Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida, streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm xây dựng quy trình sản xuất và quy trình sử dụng, bảo quản vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi có hiệu quả cao trên đàn lợn cho người chăn nuôi. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida, streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh

H C VI N NỌNG NGHI P VI T NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ĐỖ T T Đ T NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC ĐIỂM B NH LÝ CỦA LỢN M C VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ SỬ DỤNG VACXIN PHọNG B NH Chuyên ng̀nh: B nh lý h c v̀ chữa b nh v t nuôi M̃ ś: 9 64 01 02 TÓM T T LU N ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN H C VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021 1
Công trình hòn th̀nh t i: H C VI N NỌNG NGHI P VI T NAM Người hướng d n: 1. PGS.TS. Nguy n Bá Hiên 2. PGS.TS. Cù Hữu Phú Ph n bi n 1: GS.TS Nguy n Quang Tuyên Trường Đ i h c Nông Lâm, Đ i h c Thái Nguyên Ph n bi n 2: PGS.TS Ph m Ng c Th ch H c viên Nông nghi p Vi t Nam Ph n bi n 3: PGS.TS Ph m Công Ho t B Khoa h c và Công ngh Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin, Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2
PH Nă1.ăM ăĐ U 1.1. TệNHăC PăTHI TăC AăĐ ăTẨI Trong ngành công nghiệp chăn nuôi ở Việt Nam thì chăn nuôi lợn đóng vai trò quan trọng. Tính đến đầu năm 2020, mặc dù ngành chăn nuôi lợn nước ta đã phải trải qua đợt dịch tả lợn Châu Phi gây thiệt hại nặng nề, tổng số lợn trong cả nước vẫn còn khoảng 20 triệu lợn (Tổng cục Thống kê, 2020). Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn vẫn luôn phải gánh chịu nhiều thiệt hại do những bệnh truyền nhiễm khác gây ra, vì vậy việc phòng chống bệnh nhằm giảm thiệt hại, nâng cao năng suất chăn nuôi luôn cần được coi trọng, phòng bệnh bằng vacxin là một trong những giải pháp quan trọng. Trong các bệnh thường gặp trên lợn, những bệnh về đường hô hấp được xếp vào nhóm bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế. Bệnh đường hô hấp ở lợn hiện nay nguyên nhân do nhiều mầm bệnh gây ra, trong đó có cả sự kết hợp của virus và vi khuẩn gây bệnh, khiến việc điều trị bệnh gặp không ít khó khăn. Trong số những vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp ở lợn, vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae), Pasteurella multocida (P. multocida) và Streptococcus suis (S. suis) thường gây viêm phổi kế phát, giết chết rất nhiều lợn ở các lứa tuổi, đặc biệt quan trọng là lợn sau cai sữa, gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn ở nước ta (Cù Hữu Phú & cs., 2005). Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công ty khác nhau nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn gây ra, như vacxin Porcilis phòng bệnh phổi cho lợn do vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae), P. multocida serotype A, D và Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) gây ra của Intervet sản xuất, vacxin M+ PAC và vacxin Myco Shield phòng bệnh do vi khuẩn M. hyopneumoniae gây ra của Intervet sản xuất, vacxin Bayovac SuiShot của hãng Bayer chế tạo là vacxin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi cho lợn trên 5 tuần tuổi đã sử dụng 2 chủng A.pleuropneumoniae serotype 2, 5 và 1 chủng P. multocida serotype D; ... vv. Như vậy, các vacxin nhập ngoại đã và đang được sử dụng tại các trang trại chăn nuôi lợn ở nước ta là vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn được chế tạo từ chủng vi khuẩn Actinobacillus hoặc M. hyopneumoniae, P. multocida nhưng các chủng vi khuẩn sử dụng chế vacxin chưa hoàn toàn phù hợp với những nguyên nhân gây bệnh viêm phổi ở lợn tại thực địa, đồng thời vacxin nhập ngoại lại có giá thành cao. Tại Việt Nam vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P.multocida gây ra là kế thừa và phát triển từ đề tài cấp Nhà nước kết quả nghiên cứu của Dự án SXTN đã được nghiệm thu năm 2014 và đưa vào sản xuất của Viện Thú y. Hiện nay ở nước ta duy nhất có công ty Marphavet sản xuất và được phép lưu hành vacxin đa giá vô hoạt với bổ trợ keo phèn để phòng viêm phổi cho lợn từ 4 tuần tuổi. Vacxin được chế tạo là vacxin đa giá vô hoạt bao gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P. multocida là nguyên nhân chủ yếu chủ yếu gây bệnh viêm phổi ở lợn. Tuy nhiên việc sử dụng bổ trợ keo phèn trong chế tạo vacxin vẫn có những hạn chế nhất định về hiệu lực, khả năng gây đáp ứng và độ dài miễn dịch chưa cao. Hiện nay tại Việt Nam chưa có vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh cho lợn được chế tạo gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.multocida và S. suis. Vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu sẽ làm tăng hiệu lực phòng 1
bệnh của vacxin, liều vacxin tiêm giảm, đặc biệt là thời gian miễn dịch của vacxin được kéo dài hơn nhiều nhờ phức hợp nhũ kháng nguyên. Xuất phát từ tình hình thực tiễn của sản xuất, đáp ứng được cơ sở khoa học cho việc phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn, việc nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis và sử dụng vacxin phòng chống bệnh là yêu cầu cần thiết, nhằm đưa ra các giải pháp phòng trị bệnh viêm phổi ở lợn hiệu quả cao, giảm thiệt hại cho nghành chăn nuôi lợn. 1.2. M CăTIểUăC AăĐ ăTẨI 1.2.1. M cătiêuăchung Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý và xây dựng giải pháp phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis bằng vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu. 1.2.2. M cătiêuăc ăth - Xác định được đặc điểm biến đổi bệnh lý chủ yếu của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra. - Xây dựng quy trình sản xuất và quy trình sử dụng, bảo quản vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi có hiệu quả cao trên đàn lợn cho người chăn nuôi. 1.3. PH MăVIăNGHIểNăC U 1.3.1. Đ iăt ngănghiênăc u - Bộ giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b ; vi khuẩn P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2 được sử dụng làm giống gốc (Master seed) lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet. - Lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra. 1.3.2. Ph măviănghiênăc u Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu các đặc tính vi sinh vật hóa học, cấu trúc kháng nguyên, độc lực và khả năng sử dụng làm chủng giống sản xuất vacxin của các vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; vi khuẩn P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2 được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet. Địa điểm nghiên cứu gồm: Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam ; Phòng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo tiêu chuẩn GMP WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet và một số cơ sở chăn nuôi lợn. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020 1.4. NH NGăĐịNGăGịPăM IăC AăĐ ăTẨI - Chế tạo thành công vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b; P. multocida serotype A, D và S. suis serotype 2 gây ra tại Việt Nam ở quy mô phòng thí nghiệm. 2
- Xây dựng được quy trình sản xuất, sử dụng và bảo quản vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn lần đầu tiên tại Việt Nam ở quy mô phòng thí nghiệm. Vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra trên lợn, có chất bổ trợ nhũ dầu đầu tiên được sản xuất tại Việt Nam, giúp tăng hiệu quả phòng bệnh, kéo dài thời gian miễn dịch và khả năng bảo hộ so với vacxin cùng loại có bổ trợ keo phèn. 1.5. Ý NGHƾAăKHOAăH CăVẨăTH CăTI NăC AăĐ ăTẨI 1.5.1. ụănghƿaăkhoaăh c Kết quả nghiên cứu của đề tài đã góp phần bổ sung thêm các thông tin về quy trình sản xuất vacxin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra tại Việt Nam tại quy mô phòng thí nghiệm. Đồng thời là cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin đa giá có chất bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn trên dây chuyền sản xuất vacxin quy mô công nghiệp. 1.5.2. ụănghƿaăth căti n - Kết quả gây bệnh thực nghiệm với các vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis cùng với các bệnh tích lâm sàng của lợn mắc bệnh được sử dụng là phương pháp chẩn đoán lâm sàng bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra cho lợn nhanh chóng, có hiệu quả kinh tế cao. - Vacxin vô hoạt đa giá nhũ dầu sản xuất thành công sẽ được sử dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất, góp phần khống chế hiệu quả bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra ở lợn nuôi tại Việt Nam. PH N 2.ăT NGăQUANăTẨIăLI U 2.1. TỊNHăHỊNHăNGHIểNăC U TRểNăTH ăGI I V ăB NHăVIểMăPH Iă ăL Nă VẨăVACXINăPHọNGăB NHă Bệnh viêm phổi - màng phổi được Pattison phát hiện lần đầu tiên vào năm 1957 (Pattison & cs., 1957) và đã được Shope (1964) mô tả ca bệnh cấp tính với các triệu chứng tương tự ở đàn lợn nuôi tại một trang trại thuộc Argentina và gọi tên mầm bệnh là Haemophilus pleuroneumonia. Với kết quả nghiên cứu ADN, Haemophilus pleuroneumonia được xếp vào giống Actinobacillus và được đặt tên là Acitinobacillus pleuropneumoniae. Đây là một cầu trực khuẩn gram âm, có giáp mô. Hiện có 15 serotype được phân bố theo từng vùng. Mỗi serotype có thể tạo ra ngoại độc tố Apx I, II hoặc III. Các ngoại độc tố này chính là tác nhân chính gây thương tổn trên phổi và làm giảm năng suất của lợn (Herczeg & cs., 2014). Vào những năm đầu của thế kỷ 21, một thế hệ vacxin mới, vacxin tiểu đơn vị bao gồm ba ngoại độc tố RTX chính (ApxI, ApxII, và ApxIII) và một protein 42 kDa bên ngoài màng của A. pleuropneumoniae đã được nghiên cứu cho thấy có khả năng bảo vệ cao chống lại tất cả 12 kiểu huyết thanh chính (kiểu huyết thanh 1-12) trong điều kiện thí nghiệm cũng như trong các thử nghiệm thực tế (Van Den Bosch & Frey, 2003). Bệnh viêm phổi do Pasteurella gây ra là kết quả của sự lây nhiễm của vi khuẩn P. multocida cho phổi. Bệnh thường thấy ở giai đoạn cuối của bệnh viêm phổi cục bộ hay ở những bệnh ghép ở đường hô hấp ở lợn (PRDC). Hội chứng này là một trong những bệnh 3
gây thiệt hại cho lợn đặc biệt khi chúng sản sinh tăng lên. Những tài liệu đã công bố thừa nhận rằng những tổn thương ở bệnh viêm phổi khi giết mổ rất điển hình, thậm chí cả ở những đàn lợn được quản lý tốt. Những báo cáo qua nghiên cứu nhiều năm tập chung ở lợn với những bệnh tích viêm phổi tại lúc mổ khám dao động từ thấp là 30% đến cao nhất là 80%. Những số liệu gần đây tại Mỹ cho thấy trong 6634 mẫu lấy từ lợn để kiểm tra phổ biến là 74% lợn bị viêm phổi và 13 % với chứng viêm màng phổi. Những ghi nhận đầu tiên về bệnh do S. suis gây ra ở lợn được Jansen và Van Dorssen mô tả ở Hà Lan vào năm 1951 và tại Anh vào năm 1954 (Field & cs., 1954). (De Moor, 1963) lần đầu tiên đã phân lập được vi khuẩn Streptococcus gây dung huyết dạng alpha, dựa vào kết quả giám định đặc tính sinh hóa và định serotype đã xếp vào nhóm Lancefield R, S, RS và T. (Elliott & cs., 1966) thấy rằng các vi khuẩn nhóm S do Moor phân lập giống với PM Streptococcus mà ông phân lập đều thuộc nhóm Lancefield D và đề nghị gọi là Streptococcus suis serotype 1. Windsor & Elliott (1975) đã phân lập chủng Streptococcus suis tương ứng với nhóm R do Moor phân lập và đề nghị gọi là Streptococcus suis serotype 2. Clifton-Hadley (1984) thông báo phân lập được vi khuẩn Streptococcus suis thuộc nhóm T từ hạch amidan, dịch âm đạo và bao quy đầu của lợn và được Gottschalk & cs. (1989) gọi là Streptococcus suis serotype 15. 2.2. TỊNHăHỊNHăNGHIểNăC UăT IăVI TăNAMăV ăB NHăVIểMăPH Iă ăL Nă VẨăVACXINăPHọNGăB NHă Các nghiên cứu ở trong nước cho thấy, khi lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản thường gặp các loại vi khuẩn gây bệnh kế phát trong đường hô hấp như Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis serotype 2, Bordetella bronchiseptica Nguyễn Hữu Nam & Nguyễn Thị Lan (2007), Bùi Quang Anh & cs. (2008), Nguyễn Thị Kim Lan & cs. (2017), Cù Hữu Phú (2005) đã làm cho dịch trầm trọng với bệnh lý nặng, kéo dài và tỷ lệ chết cao. Theo Lê Văn Dương (2013) tại các ổ dịch lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản tại tỉnh Bắc Giang đã phân lập được các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis, trong đó cao nhất là S. suis (55,10%), tiếp sau là A. pleuropneumoniae (19,59%) và thấp nhất là P. multocida (17,44%). Các tác giả đã nghiên cứu chế tạo Autovaccine từ các chủng vi khuẩn trên phân lập được dùng để phòng bệnh viêm phổi cho lợn, kết quả cho thấy Autovaccine thử nghiệm có khả năng phòng bệnh viêm phổi cho lợn, cho đáp ứng miễn dịch trên bốn tháng và hiệu lực bảo hộ là 93,33%. PH Nă3.ăV T LI U,ăN IăDUNG VÀ PH NGăPHỄPăNGHIểNăC U 3.1. Đ AăĐI MăNGHIểNăC U - Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam; Phòng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo tiêu chuẩn WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet và một số cơ sở chăn nuôi lợn. 3.2.ăTH IăGIANăNGHIểNăC U Đề tài thực hiện từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020. 4
3.3.ăV TăLI UăNGHIểNăC U - Bộ vi khuẩn sử dụng làm giống gốc (Master seed) sản xuất vacxin viêm phổi lợn lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin gồm có: + Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b. + Vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D + Vi khuẩn Streptococcus suis serotype 2 - Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu, sản xuất vacxin đa giá phòng viêm phổi ở lợn + Các loại môi trường dùng để nuôi cấy, lưu giữ vi khuẩn do hãng Oxoid (Anh) và Merck (Pháp) sản xuất: Môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate, BHI broth, BHI agar, TSB, PLLO agar … + Các loại môi trường, hóa chất dùng để giám định, xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: Môi trường đường các loại, dung dịch Kovac’s, dung dịch H2O2 3%, giấy thử Oxidase, nước muối 6,5%, ... + NAD do hãng Oxoid (Anh) sản xuất. + Chất bổ trợ nhũ dầu IMS 1313 do công ty Seppic- Pháp cung cấp. - Động vật thí nghiệm: + Lợn sau cai sữa khỏe mạnh không tiêm vacxin có kháng nguyên A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. + Chuột nhắt trắng: 18- 20 g khỏe mạnh. - Máy móc, dụng cụ thí nghiệm + Các máy móc, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm, các hoá chất sát trùng, tiêu độc, rửa dụng cụ ... để thực hiện các kỹ thuật như PCR, RT-PCR; ELISA, .... + Dây chuyền công nghệ chế tạo vacxin quy mô công nghiệp như bộ máy lên men sục khí 15 lít và 120 lít SATORIUS của Đức; hệ thống ra chai tự động của Ý. 3.4.ăN IăDUNGăNGHIểNăC U 3.4.1.ăNghiênăc uătri uăch ngălơmăsƠng,ăb nhătíchăđ iăth ăc aăl năm căb nhădoăviă khu năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra - Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra. - Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra. - Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra. 3.4.2. Nghiênăc uăđánhăgiáăkh ănĕngă năđ nhăđ cătínhăsinhăh căc a b gi ngăs năxu tă vacxinăphòngăb nhădoăviăkhu năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra - Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra. - Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra. 5
- Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra. 3.4.3. Nghiênăc uăquyătrìnhăs năxu tăvacxinăđaăgiáăvôăho tănhǜăd uăphòngăb nhăviêmă ph i ăl nădoăviăkhu năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra - Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra. - Nghiên cứu đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm. - So sánh khả năng sinh miễn dịch của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. - Xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra. - Xây dựng quy trình bảo quản vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra. 3.5.ăPH NGăPHỄPăNGHIểNăC U 3.5.1. Ph ngăphápăgơyăb nhăth cănghi măbằngăcácăch ngăviăkhu năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis master seed Chọn 24 con lợn sau cai sữa (4 tuần tuổi) khỏe mạnh không tiêm vacxin viêm phổi có kháng nguyên A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. Trước khi gây bệnh cho lợn, tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể (âm tính) có trong máu lợn với A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. Lợn được chia làm 8 lô, mỗi lô có 3 con. Liều gây bệnh bằng 100 liều LD 50, với đường gây bệnh dưới da lợn. Lợn đối chứng được tiêm BHI broth vô trùng. Theo TCVN 8685. 3.5.2. Ph ngăphápănuôiăc yăviăkhu năvƠăgiámăđ nhăđ cătínhăsinh hóa Phương pháp giám định các đặc tính nuôi cấy trên các loại môi trường, đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu theo (Moller & cs., 1996; Quinn & cs., 2012) và theo TCVN- 8685. Bệnh phẩm là phổi, dịch ngoáy vùng hầu họng được cấy sơ cấp lên môi trường thạch máu hoặc môi trường thạch chọn lọc Colombia. Sau khi nuôi cấy trong tủ ấm có 5% CO2, có thể chọn 1-2 khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng để giám định vi khuẩn về mặt hình thái và đặc tính sinh hóa tùy theo loại vi khuẩn. Việc kiểm tra đặc tính sinh hóa theo TCVN 8685. 3.5.3. Ph ngăphápăPCR - Xác định A. pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR theo (Gram & cs., 1998) - Xác định các type giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocida dựa trên phản ứng PCR được mô tả bởi (Đỗ Ngọc Thúy & cs., 2007). - Bốn serotype S. suis gây bệnh thường gặp nhất ở lợn là serotype 1, 2, 7 và 9 được xác định bằng phản ứng PCR. 3.5.4. Ph ngăphápăđánhăgiáăđ căl căviăkhu nătrênăchu tăvƠăl n Độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trong nghiên cứu này, được xác định trên chuột nhắt trắng và trên lợn. Xác định độc lực của các chủng 6
A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng theo phương pháp của (Carter, 1995), tính liều LD50 theo (Reed & Muench, 1938).Với mỗi chủng vi khuẩn, sử dụng canh trùng được nuôi cấy ở 37◦C/24 giờ, riêng với A. pleuropneumoniae nuôi cấy trong điều kiện có 5% CO2 mỗi một chủng vi khuẩn được tiêm cho 2 chuột thí nghiệm vào dưới da với liều 0,2 ml/con. Với lợn, mỗi lợn được gây bệnh thực nghiệm ở liều 5 ml/con (Theo TCVN 8685). 3.5.5. Ph ngăphápăch ăt oăvacxinăđaăgiáăvôăho tănhǜăd u Giống gốc master seed: được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin gồm: Vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; Vi khuẩn P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2. Bộ giống gốc này đang được sử dụng để sản xuất vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh viêm phổi cho lợn, đã được phép lưu hành trên toàn quốc. Các vi khuẩn của bộ giống gốc này có cấu trúc kháng nguyên ổn định, kháng nguyên tính cao, sản sinh các loại độc tố và độc lực cao (Hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc thú y: Sản phẩm: MAR-APPSVAC - vacxin viêm phổi lợn đa giá, 2015). 3.5.6.ăPh ngăphápăki m nghi m vacxin * Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng Kiểm tra cảm quan, đậm độ và vô trùng: Vacxin được kiểm tra vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc) theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8684:2011 và theo quy trình của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y quốc gia. * Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn Kiểm tra an toàn: Vacxin được kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng bằng cách tiêm bắp đùi liều 0,5 ml/con. Bên cạnh đó vacxin cũng được kiểm tra an toàn trên lợn bằng cách tiêm vacxin liều gấp đôi (4 ml/con) cho lợn 4 tuần tuổi với đường tiêm bắp. Theo dõi các phản ứng của chuột nhắt và lợn để xem mức độ an toàn của vacxin thử nghiệm. * Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực Kiểm tra hiệu lực: Vacxin được kiểm tra phải có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đạt hiệu lực ≥ 70% khi công cường độc. Lợn thí nghiệm là lợn khỏe mạnh, trên 4 tuần tuổi. 3.5.7. Ph ngăphápăx ălỦăs ăli u Số liệu thu được trong nghiên cứu được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2019 và phần mềm R phiên bản 4.0.2. PH Nă4.ăK T QU VÀ TH O LU N 4.1. K TăQU ăNGHIểNăC UăTRI UăCH NGăLỂMăSẨNG,ăB NHăTệCHăĐ IăTH ă C AăL NăM CăB NHăDOăVIăKHU NăA. PLEUROPNEUMONIAE, P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA 4.1.1. K tăqu ănghiênăc uătri uăch ngălơmăsƠng,ăb nhătíchăđ iăth ăc aăl năm căb nhă doăviăkhu năA. pleuropneumoniae gây ra 4.1.1.1 Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD 50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, 7
chúng tôi đã xác định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm như sau: A. pleuropneumoniae serotype 2: 4,5 x 109 CFU/ml; Chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5a và 5b có cấu trúc kháng nguyên và độc lực tương đồng nhau, nên chúng tôi chọn chủng 5a đại diện cho 2 chủng 5a và 5b để gây bệnh thực nghiệm cho lợn với liều A. pleuropneumoniae serotype 5a: 5 x 10 9 CFU/ml. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae được thể hiện ở bảng 4.1. B ng 4.1. K t qu đánhăgiáăkh nĕngăgơyăb nh l n c a vi khu n A. pleuropneumoniae K tăqu ătheoădõi S ăl nă Lô thí Ch ngăviăkhu năăgơyă Li uăgơyă thí Phân Tỷăl ă nghi m b nh b nhă nghi m S ăconă Th iăgiană ch t l păl iă (ml/con) (con) ch t ch t vi (%) khu n A. pleuropneumoniae 5 3 3/3 6 – 12 h 100 3/3 serotype 2 Lô 1 A. pleuropneumoniae 5 3 2/3 6 – 20 h 66,7 3/3 serotype 5a Lô 2 Đối chứng 0 3 0 0 B ng 4.2. Tri u ch ng lâm sàng và b nhătíchăđ i th c a l năđ c gây nhi m A. pleuropneumoniae S l n S l n Bi u hi n Tỷ l gây b nh (con) bi u hi n (con) Sốt 6 6 6/6 Ho, thở khó 6 6 6/6 Chảy máu mũi 6 5 5/6 Khí quản chứa dịch nhày lẫn máu 6 5 5/6 Viêm dính phổi và thành ngực 6 6 6/6 Ghi chú: A: Lợn chảy máu mũi; B: Phổi viêm dính thành ngực Hình 4.1. M t s b nhătíchăđ i th c a l năđ c gây nhi m A. pleuropneumoniae 8
4.1.1.2 Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ thuật PCR Sau khi gây bệnh thực nghiệm, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh để khẳng định các chủng vi khuẩn nghiên cứu chính xác là A.pleuropneumoniae. Hình ảnh 4.2 chụp kết quả điện di những sản phẩm PCR của 03 mẫu đã phân lập đều cho sản phẩm với độ dài 950 bp, đặc hiệu với độ dài của gen omlA của vi khuẩn A. Pleuropneumoniae. khuẩn A. Pleuropneumoniae. M 1 2 3 Ghi chú: - Giếng 1, 2, 3: Sản phẩm PCR xác định gen 1000 bp omlA (950 bp) của A. pleuropneumoniae; 950 bp - Giếng M: 1000 bp marker Hình 4.2. S n ph m c a kỹ thu tăPCRăxácăđ nh vi khu n A. pleuropneumoniae 4.1.2. K tăqu ănghiênă c uătri uă ch ngă lơmă sƠng,ăb nhătíchăđ iăth ăc aă l năm că b nhădoăviăkhu năP. multocida gây ra 4.1.2.1. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD50 của vi khuẩn P. multocida, chúng tôi đã xác định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm như sau: P. multocida serotype A: 4,5 x 109 CFU/ml và P. multocia serotype D: 4,5 x 10 9 CFU/ml. B ng 4.3. K t qu đánhăgiáăkh nĕngăgơyăb nh l n c a vi khu n P. multocida K tăqu ătheoădõi S ăl nă Phân Lô thí Ch ngăviăkhu năgơyă Li uăgơyă thí Th iă Tỷăl ă S ăconă l păl iă nghi m b nh b nhă nghi m gian ch t ch t vi (ml/con) (con) ch t (%) khu n P. multocida serotype A 5 3 3/3 20- 28 h 100 3/3 Lô 1 P. multocida serotype D 5 3 3/3 20- 24 h 100 3/3 Lô 2 Đối chứng 0 3 0 0 9
B ng 4.4. Tri u ch ng lâm sàng và b nhătíchăđ i th c a l năđ c gây nhi m P. multocida S l n gây b nh S l n bi u hi n Bi u hi n Tỷ l (con) (con) Sốt 6 6 6/6 Ho, thở khó 6 6 6/6 Da đỏ tím 6 5 5/6 Viêm phổi thùy 6 6 6/6 Phổi lợn bị viêm Hình 4.3. M t s b nhătíchăđ i th c a l năđ c gây nhi m P. multocida 4.1.2.2 Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ thật PCR Sau khi gây bệnh, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm và xác định các serotype giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocida dựa trên phản ứng PCR. Ghi chú -Giếng M: 1000 bp marker -Giếng 1, 2, 3, 4: chủng phân lập serotype A (1044 bp) -Giếng 5: đối chứng dương serotype A (1044 bp); -Giếng 6: đối chứng dương serotype B (760 bp); -Giếng 7: đối chứng dương serotype D (657 bp) Hình 4.4. S n ph m c a kỹ thu tăPCRăxácăđ nh vi khu n P. multocida 4.1.3. K tăqu ănghiênăc uătri uăch ngălơmăsƠng,ăb nhătíchăđ iăth ăc aăl năm căb nhă doăviăkhu năS. suis gây ra 4.1.3.1. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD50 của vi khuẩn S. suis, chúng tôi đã xác định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm là : 4,5 x 109 CFU/ml. 10
B ng 4.5. K t qu đánhăgiáăkh nĕngăgơyăb nh l n c a vi khu n S. suis K tăqu ătheoădõi Li uăgơyă S ăl năthí Lô thí Ch ngăviăkhu nă Tỷăl ă Phơnăl pă b nhă nghi m S ăconă Th iă nghi m gơyăb nh ch t l iăviă (ml/con) (con) ch t gianăch t (%) khu n Lô 1 S. suis serotype 2 5 3 3/3 36 h 100 3/3 Lô 2 Đối chứng 0 3 0 0 B ng 4.6. Tri u ch ng lâm sàng và b nhătíchăđ i th c a l năđ c gây nhi m S. suis S l n S l n Tỷ l Bi u hi n gây b nh (con) bi u hi n (con) (%) Sốt 3 3 3/3 Ho, thở khó 3 3 3/3 Triệu chứng thần kinh 3 3 3/3 Viêm phổi 3 3 3/3 Viêm khớp 3 1 1/3 Viêm màng não 3 3 3/3 Viêm khớp ở lợn Hình 4.5. M t s tri u ch ng lâm sàng, b nhătíchăđ i th c a l n gây nhi m S. suis 4.1.3.2. Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ thuật PCR Sau khi gây bệnh, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm và xác định vi khuẩn với mồi của phản ứng PCR. Kết quả hình 4.6 cho thấy: chủng S. suis nghiên cứu, sau quá trình chạy PCR và điện di đều cho một sản phẩm đặc hiệu và giống nhau là 688 bp 11
M 1 2 3 Ghi chú: Giếng M: 1000 bp marker Giếng 1, 2, 3: sản phẩm PCR xác định gen gdh (688 bp) của S. suis 1000 bp 688 bp Hình 4.6. S n ph m c a kỹ thu t PCRăxácăđ nh S. suis 4.2. K Tă QU ă ĐỄNHă GIỄă KH ă NĔNGă Nă Đ NHă Đ Că TệNHă SINHă H Că C Aă GI NGăS NăXU TăVACXINăPHọNGăB NHăDOăVIăKHU NăA. PLEUROPNEUMONIAE, P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA 4.2.1. K tăqu ăđánhăgiáăkh ănĕngă năđ nhăđ cătínhăsinhăh căc aăgi ngăs năxu tăvacxină phòngăb nhădoăviăkhu năA. pleuropneumoniae gây ra 4.2.1.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn A. pleuropneumoniae thể hiện ở hình 4.7. Hình A: Khuẩn lạc của APP trên thạch PPLO Hình B: Vi khuẩn APP trên kính hiển vi Hình 4.7. Khu n l c A. pleuropneumoniae và hình thái vi khu n khi soi trên kính hi n vi 4.2.1.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa Sau khi nuôi cấy trên môi trường, chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất. Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa cho thấy: 100% số chủng dương tính với các phản ứng Oxidase, Catalase, Urease, CAMP, O.N.P.G và cần yếu tố V cho quá trình phát triển, 100% số chủng đều âm tính với phản ứng Indol. Các chủng A. pleuropneumoniae được kiểm tra có khả năng lên men các loại đường Glucose, Maltose, Mannitol, Xylose và không có chủng nào lên men các loại đường: 12
Arabinose, Lactose, Raffinose, Sorbitol. Như vậy cả 3 chủng A. pleuropneumoniae được lựa chọn dùng cho nghiên cứu đều mang các đặc tính sinh vật hóa học điển hình của vi khuẩn A. pleuropneumoniae như mô tả của (Moller & cs., 1996), cũng phù hợp với các nghiên cứu của (Trịnh Quang Hiệp & cs., 2004; Cù Hữu Phú & cs., 2005; Nguyễn Thị Thu Hằng, 2010). 4.2.1.3. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR Trong nghiên cứu này, chúng tôi ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR để xác định sự có mặt của các gen mã hóa độc tố Apx ở 3 chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu. Kết quả thể hiện ở bảng 4.7. B ng 4.7. K t qu xácăđ nh gen s năsinhăđ c t c a gi ng s n xu t A. pleuropneumoniae Ký hi u S Ch ngămangăgenăđ c t Apx Serotype ch ng ch ng apxICA apxIICA apxIIICA apxIBD apxIIIBD A1 2 1 0 1 1 1 1 A2 5a 1 1 1 0 1 0 A3 5b 1 0 0 1 1 1 Kết quả cho thấy, các chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu đều có mang từ 3 đến 4 gen quy định sản sinh độc tố Apx. Tất cả 2 chủng thuộc serotype 5 đều mang ba loại gen mã hóa độc tố, trong đó chủng có serotype 5a mang tổ hợp gen apxICA/apxIICA/apxIBD, còn chủng có serotype 5b mang tổ hợp gen apxIIICA/apxIBD/apxIIIBD. 4.2.2. K tăqu ăđánhăgiáăkh ănĕngă năđ nhăđ cătínhăsinhăh căc aăgi ngăs năxu tăvacxină phòngăb nhădoăviăkhu năPasteurella multocida gây ra 4.2.2.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn P. multocida thể hiện ở hình 4.8. Hình A: Khuẩn lạc của P. multocida Hình B: Vi khuẩn P. multocida trên KHV Hình 4.8. Khu n l c P. multocida và hình thái vi khu n khi soi trên kính hi n vi 13
4.2.2.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa Tất cả các chủng đều dương tính với phản ứng Indol, Oxidase, Catalase. 100% chủng có khả năng lên men các loại đường Glucose, Galactose, Mannitol, Saccharose, Fructose và không lên men các đường Lactose, Arabinose, Maltose. 4.2.2.3. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phản ứng Multiplex PCR để xác định các type giáp mô A, B, D của các chủng P. multocida được lựa chọn dùng cho nghiên cứu theo quy trình đã được chuẩn hóa của Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y (Đỗ Ngọc Thúy & cs., 2007). Các cặp mồi được sử dụng là CAPA-F và CAPA-R dùng để xác định type A, CAPB-F và CAPB-R để xác định type B, CAPD-F và CAPD-R để xác định type D. B ng 4.8. K t qu xácăđ nh y u t đ c l c c a gi ng s n xu t P. multocida TT KH ch ng Serotype A Serotype B Serotype D 1 A4 + 2 A5 + 4.2.3. K t qu đánhăgiáăkh nĕngă năđ nhăđ c tính sinh h c c a gi ng s n xu t vacxin phòng b nh do vi khu n S. suis gây ra 4.2.3.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn S. suis thể hiện ở hình 4.9. Hình A: Khuẩn lạc của S. suis Hình B: Vi khuẩn S. suis trên kính hiển vi Hình 4.9. Khu n l c S. suis và hình thái vi khu n khi soi trên kính hi n vi 4.2.3.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa Chủng kiểm tra không phát triển trong môi trường NaCl 6,5% và âm tính với phản ứng KOH 3%. Chủng đều âm tính với phản ứng Oxydase, Catalase, Indol. Chủng kiểm tra lên men các loại đường: Glucose, Galactose, Maltose, Lactose và không có chủng nào lên men các đường Mannitol, Sorbitol. 14
4.3. NGHIểNă C Uă QUYă TRỊNHă S Nă XU Tă VACXINă ĐAă GIỄă VỌă HO Tă NHǛă D Uă PHọNGă B NHă VIểMă PH I ă L Nă DOă VIă KHU Nă A. PLEUROPNEUMONIAE, P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA 4.3.1. Nghiênăc uăxơyăd ngăquyătrìnhăs năxu tăvacxinăđaăgiáăvôăho tănhǜăd uăphòngăb nhă viêmăph i ăl nădoăviăkhu năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra 4.3.1.1. Kết quả theo dõi các lô lên men sục khí Chúng tôi đã chế tạo vacxin dạng vô hoạt có bổ trợ keo phèn và nhũ dầu theo quy trình thường quy của Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y và quy trình sản xuất vacxin theo dây chuyền sản xuất công nghiệp của nhà máy vacxin GMP-WHO. Các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được nuôi cấy riêng từng loại vi khuẩn, mỗi loại vi khuẩn được nuôi cấy 3 lô khác nhau bằng phương pháp lên men sục khí. B ng 4.10. K t qu nuôi c y vi khu n bằngăph ngăphápălênămenăs c khí S l ng vi khu n Lo i vi khu n S l n nuôi c y trung bình (x 109 CFU/ml) A. pleuropneumoniae 3 10,67 ± 0,52 CFU/ml P. multocida 3 13,33 ± 1,37 CFU/ml S. suis 3 11,00 ± 0,89 CFU/ml 4.3.1.2. Chuẩn bị các loại kháng nguyên và bán thành phẩm Sau khi vô hoạt vi khuẩn trong canh trùng thu được bằng cách sử dụng formol với tỷ lệ 0,3%, tiến hành kiểm tra vô trùng trên các loại môi trường nước thịt, thạch máu và nước thịt yếm khí. Các loại kháng nguyên sau khi kiểm tra đảm bảo vô hoạt 100% sẽ được tiến hành pha trộn với bổ trợ nhũ dầu IMS-1313 theo hướng dẫn của Seppic với tỷ lệ 25% (3 phần canh trùng kháng nguyên + 1 phần nhũ dầu). Dựa trên kết quả lên men sục khí mỗi loại kháng nguyên (A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; S. suis serotype 2 và P. multocida serotype A và D), cần tiến hành pha trộn các loại kháng nguyên với nhũ dầu (25%) để có trong mỗi một liều tiêm vacxin cho lợn (2ml vacxin/lợn) đảm bảo như sau: + Kháng nguyên A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b có 4 - 4,5x109 CFU/liều tiêm. + Kháng nguyên S. suis serotype 2: 4- 4,5 x109 CFU/liều tiêm + Kháng nguyên P. multocida A và D: 4- 4,5 x109 CFU/liều tiêm. Sau khi vacxin bán thành phẩm được sản xuất, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ thuần khiết của vi khuẩn bằng phương pháp làm tiêu bản quan sát vi sinh vật chết và kiểm tra dưới kính hiển vi. 15
4.3.2. K t qu đánhăgiáăch tăl ng vacxin bán thành ph m Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy trên các loại môi trường như sau: B ng 4.11. K t qu ki mătraăđ măđ , thu n khi t và vô trùng c a lô gi ngăđ năgiá Ch ătiêuăki mătra S ălôăthíă Lo iăviăkhu n Đ măđ ă Thu năkhi t Vô trùng nghi m (x 109 CFU/ml) n (%) n (%) A. pleuropneumoniae 3 10,67 ± 0,52 3/3 (100) 3/3 (100) P. multocida 3 13,33 ± 1,37 3/3 (100) 3/3 (100) S. suis 3 11,00 ± 0,89 3/3 (100) 3/3 (100) B ng 4.12. K t qu ki m tra thu n khi t và vô trùng c aăvacxinăđaăgiáăbánă thành ph m Ch ătiêuăki mătra Lôăthíănghi m Thu năkhi t Vô trùng 1 Đạt Đạt 2 Đạt Đạt 3 Đạt Đạt Tổng hợp 3/3 (100%) 3/3 (100%) Sau khi đã kiểm tra 3 lô canh trùng chế tạo được đều đạt các tiêu chuẩn chế vacxin, tiến hành trộn lẫn các lô canh trùng với nhau theo tỷ lệ phù hợp để đạt được một hỗn hợp canh trùng đồng nhất, rồi bổ sung nhũ dầu với tỷ lệ 1/4 để đảm bảo trong 2 ml vacxin có chứa 4- 5 x 109 CFU. Kiểm tra an toàn của vacxin chế tạo trên chuột nhắt trắng: chọn mỗi lô 10 chuột, mỗi con chuột tiêm vacxin với liều 0,5 ml/con vào bắp đùi. Theo dõi chuột trong vòng 10 ngày. B ng 4.13. K t qu ki m tra an toàn c a vacxin bán thành ph m trên chu t nh t tr ng Th i gian S chu t thí S chu t Tỷ l Đ t thí Li u tiêm và theo dõi nghi m s ng s ng Bi u hi n nghi m đ ng tiêm (ngày) (con) (con) (%) 0,5 ml/con; Chuột phát triển, ăn 1 10 10 10 100 tiêm bắp đùi uống bình thường 0,5 ml/con; Chuột phát triển, ăn 2 10 10 10 100 tiêm bắp đùi uống bình thường 0,5 ml/con; Chuột phát triển, ăn 3 10 10 10 100 tiêm bắp đùi uống bình thường 16
Lợn được kiểm tra an toàn với liều tiêm gấp đôi liều sử dụng theo tiêu chẩn kiểm nghiệm vacxin vi khuẩn vô hoạt: tất cả 5 lợn trên 4 tuần tuổi được tiêm vacxin theo mỗi lô đều sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm qua 10 ngày theo dõi. Điều này khẳng định rằng vacxin chế tạo đã đạt yêu cầu về chỉ tiêu an toàn 100% trên lợn. B ng 4.14. K t qu ki m tra an toàn c a vacxin bán thành ph m trên l n Th i gian S l n thí Tỷ l Đ t thí Li u tiêm và S l n theo dõi nghi m s ng Bi u hi n nghi m đ ng tiêm s ng (con) (ngày) (con) (%) Lợn khỏe mạnh, không có phản 4 ml/con; 1 10 5 5 100 ứng nơi tiêm và phản ứng toàn tiêm bắp thân Lợn khỏe mạnh, không có phản 4 ml/con; 2 10 5 5 100 ứng nơi tiêm và phản ứng toàn tiêm bắp thân Lợn khỏe mạnh, không có phản 4 ml/con; 3 10 5 5 100 ứng nơi tiêm và phản ứng toàn tiêm bắp thân B ng 4.15. K t qu th hi u l c c a vacxin trên chu t nh t tr ng bằngăph ngăphápăthay th S l ng chu t S l ng chu t Th i gian ch t Lô chu t Lo i canh trùng tiêm côngăc ngăđ c ch t (con) chu t (gi ) APP serotype 2 5 0/5 APP serotype 5a 5 1/5 48 APP serotype 5b 5 0/5 Thí nghiệm P. multocida serotype A 5 0/5 P. multocida serotype D 5 0/5 S. suis serotype 2 5 0/5 Không tiêm 5 0/5 APP serotype 2 5 5/5 24 APP serotype 5a 5 5/5 48 APP serotype 5b 5 5/5 48-72 Đối chứng P. multocida serotype A 5 5/5 48 P. multocida serotype D 5 5/5 24 S. suis serotype 2 5 5/5 72 17
B ng 4.16. K t qu ki m tra hi u l c vacxin trên l n bằng ph ngăpháp tr ng tài Li u S l n công Đ ng S l n ch t Th i gian Lô l n tiêm Lo i canh trùng tiêm c ngăđ c (con) tiêm (con) ch t (gi ) (ml) A. pleuropneumoniae serotype 2 3 0/3 A. pleuropneumoniae serotype 5a 3 0/3 A. pleuropneumoniae serotype 5b 3 0/3 Thí P. multocida serotype A 3 1/3 72 Dưới da 5 ml nghi m P. multocida serotype D 3 0/3 S. suis serotype 2 3 0/3 A. pleuropneumoniae + S. suis + 0/3 P. multocida 3 A. pleuropneumoniae serotype 2 2 2/2 24 A. pleuropneumoniae serotype 5a 2 2/2 24 A. pleuropneumoniae serotype 5b 2 2/2 72 Đ i P. multocida serotype A 2 2/2 24 Dưới da 5 ml ch ng P. multocida serotype D 2 2/2 24 S. suis serotype 2 2 2/2 72 A. pleuropneumoniae + S. suis + 2 2/2 24 P. multocida Ghi chú: LD50 của A. pleuropneumoniae serotype 2 là 4,3 x 107 CFU/0,2 ml và serotype 5 là 4,8 x 107 CFU/0,2 ml. LD50 của chủng P. multocida serotype A là 4 x 107 CFU/0,2 ml và serotype D là 4,2 x 107 CFU/0,2 ml. LD50 của S. suis serotype 2 là 4,4 x 107 CFU/0,2 ml 4.3.3. K t qu so sánh kh nĕngăsinhămi n d ch c aăvacxinăđaăgiáăb tr keo phèn và vacxinăđaăgiáăb tr nhǜăd u ch ng l i vi khu n A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis 4.3.3.1. Kết quả kiểm tra kháng thể của vacxin vô hoạt nhũ dầu Vacxin bán thành phẩm đa giá đã đạt được chỉ tiêu về cảm quan, vô trùng, an toàn và hiệu lực. Tuy nhiên, để biết được khả năng bảo hộ và thời gian bảo hộ của vacxin với bản động vật, hiệu giá kháng thể theo thời gian cần được xác định. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của vacxin đa giá cho thấy: trước thời điểm tiêm vacxin, những lợn thí nghiệm được kiểm tra và thấy đều âm tính kháng thể trong máu. Tuy nhiên, vacxin đa giá đã giúp cho cơ thể lợn sản sinh kháng thể ở mức cao. Vào thời điểm 21 ngày sau tiêm vacxin, hàm lượng kháng thể chống A. pleuropneumoniae dao động từ 6,5 ± 0,71 log2 đến 7,4 ± 0,52 log2. Hàm lượng kháng thể chống P. multocida type A và D là 6,5 ± 0,53 và 6,4 ± 0,52 còn hàm lượng kháng thể chống S. suis type 2 là 6,0 ± 0,00 log2. Với hiệu giá kháng thể ở những thời điểm sau đó (2 tháng, 3 tháng, 4 tháng, 5 tháng) đã cho thấy, hàm lượng kháng thể chống lại những mầm bệnh xét nghiệm giảm dần. 18