòng trong 30 phút ở 40C, bỏ dịch nổi. Phần cặn được rửa bằng hỗn hợp 10mM Tris-HCl (pH 8.2) chứa 1% BSA, 5% sucrose. Sau khi ly tâm bỏ dịch nổi, kháng thể cộng hợp được pha loãng trong 100 µl hỗn hợp rửa (Chaudhuri and Raychaudhuri, 2001). Cuối cùng kháng thể 11
cộng hợp được cho lên giấy thủy tinh sợi (glass fiber), phơi khô ở nhiệt độ phòng qua đêm. 3.3.4. Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 3.3.4.1. Phương pháp xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp phủ lên màng nitrocellulose Nồng độ kháng thể chuột kháng S. suis type 2 (kháng thể bắt) thích hợp được xác định bằng cách phun lên màng nitrocellulose (NC) ở đường kiểm tra với các nồng độ khác nhau (1,5; 1,75; 2,0 mg/ml), đồng thời phun Anti-Mouse IgG antibody produced in goat (Sigma-Aldrich, 1 µg/cm) lên màng NC ở đường đối chứng bằng máy Biodot XYZ3060D0003. 3.3.4.2. Phương pháp xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh a. Thí nghiệm xác định lượng vi khuần tối thiểu cho kết quả dương tính với KIT chẩn đoán nhanh Tiến hành cho vào đệm mẫu của KIT 100 µl dung dịch chứa vi khuẩn S. suis type 2 với lượng khác nhau. Lượng vi khuẩn tối thiểu KIT chẩn đoán có thể phát hiện được xác định ở mức vi khuẩn tối thiểu mà KIT vẫn xuất hiện 2 băng có thể quan sát được (Ju et al., 2010). b. Thí nghiệm xác định phản ứng chéo của KIT chẩn đoán nhanh Phản ứng chéo của KIT được xác định bằng cách cho vào đệm mẫu của KIT chẩn đoán 100 µl dung dịch chứa 5x107 các loại vi khuẩn khác như E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Viện Công nghệ sinh học-Đại học Huế) và một số chủng vi khuẩn S. suis không phải là type 2 (Bùi Thị Hiền và cs., 2016). Quan sát sự xuất hiện của các băng màu trên KIT trong 5-10 phút. c. Thí nghiệm xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT được xác định bằng các so sánh với kết quả của phương pháp PCR trong việc xác định mẫu dương tính và âm tính. Bảng 3.2. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh PCR Kit phát hiện nhanh Dương tính Âm tính Dương tính a c Âm tính b d Ghi chú: a: Kết quả dương tính khi được xác định bằng KIT và PCR b: Kết quả dương tính khi được xác định bằng PCR nhưng âm tính khi xác định bằng KIT c: Kết quả âm tính khi được xác định bằng PCR nhưng dương tính khi xác định bằng KIT d: Kết quả âm tính khi được xác định bằng PCR và bằng KIT 3.3.5. Phương pháp phân tích số liệu Số liệu thu thập được trong thí nghiệm xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên; thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp và chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột được tính toán bằng phần mềm Excel 2003. Sai khác có ý nghĩa (với α=0,05) được xác định bằng T-test; Độ đặc hiệu và độ nhạy của KIT được xác định bằng phần mềm MedCalc 15.4 dựa theo kết quả chuẩn được xác định bằng phương pháp PCR. 12
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 4.1.1. Tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ Với kết quả PCR, nhận thấy tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 của lợn phân lập tại lò mổ Bạch Yến là 13,33%, lò mổ Bãi Dâu là 7,50% và lò mổ Xuân Phú là 6,67%. Như vậy, tính tổng tỷ lệ nhiễm S. suis type 2 trên địa bàn Thừa Thiên Huế là 9,00. 4.1.2. Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2 4.1.2.1. Phân lập vi khuẩn S. suis type 2 Từ 9 mẫu dương tính với S. suis type 2, chọn 1 mẫu và tiến hành ria cấy để phân lập vi khuẩn trên môi trường thạch máu cừu. Chọn một khuẩn lạc đơn có hình dạng đặc trưng của vi khuẩn liên cầu lợn. Chủng vi khuẩn phân lập này được đặt tên là TTHSS2. Kết quả nhuộm gram cho thấy vi khuẩn có hình hơi giống trực khuẩn, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, trong tiêu bản có thể thấy vi khuẩn có những độ dài khác nhau bắt màu gram (+). Làn 1: Marker 1kb (Bioline), làn 2 đến 10: các mẫu dương tính, làn 11: chứng âm Hình 4.1. Kết quả PCR kiểm tra mẫu dương tính với S. suis type 2 Để chế tạo KIT chẩn đoán nhanh, việc phân lập và chọn được chủng vi khuẩn thích hợp, có đủ đặc tính sinh hóa và đặc tính sinh học đặc trưng của vi khuẩn S. suis type 2 rất quan trọng. Kết quả thực hiện phản ứng sinh hóa vi khuẩn liên cầu lợn thu được như sau: 13
Bảng 4.1. Kết quả sinh hóa vi khuẩn S. suis TT Chỉ tiêu Kết quả 1 Gram + 2 Bile esculin + 3 Catalase - 4 Lên men đường glucose + 5 Lên men đường lactose + 6 Indol - 7 Di động - Sau khi xác định hình thái vi khuẩn và xác định một số chỉ tiêu sinh hóa, khuẩn lạc Streptococus suis tách ADN để làm khuôn cho phương pháp PCR xác định S. suis type 2 với cặp mồi đặc hiệu. 4.1.2.2. Xác định đặc tính sinh học phân tử của chủng vi khuẩn TTHSS2 Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR của S. suis type 2 có kích thước khoảng 1428 bp (hình 4.2), tương ứng với chiều dài lý thuyết đoạn ADN của gen 6PGDvới cặp mồi 6PGD.F và 6PGD.R. Làn 1: marker 1kb (biobasic), làn 2 và 3: mẫu Hình 4.2. Kết quả PCR nhân đoạn gen 6PGD 4.1.2.3. Kết quả giải trình tự gene của vi khuẩn chủng TTHSS2 Phân tích trình tự nucleoctit của gene 6GPD thuộc chủng S. suis type 2 phân lập tại Thừa Thiên Huế nhận thấy có sự sai khác tại 14 vị trí nucleoctit so với gene 6GPD của chủng S. suis type 2 do Tan et al. (2008b) phân lập được tại Trung Quốc đã được công bố trên ngân hàng gene (bảng 4.2). Sự sai khác này có thể là do đặc tính sinh học, thích nghi của từng chủng S. suis type 2 tại mỗi quốc gia khác nhau. Bảng 4.2. Sự sai khác của gene 6PGD của vi khuẩn S. Suis type 2 phân lập được với gene 6PGD của vi khuẩn S. Suis type 2 trên ngân hàng gene Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác 486 A-— 1074 C-T 1119 C–G 574 C-T 1093 C-G 1123 T–C 632 T-— 1095 G-T 1132 A-G 1034 C-G 1112 — -G 1134 C-T 1039 A-G 1115 C-— 14
4.1.3. Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S. suis type 2 Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn TTHSS2 thuần được nuôi trong môi trường THB trong vòng 7 giờ, tiến hànhly tâm thu cặnvi khuẩn. Cặn vi khuẩn được tái huyền phù với nước cất vô trùng và cấy trãi lên đĩa thạch máu để đếm số khuẩn lạc. Phần vi khuẩn còn lại được bất hoạt trong 1% formaldehyde ở 37oC trong 7 ngày. Kết quả trên vi khuẩn TTHSS2 sau khi được xử lý bằng dung dịch formaldehyde 1% không mọc được trên môi trường thạch máu. Như vậy, chúng tôi đã chế tạo thành công kháng nguyên thô vi khuẩn chủng TTHSS2 để phục vụ cho quá trình chế tạo kháng thể kháng vi khuẩn liên cầu lợn type 2. 4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐA DÒNG KHÁNG S. SUIS TYPE 2 4.2.1. Kết quả xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên Nghiên cứu cho thấy giá trị OD492 ở nhóm được tiêm kháng nguyên cao hơn rất nhiều lần so với giá trị tới hạn (Cut off = 0,180) (bảng 4.3), trong khi các mẫu huyết thanh của nhóm đối chứng có giá trị OD492 rất thấp. Bảng 4.3. Hiệu giá kháng thể của chuột sau tiêm vắc xin Chuột thí nghiệm Giá trị OD Mean±SD 1 2,321 2 2,333 Nhóm được tiêm 3 2,256 2,391±0,087 kháng nguyên 4 2,455 5 2,232 6 0,135 7 0,159 Nhóm đối chứng 8 0,143 0,138 ± 0,014 9 0,122 10 0,132 Giá trị Cut off : 0,180 Trong quá trình nghiên cứu, chuột ở nhóm thí nghiệm được theo dõi đều an toàn, không có biểu hiện bất thường. Do vậy có thể khẳng định tính an toàn và khả năng sinh đáp ứng miễn dịch cao của kháng nguyên S. suis type 2 trong nghiên cứu này. 4.2.2. Kết quả xác định lượng kháng nguyên thích hợp cho khả năng đáp ứng miễn dịch ở chuột SA Kết quả ở thí nghiệm kiểm tra tính sinh miễn dịch và tính an toàn của kháng nguyên TTHSS2 cho thấy chất lượng kháng nguyên tốt, không gây bệnh, an toàn cho động thí nghiệm nên có thể sử dụng cho thí nghiệm chế tạo kháng thể kháng TTHSS2. Kết quả trình bày tại bảng 4.4 cho thấy thấy hàm lượng kháng kháng thể của nhóm 1 và 2 cao hơn nhiều so với hàm lượng kháng thể ở nhóm 3. Giá trị 15
OD492 trung bình qua 49 ngày theo dõi ở nhóm được tiêm kháng nguyên với hàm lượng 2x108 CFU/ chuột là 2,113; ở nhóm 2 là 2,111 và nhóm 3 là 1,890. Bảng 4.4. Ảnh hưởng của liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch của chuột SA Trung Ngày lấy mẫu 0 7 21 28 35 42 49 bình Nhóm CFU/chuột Giá trịOD492 1 2x108 0,190 1,570 2,628 2,518 2,621 2,629 2,633 2,113a 2 1,5x108 0,192 1,552 2,634 2,514 2,622 2,630 2,632 2,111a 3 1x108 0,187 1,435 2,314 2,139 2,321 2,357 2,375 1,890b a, b: các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa (Ptα/2). Tuy nhiên, không có sự sai khác giữa hàm lượng kháng thể của nhóm 1 và nhóm 2 (|t|
Hàm lượng kháng thể trong 7 ngày đầu sau khi gây đáp ứng miễn dịch lần 1 của các nhóm chuột không có sự sai khác. Tuy nhiên, sau lần tiêm thứ 2, hàm lượng kháng thể của chuột ở các nhóm bắt đầu thay đổi. Vào ngày thứ 21, hàm lượng kháng thể ở nhóm 1 đạt cao nhất (2,665), tiếp theo là nhóm 3 sử dụng chất bổ trợ Montanide ISA 50V2 (2,652) và thấp nhất ở nhóm 2 (2,596). So sánh hàm lượng kháng thể sau 3 lần gây đáp ứng miễn dịchcho thấy có sự sai khác có ý nghĩa ở cả 3 lô (|t|>tα/2), trong đó nhóm 1 sử dụng chất bổ trợ Freund's cho đáp ứng miễn dịch tốt nhất, giá trị OD492 trung bình của cả giai đoạn thí nghiệm là 2,151 và thấp nhất là chất bổ trợ Montanide ISA 201 VG. Do vậy, trong thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp cho quá trình đáp ứng miễn dịch của chuột nhắt trắng, Freund's được lựa chọn làm chất bổ trợ thích hợp, làm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột với kháng nguyên S. suis 2 bất hoạt. 4.2.4. Tinh chế và định lượng kháng thể 4.2.4.1. Kết quả chế tạo kháng thể Với mục đích sản xuất kháng thể kháng vi khuẩn S. suis type 2 phục vụ cho quá trình chế tạo KIT chẩn đoán nhanh; căn cứ vào kết quả nghiên cứu lượng kháng nguyên và chất bổ trợ thích hợp để gây đáp ứng miễn dịch cho chuột SA. Tiến hành tiêm vào phúc mạc 15 con chuột SA được huyễn dịch gồm 200 µl kháng nguyên chứa 1,5x107 CFU vi khuẩn S. suis type 2 bất hoạt và 200 µl chất bổ trợ Freund. Bảng 4.6. Kết quả chế tạo kháng thể kháng S. suis type 2 Chuột thí Giá trị OD492 nghiệm Ngày 0 Mean±SD Ngày 49 Mean±SD 1 0,145 2,812 2 0,153 2,716 3 0,144 2,746 4 0,148 2,753 5 0,159 2,810 6 0,146 2,787 Nhóm 7 0,162 2,699 được tiêm 8 0,153 0,152±0,007 2,756 2,763±0,040 kháng 9 0,161 2,715 nguyên 10 0,147 2,821 11 0,139 2,735 12 0,152 2,751 13 0,155 2,743 14 0,165 2,805 15 0,148 2,801 16 0,154 0,156 Nhóm đối 17 0,159 0,155±0,004 0,161 0,155±0,007 chứng 18 0,151 0,147 17
Kết quả từ bảng 4.6 cho thấy hàm lượng kháng thể kháng S. suis type 2 trong huyết thanh chuột rất cao, giá trị OD492 dao động từ 2,699 đến 2,821. Giá trị OD492 trung bình là 2,763. Giá trị OD492 vào ngày thứ 49 của quá trình tiêm trong thí nghiệm này cao hơn so với giá trị OD492 vào ngày thứ 49 của thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp (2,633) và thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp cho đáp ứng miễn dịch ở chuột với kháng nguyên S. suis type 2 (2,722). 4.2.4.2. Kết quả tinh sạch kháng thể Kết quả điện di được (hình 4.3) cho thấy nồng độ protein trong huyết thanh khá cao. Mẫu 1 nồng độ IgG nhiều hơn so với các mẫu khác. Xuất hiện 2 băng chính tương ứng với chuỗi nặng (~50 kDa) và chuỗi nhẹ (~25 kDa). Ở mẫu huyết thanh thô, albumin có hàm lượng rất lớn, nhưng sau khi tinh chế thì thành phần này hầu như không có. Như vậy, huyết thanh tinh chế có độ sạch cao đặc biệt là thành phần albumin được loại bỏ gần như hoàn toàn. Làn 1: Marker protein (Biobasic 10-200 kDa), làn 2: albumin, làn 3, 4 và 5: các mẫu kháng thể tinh sạch Hình 4.3. Gel nhuộm màu Coomassie Blue SDS-PAGE của các mẫu kháng thể đã tinh sạch 4.2.4.3. Định lượng kháng thể Dựa trên phương trình hồi quy y = 831,46x - 161,62, với y là nồng độ protein thu được, x là giá trị OD562 được xây dựng từ số liệu OD của các mẫu chuẩn, suy ra được nồng độ kháng thể trong mẫu. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất KIT, cứ mỗi 3 ml huyết thanh sẽ thu được 6 lô kháng thể tinh khiết, mỗi lô gồm 8 ml kháng thể có nồng độ khác nhau gồm 4 ml có nồng độ cao (C>1000 mg/ml) và 4 ml nồng độ thấp (C