Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đa dạng và phát triển nguồn gen một số loài lan hài (Paphiopedilum) đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp "Nghiên cứu đa dạng và phát triển nguồn gen một số loài lan hài (Paphiopedilum) đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam" được nghiên cứu với mục tiêu: Đánh giá đa dạng di truyền các loài hài của khu vực miền núi phía Bắc bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền các loài lan hài thu thập được làm cơ sở cho việc chọn tạo nguồn vật liệu di truyền tốt phục vụ cho nhân giống, bảo tồn và lai tạo, tạo tiền đề phát triển một số loài lan hài có giá trị phục vụ sản xuất và nhu cầu chơi hoa.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đa dạng và phát triển nguồn gen một số loài lan hài (Paphiopedilum) đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ TÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN MỘT SỐ LOÀI LAN HÀI (Paphiopedilum) ĐẶC HỮU KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM Ngành : Di truyền và Chọn giống cây trồng Mã số : 962.01.11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Ngô Xuân Bình 2. TS. Trần Ngọc Hùng HÀ NỘI – 2023
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: .................................................................................................................. Phản biện 1: ........................................................................................................................... Phản biện 2: ........................................................................................................................... Phản biện 3: ........................................................................................................................... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án Tiến sĩ họp tại: ............................... .................................................................................................................................................................. Vào hồi ............... giờ ........... phút, ngày ........ tháng ..........năm 2023 Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện: ............................................................................... ............................................................................................................................................. ............................................................................................................................................. .............................................................................................................................................
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Tiến Dũng, Trần Trung Kiên, Lê Thanh Ninh, Đào Duy Hưng, Ngô Xuân Bình, Trần Ngọc Hùng (2022), “Nghiên cứu khả năng nhân giống của lan hài Việt Nam (Paphiopedilum vietnamese) bằng kỹ thuật in vitro”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, số 18 kỳ 2, tr.25-32. 2. Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Tiến Dũng, Trần Trung Kiên, Lê Thanh Ninh, Đào Duy Hưng, Ngô Xuân Bình, Trần Ngọc Hùng (2022), “Ảnh hưởng của một số biện pháp kỹ thuật trong nhân giống lan hài Điểm ngọc (Paphiopedilum emersonii) bằng phương pháp tách mầm tại Thái Nguyên. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 18 kỳ 1, tr.20-28. 3. Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Tiến Dũng, Trần Trung Kiên, Lê Thanh Ninh, Đào Duy Hưng, Ngô Xuân Bình, Trần Ngọc Hùng (2022), “Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể và dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của lan hài Việt Nam (Paphiopedilum vietnamese) giai đoạn vườn ươm.Tạp chí Rừng và Môi Trường, số 113, tr.85-89. 4. Thi Tinh Nguyen, Tien Dung Nguyen, Xuan Thanh Dao, Truc Dat Chu, Xuan Binh Ngo (2018)“In Vitro Propagation of Vietnam Endemic Lady ‘s Llipper Orchid (Paphiopedilum vietnamense O.Gruss & Perner Joural of Horticulre and Plant Research”, Journal ò Horticulture and Plant Research, vol 1, pp1-8.
1 MỞ ĐẦU Khu vực miền núi phía Bắc gồm khu vực Đông Bắc và Tây Bắc Việt Nam bao gồm Quảng Ninh, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Bắc Kạn, Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Lào Cai, Sơn La,…Đây là những tỉnh có diện tích rừng, vườn quốc gia và khu bảo tồn lớn ở Việt Nam. Khu vực này là trung tâm đa dạng sinh học và hoạt động du lịch sinh thái cao do đó việc khai thác và tiêu thụ nguồn lan rừng với khối lượng lớn dẫn đến những loài thực vật quý hiếm có giá trị kinh tế trên địa bàn đang bị cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Chi lan hài Việt Nam (Paphiopedium) có sự đa dạng về số lượng và chất lượng với sự xuất hiện của 26 loài lan hài chiếm 37% số loài lan hài trên thế giới. [Averyanov, 2008 [1]. Lan hài hấp dẫn người yêu lan trong nước và trên thế giới bởi sự đa dạng về màu sắc, hình dạng và kích thước của lá, hoa và cánh môi. Sự đa dạng không chỉ được thể hiện ở cấp độ loài mà còn thể hiện ở các cá thể trong loài. Bên cạnh đó chúng còn xuất hiện nhiều biến thể có lợi cho cây và hấp dẫn người chơi (hài Giáp biến thể là hài Jacki) hoặc hài Đuôi công biến thể (hài Tam Đảo, hài Trần Tuấn) Sự khác biệt này chỉ có người đam mê hài mới đủ sự tinh tế để phân biệt chúng. Một số loài lan hài còn có hương thơm lôi cuốn người chơi (hài Hương, hài Hằng, hài Ân, hài Hồng). Lan hài đã hội tụ cho mình đủ hương, sắc và sự tinh tế của một loài hoa quý phái. Điều đó càng gia tăng sự thú vị đối với các nhà sưu tầm, chọn giống, phân loại thực vật lan trên thế giới và ở Việt Nam. Lan hài có nhiều giá trị trong làm cảnh, nghiên cứu và có thể mang lại tiềm lực kinh tế tạo công ăn việc làm cho hàng triệu người nếu như biết khai thác và phát triển bền vững. Tuy nhiên, các loài hài của Việt Nam bị khai thác trong tình trạng quá mức, môi trường sống của chúng bị hủy hoại, khả năng tự nhân giống phụ thuộc nhiều vào yếu tố môi trường vì hạt lan hài không có chứa nội nhũ. Các yếu tố đó đẩy chúng vào tình trạng từ nguy cấp đến tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Năm 2006 Sách đỏ Việt Nam đã đưa 13 loài lan hài vào tình trạng nguy cấp và lan hài Việt Nam (hài Bóng) trong tình trạng tuyệt chủng tự nhiên (EW) [Sách đỏ Việt Nam, 2006 [15] đến năm 2019 Nghị định 06/2019/NĐ-CP 2019 của chính phủ về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp thực thi công ước về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp, đã bổ sung thêm 9 loài hài vào nhóm IA nâng tổng số các loài lan hài rơi vào tình trạng nguy cấp 22 loài và 1 loài bị tuyệt chủng tự nhiên [Nghị định 06/2019/NĐ –CP, [6]. Điều này cho thấy tốc độ cạn kiệt, tuyệt chủng nguồn gen của các loài hài rất nhanh. Việc đánh giá, nghiên cứu các loài lan hài hiện nay gặp nhiều khó khăn do một số nguyên nhân như: số lượng cá thể đang bị thu hẹp, sức sống của cây và khả năng ra hoa không ổn định khi di thực từ rừng hoặc từ vùng này sang vùng khác. Trong nhân giống và lai tạo lan hài, hạt phấn dễ mất sức nảy mầm, phôi hạt không có chứa nội nhũ vì vậy hạt chỉ có thể nảy mầm trong điều kiện gặp môi trường giàu dinh dưỡng và tối ưu. Nuôi trồng lan hài cũng gặp không ít trở ngại do bộ rễ lan hài được bao phủ bởi một lớp vỏ lụa, đặc trưng là lớp biểu bì do vậy rất dễ thối, hỏng hoặc khó phát sinh rễ mới. Vì vậy việc lựa chọn giá thể trồng, dinh dưỡng và chế độ tưới cho cây cần nghiên cứu kỹ lưỡng. Để định hướng được công tác bảo tồn, phát triển lan hài của Việt Nam bền vững cần phải giải quyết những vấn đề tồn tại trên do đó việc nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đa dạng di truyền và nhân giống phục vụ công tác khôi phục nhanh nguồn
2 gen hài đang trong tình trạng bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên hoặc đang có nguy cơ cao và nghiên cứu lai tạo để tạo ra các tổ hợp lai có giá trị thương mại cao lan hài là cần thiết. Từ nhận thức trên đề tài luận án "Nghiên cứu đa dạng và Phát triển nguồn gen một số loài lan hài (Paphiopedilum) đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam" đã được thực hiện. 2. Mục tiêu của luận án Đánh giá đa dạng di truyền các loài hài của khu vực miền núi phía Bắc bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền các loài lan hài thu thập được làm cơ sở cho việc chọn tạo nguồn vật liệu di truyền tốt phục vụ cho nhân giống, bảo tồn và lai tạo, tạo tiền đề phát triển một số loài lan hài có giá trị phục vụ sản xuất và nhu cầu chơi hoa. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học Các kết quả nghiên cứu của đề tài luận án đã cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về các đặc điểm hình thái và phân nhóm theo các tính trạng đặc trưng và mức độ đa dạng di truyền làm cơ sở bảo tồn, phát triển và khai thác chúng một cách phù hợp. Các kết quả nghiên cứu có hệ thống từ việc thu thập, đánh giá đặc điểm, nhân giống và chọn tạo giống và lai tạo lan hài, là tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, đào tạo, bảo tồn và phát triển nguồn gen hài Việt Nam. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Góp phần thiết thực vào việc định hướng bảo tồn và phát triển loài hài ở Việt Nam nói chung và khu vực miền núi phía Bắc nói riêng. Dữ liệu về đặc điểm hình thái và phân tích đa dạng di truyền là cơ sở khoa học để đề xuất các hướng khai thác sử dụng hiệu quả nguồn gen hài Việt Nam hiện có. Tuyển chọn được hai loài lan hài có giá trị thẩm mỹ, dễ trồng, dễ chăm sóc, đã lai tạo được 9 tổ hợp lai và tái sinh được 03 dòng lai. Nhân giống được 2 loài hài (hài Việt Nam, hài Điểm Ngọc) phục vụ bảo tồn và phát triển sản xuất. 4. Những đóng góp mới của đề tài luận án 1. Là công trình nghiên cứu có hệ thống từ đặc điểm sinh thái học, đa dạng di truyền kiểu hình và kiểu gene tương đối đầy đủ cho các mẫu lan hài phân bố và trồng ở khu vực miền núi phía Bắc. 2. Chọn lọc và giới thiệu được 2 loài lan (hài Việt Nam, hài Điểm Ngọc) có giá trị thẩm mỹ (có hương, sắc) và đã bị và có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiênđưa vào nhân giống bảo tồn, phát triển bền vững. 3. Nhân giống in vitro thành công đối với lan hài Việt Nam (hài Bóng) bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên (phân hạng EW – sách đỏ Việt Nam, 2007) và tái sinh thành công 03 tổ hợp lai đưa vào theo dõi. 4. Nhân giống tách chồi thành công đối với hài Điểm Ngọc (hài Hương Lan) trong tình trạng nguy cấp (mức CR – sách đỏ Việt Nam, 2007). 5. Đề xuất được 9 cặp bố mẹ có tiềm năng và lai tạo, tạo được 03 tổ hợp lai. 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu đề tài 5.1. Đối tượng nghiên cứu Cây lan hài thu thập ở khu vực miền núi phía Bắc.
3 5.2. Phạm vi nghiên cứu Thu thập, Đánh giá đặc điểm hình thái đặc trưng và đa dạng di truyền của các loài lan hài đã thu thập được trong khu vực. Từ đó đề xuất các cặp bộ mẹ phục vụ công tác lai tạo. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến kết quả lai tạo lan hài. Đánh giá khả năng nhân giống hài Việt Nam, hài Điểm Ngọc và con lai có giá trị bằng phương pháp nhân giống in vitro và phương pháp tách chồi. 6. Bố cục của Luận án: Luận án gồm 140 trang: Mở đầu (03 trang). Tổng quan tài liệu nghiên cứu (29 trang). Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (22 trang). Kết quả nghiên cứu và thảo luận (77 trang). Kết luận và đề nghị (2 trang). Danh mục 4 công trình đã công bố (1 trang). Tài liệu tham khảo (7 trang). Luận án gồm 3 chương, 27 bảng biểu, 8 hình minh họa và 04 phụ lục. Luận án sử dụng 98 tài liệu tham khảo trong nước và trên thế giới. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan chung về lan hài 1.1.1. Phân loại lan hài Theo hệ thống phân loại, lan hài (Paphiopedilum) là một nhánh của họ lan (Orchidaceae) thuộc bộ lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), nghành hạt kín (Angiospermatophyta) Hoàng Thị Sản (2002)[26]. 1.1.2. Sự phân bố lan hài Các loài lan hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600 m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 700 - 2200 m. 1.1.3 Sự đa dạng của các loài lan hài 1.1.3.1. Sự đa dạng các loài lan hài trên thế giới Paphiopedilum bao gồm 50 loài lan sống trên cạn hoặc sống trên đá phân bố ở Himalaya, Trung Quốc, Đông Nam Á, Indonesia và New Guinea. Những loài lan này là loài lan cộng sinh không thân, giả hành với những chiếc lá hình elip – hình mác phát triển tốt ôm lấy gốc. Những bông hoa được sinh ra đơn lẻ hoặc trong một vài cụm hoa trên một cụm hoa ngắn đến dài. Cụm hoa cao 60 cm và thường có màu nâu tía. Các lá đài trên lưng đều khác biệt hai lá đài bên hợp nhất để tạo thành một lá đài thẳng đứng. Các lá đài bên hẹp và dài với mép gợn sóng. Các cánh hoa vuông góc với các lá đài và đôi khi cong về phía môi. Ở các chi này, về tổng thể, hình dạng của lá, nhị và cánh hoa, chiều rộng cánh hoa và số lượng hoa trên mỗi chùm hoa cho thấy tính bảo thủ phát sinh gen mạnh mẽ và sự thay đổi tiến hóa rõ rệt [Zhang và cs, 2016] [98]. 1.1.3.2. Sự đa dạng các loài lan hài ở Việt Nam Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam là quốc gia được đánh giá có sự đa dạng sinh học phong phú và là cái nôi của rất nhiều loại lan đặc trưng trong đó có lan hài (Paphiopedilum) là một chi lan rất đẹp và quý hiếm. Việt Nam là nước có sự đa dạng về lan hài lớn nhất thế giới với 26 trên tổng số khoảng 80 loài, trong đó có nhiều loài đặc hữu, trước tiên phải kể đến hài Việt Nam (P. vietnamese), tiếp đó là các loài hài đỏ (P.delenatii); hài vàng (P.villosum); lan hài tía (P.purpurathum); hài
4 trắng (P.emersonii); hài Vân (P.callosum); hài Vân duyên (P.amabile); hài Đốm (P.concolor), hài Lông (P.hirsutissimum); hài Râu (P.parishii)…(Nguyễn Tến Bân, 1990) [2]. Lan hài Việt Nam phân bố ở cả 2 miền Nam và Bắc, thời điểm nở hoa lại rải rác trong năm (Vũ Thị Huyền Trang và cs., 2019) [34]. 1.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài trên thế giới và Việt Nam Đa dạng di truyền của sinh vật là một đặc tính của sinh vật. Sự đa dạng về kiểu hình do tính đa hình về kiểu gen quy định và có sự tương tác giữa kiểu gen với môi trường. Biểu hiện của tính đa dạng di truyền ở sinh vật thể hiện ở các mức độ khác nhau: Đa dạng về kiểu hình biểu hiện ở các tính trạng hình thái và đa dạng về tính trạng số lượng. 1.2.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài trên thế giới Trong số các chi lan hài, chi Paphiopedilum được nghiên cứu và truy tìm nhiều nhất. Điểm đặc biệt của chi này là rất nhiều loài có màu sắc lá, thân rất giống nhau, gây nhầm lẫn cho người sưu tầm do đó trong nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cũng như xác định loài một cách chính xác thì việc sử dụng các phương pháp sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền đã được ứng dụng triệt để. Khi sử dụng đặc điểm hình thái để phân loại họ lan nói chung và lan hài nói riêng thì cấu trúc hoa là tiêu chí xác định loài chính xác nhất (De và cs, 2019 47]); (Tsiftsis, 2016) 89]; (Zhang và cs, 2016) [98], bởi vì hoa có đặc điểm rất riêng biệt, đặc trưng từ màu sắc đến tạo hình, ngay cả các loài rất gần gũi trong chi (Cribb, 1987; Cribb, 1998) [42,43]. 1.2.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài ở Việt Nam Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền cho các loài lan hài ở Việt Nam chưa nhiều, phần lớn mới chỉ nghiên cứu về mặt hình thái, trong khi đó đây là đặc điểm rất khó để đánh giá chính xác được loài vì mức độ tương đồng về hình thái rất cao. Do đó, việc thực hiện đề tài để đánh giá được đa dạng di truyền của các loài lan hài bằng chỉ thị phân tử là cần thiết, giúp cho việc xác định chính xác loài, làm cơ sở cho việc nghiên cứu chọn tạo giống, cũng như các biện pháp kỹ thuật trong phát triển lan hài cho khu vực miền núi phía bắc. Phan Kế Long và cs, năm 2010 [69] đã nhận diện một số loài lan Hài đặc hữu của Việt Nam và đã nghiên cứu mối liên hệ với các loài lan trên thế giới dựa trên vùng ITS để bảo tồn bền vững các loài lan có nguy cơ tuyệt chủng. Kết quả phân tích cho thấy, vùng ITS-rDNA của 5 loài hài Việt Nam dao động 659- 700 bp. Hai mẫu P.villosum lấy từ hai cây riêng biệt hoàn toàn không có sự khác nhau. Chiều dài ITS của các mẫu ở Việt Nam khá giống với trình tự đã được công bố trên Genbank. Khi nghiên cứu đa dạng di truyền loài lan hài Đốm (P.concolor) bản địa của Việt Nam (2009), tác giả Khuất Hữu Trung và cộng sự đã nhậnxét: Loài lan hài Đốm (P.concolor) bản địa của Việt Nam rất đa dạng và phong phú. Các mẫu giống thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau đều có các đặc điểm đặc trưng riêng về hình thái. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD-PCR chỉ ra hệ số tương đồng di truyền của các mẫu hài Đốm dao động từ 0,56 đến 0,94; 16 mẫu lan hài Đốm nghiên cứu được phân thành 6 nhóm khác nhau. Năm 2010, Nguyễn Thị Mỹ Duyên và cs đã nghiên cứu phả hệ các chi, loài lan (Orchidaceae) dựa trên phân tích các vùng trình tự ITS, kết quả cho thấy 5 loài lan hài P.delenatii, P.concolor, P.paishii, P.hirsutissimum, P.primulium có quan hệ họ hàng xa về phân tích kiểu gen, mặc dù về hình thái chúng được xếp cùng một nhóm [8]. Khuất Hữu Trung và cs cũng đã sử dụng trình tự vùng ITS (gồm ITS1, 5.8 S, ITS2) để phân biệt 16 loài và 2 thứ dưới loài của chi Paphiopedilum Việt Nam. Nghiên cứu kết luận rằng, các vùng có độ biến thiên cao ở
5 vùng ITS rất hữu ích cho việc phân tích phát sinh loài. Như vậy có nhiều vùng trình tự được sử dụng trên các đối tượng khác nhau của hoa lan [34]. Nguyễn Thị Hải Yến và cs, (2020) [37] tách chiết DNA tổng số theo phương pháp dùng CTAB (Collins & Symons, 1992) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm tại Việt Nam để nhận dạng lan hài Hằng (P.hangianum) của Việt Nam. Kết quả phân tích dựa vào trình tự gen rbcL đã chỉ ra sự sai khác giữa các loài lan Hài khác nhau. 1.3. Đặc điểm lan hài 1.3.1. Đặc điểm hình thái của lan hài Theo Trần Hợp (1990) [12], các loài lan hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có hình dạng bên ngoài rất đa dạng, chúng mang những đặc điểm hình thái chung sau: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn. Thân chính là loại thân rễ nằm ngang, thông thường nằm ở dưới lớp đất, có nhiệm vụ đỡ cho các lá, từ đó các rễ phát triển theo nhiều ngang và dọc. Thân thường mang trên nó một số lượng lá không đổi, sau khi đã đạt đến độ trưởng thành sẽ hình thành một chồi hoa. - Rễ: Rễ chùm, có một lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn ánh sáng mạnh. Sau khi rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnc. Rễ xanh quanh năm được bao phụ bởi một lớp vỏ làm cho rễ có khả năng hấp thụ độ ẩm trong không khí. - Lá: Thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. - Cụm hoa: Thường thẳng đứng hay cong, cuống hoa nằm ngang hay chúc xuống, P. villosum phụ sinh thường có cuống hoa nằm ngang hoặc chúc xuống, nhưng ở loài P.malipoense, P.micranthum và P.appletonianum) cuống hoa thẳng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Nhưng ở loài P.delenatii và P.concolor, điều kiện thuận lợi lại phát triển thành cụm hoa có từ 2 hoa trở lên. Cuống hoa có thể lông tơ dầy, ngắn hoặc nhẵn. Cụm hoa có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo, hình trứng, chóp nhọn hoặc bầu dục tròn. - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của cánh môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều có lông tơ dày ở mặt ngoài. Hai cánh hoa bên thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài. - Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Qủa mở ở gần đỉnh bằng rãnh nứt. Qủa thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng.
6 - Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn, dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 - 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 - 0,4 mm. Hạt không có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên. Hạt lan chín rất nhẹ và dễ dàng phát tán nhờ gió do hạt không có nội nhũ, nên phải sống cộng sinh với một loài nấm rễ. Qua kết quả cho thấy những thông tin cơ bản về đặc điểm hình thái lan hài đã được nghiên cứu đánh giá, nhưng trong thực tế mỗi loài lan hài khác nhau và sinh trưởng phát triển ở mỗi khu vực địa lý khác nhau đều có những đặc trưng riêng cho từng loài, do đó việc nghiên cứu đánh giá đặc điểm hình thái cho từng loài là cần thiết, làm cơ sở cho việc đánh giá và định danh, cũng như đưa các biện pháp kỹ thuật phù hợp cho từng loài lan hài nhằm nâng cao hiệu quả trong nghiên cứu và phát triển những giống lan hài quý hiếm cho khu vực miền núi phía bắc Việt Nam. 1.3.2. Đặc điểm sinh thái lan hài Tại Việt Nam, lan hài thường phân bố ở vùng có lươṇg mưa lớn, ẩm độ cao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiêṇ lá dày, dai và moṇg nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và đô ̣pH, sự có măṭ của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan troṇg trong sự hình thành và phát triển của quần thể lan hài (Averyanov và cs, 2008) [1]. 1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài trên thế giới Hiện nay tình hình sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ và đã trở thành một ngành thương mại có lợi cho nền kinh tế các nước trồng và xuất khẩu hoa. Diện tích trồng hoa trên thế giới ngày được mở rộng và không ngừng tăng lên, nhiều tạp chí về hoa lan được xuất bản, nhiều cuộc hội thảo về lan đã được tổ chức. Trước đây việc nuôi trồng và xuất khẩu chủ yếu là lan rừng nên nguy cơ khoảng 13 loài tuyệt chủng, ngày nay việc trồng lan dần theo quy mô công nghiệp, việc xuất khẩu lan đã đạt tới số lượng hàng trăm ngàn giò, hàng vạn cành lan trong một năm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường. 1.4.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài ở Việt Nam Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm rất thuận lợi cho việc trồng hoa, cây cảnh. Tuy nhiên chưa được đầu tư thích đáng nên ngành trồng hoa nói chung và ngành trồng lan nói riêng vẫn chưa thực sự phát triển, sản xuất lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh phía Nam, đặc biệt là Đà Lạt và thành phố Hồ Chí Minh. Từ các nghiên cứu trên cho thấy, sản xuất, kinh doanh, lan hài ở Việt Nam từ trước đến nay vẫn ở dạng tiềm năng, có khả năng cạnh tranh trên thị trường quốc tế. Những hoạt động kinh doanh và xuất khẩu lan hài trong thời gian qua chỉ mới có ý nghĩa khởi động, hứa hẹn một sự phát triển trong tương lai cũng như tạo thêm việc làm cho người dân trong khu vực. Nâng kim ngạch xuất khẩu hoa lan ngang tầm với các quốc gia trong khu vực. 1.5. Nghiên cứu hiện trạng và các giải pháp nhằm mục đích bảo tồn lan hài trên thế giới và ở Việt Nam Trên thế giới nhiều loài lan đang có nguy cơ tuyệt chủng, hiếm và được liệt kê trong phụ lục II của CITES, do nhiều nguyên nhân như biến đổi khí hậu, khai thác quá
7 mức, buôn bán bất hợp pháp và lấn chiếm đất đai. Hoa lan được biết đến như là cây cảnh quan trọng ở Việt Nam, đặc biệt là lan hài. Các loài lan hài của Việt Nam nổi tiếng với vẻ đẹp và sự đa dạng đang có nhu cầu sử dụng làm cảnh cao trên toàn thế giới. Do đó cần có các biện pháp kỹ thuật để nhân giống, bảo tồn và phát triển lan hài có giá trị của Việt Nam. 1.5.1. Hiện trạng và các giải pháp bảo tồn lan hài trên thế giới Chi lan hài (Paphiopedilum) có khoảng 75 loài. Tuy nhiên đây là loài mà công tác điều tra, thu thập, bảo tồn nguồn gen lan hài trên thế giới đã được quan tâm nghiên cứu bởi nhiều tổ chức, cá nhân và chính phủ các nước. Đầu tiên phải kể đến tổ chức CITES đưa ra Công ước về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp (CITES) là Hiệp định giữa các chính phủ, được thiết lập nhằm mục tiêu kiểm soát hoạt động buôn bán quốc tế mẫu vật của các loài động, thực vật hoang dã một cách bền vững, đảm bảo rằng hoạt động này không làm ảnh hưởng đến sự tồn vong của loài trong tự nhiên. Công ước này ra đời đã góp phần giảm thiểu sự buôn bán các loài lan hài bất hợp pháp. 1.5.2. Hiện trạng và giải pháp bảo tồn lan hài ở Việt Nam Việt Nam nằm trong khu vực châu Á nhiệt đới - nơi phát sinh một trong nhiều loài phong lan quý hiếm trên thế giới. Việt Nam nằm trong số 25 quốc gia hàng đầu trên thế giới về đa dạng sinh học, trong đó có đa dạng các loài lan. Theo đánh giá của Averyanov Việt Nam có 158 chi và khoảng 900 loài. Theo tác giả Trần Duy Quý và cs Việt Nam đã thống kê và phát hiện ở Việt Nam có 160 chi và 1004 loài lan. Đây là quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật và đặc biệt là họ lan phong phú bậc nhất trong khu vực Châu Á.. Mặc dù chính phủ Việt Nam ra nhiều chiến lược biện pháp như thành lập các mạng lưới bảo tồn các loài lan hài, nghiêm cấm khai thác và buôn bán lan hài nhưng hầu hết các loài lan hài của Việt Nam vẫn đang trong tình trạng nguy cấp và tuyệt chủng ngoài tự nhiên như: hài Việt (P.vietnamense), hài mốc vàng (P.armeniacum), hài Mốc hồng (P.micranthum), hài Điểm Ngọc (P. emersonii). (The IUCN, 2019 và Phụ lục 1 của công ước CITES và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm1) Nghị định số 06/2019/NĐ-CP, Nghị định của Chính phủ, ngày 22/01/2019). Do đó việc bảo tồn các loài lan hài Việt Nam cần phải đồng bộ và thực hiện nhanh biện pháp nhân giống khẩn cấp đối với các loài lan hài có giá trị, loài đặc hữu của Việt Nam như hài Việt Nam (hài Bóng), hài Điểm Ngọc (hài Hương Lan). 1.5.3. Nghiên cứu về khả năng nhân giống lan hai trên thế giới và ở Việt Nam 1.5.3.1. Nghiên cứu nhân giống lan hài trên thế giới Việc nhân giống lan hài cũng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Cây lan hài được trồng từ nguồn giống được nhân theo các phương pháp nhân giống như tách chồi, gieo hạt bằng phương pháp in vitro. 1.5.3.2. Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài ở Việt Nam * Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hài Ngoài phương pháp gieo hạt trong tự nhiên, chi lan Paphiopedilum thường được nhân giống qua sự phân chia chồi nách từ cây mẹ và nhân giống bằng phương pháp in vitro. 1.6. Các kết luận qua phân tích tổng quan Như vậy, để có cơ sở cho công tác bảo tồn và chọn lọc nguồn nguyên liệu làm giống để phát triển nguồn gen làm hoa cảnh thì việc đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen lan hài là thực sự cần thiết.
8 Từ các phân tích đánh giá tổng quan cho thấy, lan hài thuộc chi Paphiopedilum là loài lan rừng đẹp của Việt Nam, có giá trị thương mại cao, có tiềm năng phát triển ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Lan hài hiện nay đã bị suy giảm nghiêm trọng, đang bị đe dọa do bị khai thác để bán làm cây cảnh và nạn chặt phá rừng hủy hoại nơi cư trú của cây. Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới chỉ đề cập về nhân giống in vitro của một số loài lan hài trong tình trạng cạn kiệt. Còn ở Việt Nam chưa có các đánh giá về đặc điểm hình thái, cấu tạo rễ, thân, lá, hoa cũng như việc nhân giống phục vụ bảo tồn lan hài Việt Nam và lan hài Điểm Ngọc. Để có thể phát triển và đáp ứng nhu cầu tiêu dùng cần có hướng nghiên cứu một cách có hệ thống về đặc điểm sinh học, khả năng nhân giống loài lan quý này của Việt Nam. Không chỉ làm đẹp cảnh quan môi trường, tăng thu nhập cho người trồng hoa mà còn bổ sung vào trong kho tàng cây bản địa có giá trị của Việt Nam. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu thực vật - Nguồn vật liệu sử dụng trong nghiên cứu đánh giá đặc điểm hình thái và đánh giá đa dạng di truyền gồm 23 mẫu hài Việt Nam khu vực miền núi phía Bắc. Vật liệu thu thập là cây trưởng thành, đang giai đoạn cho hoa và chuẩn bị cho hoa, không bị sâu bệnh, lá còn nguyên vẹn, không bị dập, gẫy. 2.1.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất sử dụng nhân giống in vitro - Hoá chất khử trùng: cồn 70°, oxi già (H2O2), HgCl2. - Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) , WPM, B5 cơ bản, Knudson cơ bản, Phong lan cơ bản. ngoài ra còn một số thành phần bổ sung như: Đường sacharose, agar, than hoạt tính... - Một số chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin (NAA, IAA, IBA...), nhóm cytokinin (BA, Kinentin,TDZ), Giberrelin (GA3). 2.1.2.2. Hóa chất đánh giá đa dạng di truyền Một số hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck,...CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymeraza, Ethanol, 2-propanol, Acetic acid glacial, Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, Agarose, Cặp mồi ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC) (Vilgalys R và cộng sự, 1994). 2.1.2.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Thiết bị sử dụng trong quá trình thực hiện (cân phân tích, máy khuấy từ, máy đo pH, lò vi sóng, nồi hấp vô trùng, tủ sấy, hệ thống giàn đèn, máy cất nước, box cấy vô trùng). Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu (Pank cấy, Dao kéo, Đèn cồn, cốc đong, ống đong, bình tam giác, đĩa hạt đậu, đĩa peptri, chun nịt, túi nilon, giấy thấm). Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí nghiệm
9 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Đánh giá một số đặc điểm thực vật học của các loài lan hài thu thập ở khu vực miền núi phía Bắc - Thu thập nguồn gen các loài lan hài được trồng và phân bố tại các khu vực miền núi phía Bắc. - Đánh giá đặc điểm hình thái nguồn gen các loài lan hài được trồng và phân bố tại các khu vực miền núi phía Bắc. - Đánh giá, xác định một số loài lan hài có triển vọng, có tiềm năng phát triển đề xuất hướng bảo tồn và phát triển. 2.2.2. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen các loài hài khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam - Đánh giá đa dạng di truyền các loài hài khu vực miền núi phía Bắc dựa vào kiểu hình. - Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen các loài hài khu vực miền núi phía Bắc dựa vào chỉ thị phân tử. 2.2.3. Đánh giá khả năng lai tạo của một số tổ hợp có tiềm năng nhằm tạo ra dòng hài có triển vọng - Xác định nguồn gen ưu tú để thiết lập các cặp bố mẹ phục vụ công tác lai tạo - Đánh giá khả năng lai tạo của các tổ hợp lai. 2.2.4. Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống đối với một số loài hài có giá trị và đánh giá khả năng tái sinh của con lai - Nghiên cứu khả năng nhân giống bằng phương pháp in vitro đối với hài Việt Nam (Paphiopedilum vietnamese) và sản phẩm lai. - Nghiên cứu khả năng nhân giống bằng phương pháp tách chồi/ mầm đối với hài Điểm Ngọc (Paphiopedilum callosum). 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Thu thập nguồn gen các loài lan hài được trồng và phân bố tại các khu vực miền núi phía Bắc Phương pháp thu thập áp dụng theo hướng dẫn của Viện Tài nguyên di truyền thực vật quốc tế (IPGRI, 2001) [59] nay là Tổ chức đa dạng sinh học quốc tế (BIOVERSITY). + Phương pháp bảo quản mẫu: Các loài lan hài được thu thập dưới dạng cây con được ký hiệu riêng và bảo quản trong các hộp giấy hoặc thùng xốp để giữ cho cây con không bị va đập dẫn đến dập nát làm hỏng mẫu rùi đưa về trồng và chăm sóc trong nhà lưới. 2.3.2. Phương pháp mô tả, đánh giá đặc điểm hình thái của các loài lan hài - Các mẫu giống được thu thập ở giai đoạn cây trưởng thành. Mô tả hình thái theo phương pháp nghiên cứu thực vật học (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007) [32] bao gồm các đặc điểm, thân, lá, hoa và cấu tạo hoa,… - Phân tích mẫu giống và định danh loài theo phương pháp so sánh hình thái về các đặc điểm: thân, lá, hoa và cấu tạo hoa,…dựa trên các tài liệu Phong lan Việt Nam (Trần Hợp, 1998) [12], Phương pháp nghiên cứu thực vật học (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007) [32], Thực vật chí Việt Nam (Dương Đức Huyến, 2007) [33] Lan Hài Việt Nam (Leonid Averyanov và cs, 2004) [40], phương pháp mô tả, đánh giá với 42 chỉ tiêu được xây dựng theo quy phạm khảo nghiệm DUS cho một số loài hoa [11].
10 2.3.3. Phương pháp sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình- Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái * Phương pháp UPOV 2.3.4. Các phương pháp sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị phân tử * Tách chiết ADN tổng số Trong nghiên cứu này, đã chọn phương pháp sử dụng CTAB của P. Doyle and Doyle (1990) [51] với một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết ADN từ các mẫu nghiên cứu. * Giải trình tự Sản phẩm PCR ITS sau khi được tinh sạch, được giải trình tự tại công ty Apical Scientific (Malaysia). Kết quả giải trình tự được được so sánh với các trình tự tương đồng trên NCBI. Sau đó, các trình tự được tập hợp lại và phân tích bằng chương trình MEGA v6.06 để tạo cây phát sinh loài. 2.3.5. Phương pháp lai tạo lan hài 2.3.5.1. Phương pháp lai tạo và chọn lọc Phương pháp lai tạo lan hài dựa theo phương pháp của Dongarwar và Thakur [50]. 2.3.6. Phương pháp nghiên cứu nhân giống in vitro đối với lan hài Việt Nam và sản phẩm lai * Lựa chọn vật liệu khởi đầu Cây hài Việt Nam có màu sắc hoa đẹp, sinh trưởng phát triển tốt, cho hoa thường xuyên. Chúng tôi tiến hành thụ phấn cùng cây. Sau khi quả đậu sau 8 tháng tiến hành đưa vào nhân giống. * Phương pháp nhân giống in vitro đối với lan hài Nhân giống in vitro được thực hiện theo phương pháp vi nhân giống hoa lan của Arditti có cải tiến kết hợp tham khảo nghiên cứu của Hemanta [55]. - Các thí nghiệm nuôi cấy mô được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, nhiệt độ 25 ± 2oC, ẩm độ 70%, dưới ánh sáng đèn huỳnh quang với cường đô từ 2.400 – 3.000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/24 giờ. Môi trường nuôi cấy đưa về pH 5,8 được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,1 atm trong 30 phút. Các dụng cụ dao, kéo, đĩa cấy. 2.4. Điều kiện thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi 2.4.1. Các chỉ tiêu theo dõi + Các chỉ tiêu về rễ, thân, lá, hoa + Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro + Các chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển 2.4.2. Điều kiện thí nghiệm * Điều kiện nuôi cấy - Nhiệt độ phòng 25 ± 20C, ẩm độ 60-70%, thời gian chiếu sáng 16giờ/ngày, cường độ ánh sáng 1.500 - 2.300 lux. * Điều kiện trồng và chăm sóc - Duy trì nhiệt độ vườn ươm cây 13 – 18OC vào mùa đông; 26 – 34oC vào mùa hè. - Phòng trừ bệnh hại: phun định kỳ 10 ngày/lần bằng Antracol 70WP nồng độ 0,1%.
11 - Các loại phân bón lá, chất kích thích,...được phun vào buổi chiều mát, 1 giờ sau khi tưới nước để tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng. 2.5. Phương pháp xử lý số liệu * Đánh giá đa dạng di truyền - Số liệu nghiên cứu được phân tích, xử lý dựa trên các phần mềm Excel version 5.0, chương trình thống kê cho ngành sinh học. * Nhân giống in vitro, nhân giống tách chồi và nuôi trồng Sử dụng các phương pháp thống kê sinh học để phân tích các số liệu thí nghiệm bằng phần mềm (Excel, Irristat 5.0). CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập, đánh giá thực trạng và giá trị của các loài lan hài khu vực miền núi phía Bắc Lan Hài là một nhóm rất khác biệt. Chúng có thể dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ bề ngoài rất đặc sắc. Các loài Lan Hài thường rất ít gặp trong tự nhiên và thuộc vào nhóm quí hiếm. 3.1.1. Thu thập và đánh giá đặc điểm sinh thái nguồn gan các loài lan hài khu vực miền núi phía Bắc Sự đa dạng sinh học của các loài lan hài được thể hiện ở sự phong phú về hình dạng, kiểu dáng, kích thước và màu sắc của hoa và lá. Các mẫu giống lan hài được chia thành 2 nhóm (nhóm có vân đốm và nhóm lá xanh không có vân đốm). Nhóm lá xanh không có vân đốm trên lá chỉ thích hợp ở điều kiện lạnh, khó trồng hơn như (hài Râu, Đuôi công, Vệ nữ, hài Chân tím, hài Điểm Ngọc, hài Hằng, hài Râu, hài Henrry, hài Hellen, hài Lông, hài Đuôi Công … thường được trồng ở vùng núi cao như Tam Đảo, Sapa, Ba Bể, Mẫu Sơn… Nhóm lá có Vân đốm phân thành 2 loại loại: Loại dễ trồng, sinh trưởng và phát triển được ở nhiều vùng, nhiều điều kiện sinh thái khác nhau (hài Hồng, hài Vân Nam, hài Táo, hài Gấm, hài Giáp) có thể trồng vùng đồng bằng hoặc vùng. Loại khó trồng (hài Việt Nam, hài Mạng đỏ tía, hài Mốc vàng). 3.1.2. Tình hình khai thác, sử dụng và nuôi trồng Hiện nay các loài lan hài đang bị săn tìm, thu hái cung cấp cho các "thị trường đen" quốc tế, khiến số lượng hài bị suy giảm nhanh chóng, dẫn đến một số loài đã và đang mất dần ngoài tự nhiên... Việc thu hái tự nhiên không có kiểm soát cũng đã khiến ít nhất một nửa số loài hài gần như tuyệt chủng. Một điều nghịch lý trong khi các loài hài Việt Nam khó có thể tìm thấy trong tự nhiên do sự khai thác cạn kiệt và nạn phá rừng nhưng lại xuất hiện với số lượng lớn ở thị trường nước ngoài. Tại các vùng đệm ở vườn quốc gia, lan hài cũng bị người dân bản địa khai thác một cách triệt để, nhằm phục vụ nhu cầu thưởng ngoạn, chơi hoa cây cảnh. Hình thức khai thác chủ yếu là đào hoặc đánh nguyên cả khóm cây về trồng. * Kiến thức nuôi trồng bản địa và phương thức nhân giống Lan hài sau khi khai thác từ rừng về được người dân trồng theo kinh nghiệm cá nhân, hầu như chưa nắm rõ yêu cầu ngoại cảnh, yêu cầu sinh lý của cây để có các biện pháp kỹ thuật phù hợp, nên tỷ lệ sống, tỷ lệ nở hoa thấp dẫn đến hiệu quả kinh tế chưa
12 cao. Để tránh không phải duy trì, chăm sóc và thu được lợi nhuận ngay, người dân sau khi khai thác về, hài thường được bán nguyên cây hoặc nguyên khóm ra thị trường. 3.1.3. Khả năng bảo tồn và phát triển Toàn bộ chi lan hài Paphiopedilum Pfitzer ở Việt Nam đều được đưa vào sách đỏ và Công ước quốc tế (CITES), bởi các loài thuộc chi này có ý nghĩa rất lớn trong lĩnh vực thương mại, trước hết là giá trị làm cảnh, do có hương thơm, màu sắc rất đẹp và đặc biệt là lâu tàn, nên được thị trường trong nước và thế giới rất ưa chuộng. Để bảo tồn và phát triển cần có biện pháp thu thập lưu giữ, xây dựng các kỹ thuật nhân giống, trồng và chăm sóc phù hợp, đặc biệt sử dụng phương pháp chon tạo giống truyền thống kết hợp với công nghệ sinh học để tạo các giống thương mại có giá trị kinh tế cao, thích nghi với điều kiện sản xuất, có khả năng chống chịu cao, đẻ nhánh khỏe, ít nhiễm bệnh, cành cứng, hoa to, bền, màu sắc tươi đậm. 3.2. Đánh giá đặc điểm hình thái và đa dạng di truyền các loài lan hài phân bố và trồng khu vực miền núi phía Bắc 3.2.1. Đánh giá đặc điểm hình thái các loài lan hài phân bố và trồng khu vực miền núi phía Bắc 3.2.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái đặc trưng lá Đánh giá các đặc trưng hình thái của các giống lan hài bản địa, cho thấy các giống trong nghiên cứu đều có thân rất ngắn, hầu như không nhìn thấy thân (hài Kim) hoặc thân gần như chìm dưới đất (hài Vệ nữ), thân đều mập và khỏe. Bộ rễ của các giống lan hài đều khỏe, có nhiều lông tơ nên lan hài có thể sống được ở các vùng núi cao, bám vào vách đá... 3.2.1.2. Đánh giá đặc điểm đặc trưng hình thái thân, rễ và khả năng thích nghi của các loài lan hài phân bố và nuôi trồng ở khu vực miền núi phía Bắc + Kích cỡ cây: Đây là tính trạng thể hiện sức sống, sức sinh trưởng và khả năng thích nghi của cây. Các loài lan hài của Việt Nam biểu hiện ở 3 nhóm kích cỡ cây: Cây to (hài Hằng, hài Râu, hài Giáp, hài Điểm Ngọc), cây nhỡ (hài Việt Nam, hài Hồng, hài Jacki, hài Gấm, hài Đuôi Công, hài Vân Bắc, hài Vân Nam...) và cây nhỏ (hài mốc vàng, hài hellen, hài mạng đỏ tía) + Lan hài không chỉ chơi hoa, bộ lá của lan hài cũng được nhiều người kiếm tìm những bộ lá đẹp, bộ lá có vân,...Lá lan hài biểu hiện ở nhiều màu sắc khác nhau: Lá có đốm, lá giáp, lá trơn không đốm. Nhóm thích nghi với khí hậu mát mẻ và phân bố ở độ cao trên 1000m thường là các loài không có vân ở lá: hài Kim, hài Vệ nữ, hài Râu, hài Hằng, hài Điểm Ngọc, hài hellen, hài đều thuộc loài không có vân ở lá. 3.2.1.3. Đánh giá đặc điểm đặc trưng hình thái hoa - Về thời gian xuất hiện ngồng hoa và thời gian nở hoa ở các loài lan hài có sự khác nhau. Hài Kim, hài mạng đỏ tía, hài hồng, hài Trần liên thường xuất hiện ngồng hoa và nở hoa vào dịp cuối năm khi thời tiết lạnh (từ tháng 10-tháng 1) đây là nhóm lan hài thường nở hoa vào dịp Tết. Hài Điểm Ngọc, hài Hằng, hài Việt Nam, hài Gấm thường xuất hiện ngồng hoa và nở hoa vào tháng 3,4,5; hài Râu, hài Jacki, hài Giáp, hài Xanh vào cuối hè và đầu thu (tháng 5,6,7,8). Trong khi đó hài Táo, hài Vân Nam, Vân Bắc, hài Henry, hài Đuôi Công có thời gian dài từ 7 -10). - Chiều dài ngồng hoa phân làm 3 loại: Dài (Mạng đỏ tía, hài Râu, hài Táo, hài Mốc vàng, hài Xanh, Hài Jacki), trung bình (Hài Việt Nam, hài Việt Nam nuôi cấy mô, hài Hồng, hài Điểm Ngọc, hài Hằng, Hài Đuôi Công, hài Kim (Lai Châu), hài Vân Nam
13 (Hà Giang), hài Vân Nam (Tuyên Quang), hài Lông, hài Kim (Lai Châu)) và ngắn (Hài Điểm Ngọc, hài Hellen, hài Gấm, hài Hecmani, hài Henry). - Kích thước hoa phân làm 3 dạng: Hoa to (Hài Việt Nam, hài Việt Nam nuôi cấy mô, hài Điểm Ngọc, hài Hằng, hài Jacki, hài Xanh, hài Mạng đỏ tía), trung bình (Hài Chân Tím, hài Đuôi Công, hài Kim (Lai Châu), hài Gấm, hài Lông, hài Hecmani, hài Henrry, hài Hellen, hài Hồng, hài Henrry, hài mốc vàng, hài Vân Bắc, hài Vân Nam Hà Giang + Tuyên Quang.) và hoa nhỏ có hài Hellen. - Màu sắc hoa lan hài rất đa dạng từ màu trắng, vàng, hồng, nâu, xanh, ... - Hương thơm : Lan hài phân thành 2 nhóm: nhóm lan hài có hương thơm (ít) gồm có lan hài Hồng, hài Điểm Ngọc, hài Hằng. Còn lại là các loài lan hài không có hương thơm. 3.2.2. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen các loài lan hài phân bố và nuôi trồng tại khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam Trong công tác bảo tồn, chọn tạo giống cây trồng việc đánh giá đa dạng di truyền là cần thiết. Nó xác định chính xác tên loài, xác định khả năng sinh sản duy trì lòi giống của loài, xác định việc lựa chọn chính xác cặp bố mẹ phụ thuộc công tác lai tạo. 3.2.2.1. Đánh giá đa dạng di truyền các loài lan hài phân bố và trồng ở khu vực miền núi phía Bắc dựa vào kiểu hình Tiến hành phân tích quan hệ di truyền dựa trên các đặc điểm tính trạng hình thái của tập đoàn 23 loài hài bằng phần mềm NTSYS pc 2.10. Dựa vào kết quả phân loại cho thấy 23 loài phân thành 2 nhóm chính với hệ số tương đồng tương cao và dao động trong khoảng 0,00 đến 9,94. * Nhóm I: Gồm 6 loài hài và được chia thành 2 phân nhóm bậc 1 như sau: + Phân nhóm Ia: Gồm 2 loài: hài Hecman H1 và hài Henry H13. Khoảng cách tương đồng giữa 2 loài này ở mức cao, đạt 0,37. Tức là, gần như không có sự khác nhau về các đặc điểm tính trạng hình thái giữa 2 loài. Ia Hài Hecman H1 Hài Henry H13 I Hài Kim Lai Châu H2 Nhóm I Hài Đuôi công H9 Ib Hài Chân tím H17 Hài Lông H10 Hài Việt Nam (rừng) H3 Hài Việt Nam (Cao Bằng) Hài Hồng H5 IIa1 Hài Gấm H19 Hài Mốc vàng H4 IIa Hài Mạng đỏ tía H23 Hài Vân Nam TQ H6 Hài Vân Nam Kon Tum H14 IIa2 Nhóm II Hài Vân bắc H15 II Hài Táo H8 Hài Hằng H7 Hài Điểm Ngọc H18 IIb1 Hài Xoắn H21 IIb Hài Jacki H12 Hài Giáp H16 IIb2 Hài Hellen H11 0.34 0.26 0.17 0.09 0.00 Coefficient Hình 3.2. Sơ đồ cây phân nhóm các loài lan hài dựa trên các đặc điểm hình thái bằng phần mềm NTSYS pc 2.10
14 + Phân nhóm Ib: Gồm 4 loài: hài Kim Lai Châu H2, hài Đuôi công H9, hài Lông H10 và hài Chân tím H17. Khoảng cách tương đồng giữa các loài trong nhóm dao động trong khoảng từ 1,03 – 8,72. Trong đó, mức độ tương đồng cao nhất là giữa 2 loài: hài Đuôi công H9 và hài Lông H10 (1,03). Bên cạnh đó, hai loài hài Kim Lai Châu H2 và hài Chân tím H17 có khoảng cách tương đồng tương đối xa, đạt 8,72. * Nhóm II: Bao gồm 16 loài lan hài còn lại. Khoảng cách tương đồng giữa các loài trong nhóm dao động từ 0,00 đến 9,94 và được chia thành 2 phân nhóm bậc 1: + Phân nhóm IIa: Gồm 10 loài hài và được chia thành 2 phân nhóm bậc 2: Phân nhóm IIa1: Gồm 6 loài lan hài: hài Việt Nam (rừng) H3, hài Mốc vàng H4, hài Hồng H5, hài Gấm H19 và hài Mạng đỏ tía H23. Hệ số tương đồng dao động từ 0,00 đến 9,94. loài hài Việt Nam (rừng) H3 và hài Việt Nam (Cao Bằng) có hệ số tương đồng là 0,00. Hai loài hài Mốc vàng H4 và hài Hồng H5 có hệ số tương đồng xa nhất (9,94), gần như không có sự tương đồng về mặt hình thái giữa hai loài lan Hài này. Phân nhóm IIa2: Gồm 4 loài: hài Vân Nam Trung Quốc H6, hài Táo H8, hài Vân Nam Kon Tum H14 và hài Vân Bắc H15. Hệ số tương đồng giữa các loài hài trong nhóm ở mức trung bình và dao động trong khoảng từ 1.67 đến 5,61. Mức độ tương đồng cao nhất là giữa 2 loài: hài Nam Kon Tum H14 và hài Vân Bắc H15 (đạt 1,67); Mức độ tương đồng thấp nhất là giữa 2 loài hài Táo H8 và hài Vân Bắc H15 (đạt 5,61). + Phân nhóm IIb: Gồm 6 loài lan Hài và được chia thành 2 phân nhóm bậc 2: Phân nhóm IIb1: Gồm 5 loài: hài Hằng H7, hài Jacki H12, Hài Giáp H16, hài Điểm Ngọc H18 và hài Xoắn H21. Hệ số tương đồng giữa các loài trong nhóm dao động từ 1,05 đến 9,97. Phân nhóm IIb2: Phân nhóm này chỉ bao gồm loài hài Hellen H11, hệ số tương đồng giữa loài này với cái loài lan hài ở phân nhóm IIb thấp, dao động từ 1,49 đến 2,99. Hệ số tương đồng giữa loài này so với 21 loài hài còn lại trong nghiên cứu cũng thấp, dao động từ 1,49 đến 3,66. 3.2.2.2. Đánh giá đa dạng di truyền các loài lan hài phân bố và trồng ở khu vực miền núi phía Bắc dựa vào chỉ thị phân tử Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi ITS1/ITS4, kết quả thu được 23 mẫu giống lan hài đều cho băng đơn hình với kích thước 700 bp (hình 3.3). Hình 3.3. Kết quả PCR 23 mẫu giống lan hài nghiên cứu với cặp mồi ITS1/ITS4 M: Marker 100bp ladder
15 Kết quả phân tích 23 mẫu lan hài cho thấy: Sản phẩm PCR là các băng có kích thước nằm trong khoảng 677 – 740 bp. Tại mỗi locut, kích thước các alen thu được biến thiên trong phạm vi 4 bp. Kết quả thống kê hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 23 mẫu giống lan hài với các mẫu tham chiếu cho thấy 23 mẫu giống lan hài và 20 mẫu giống tham chiếu được chia thành 4 nhóm chính: * Nhóm thứ nhất gồm 11 mẫu giống lan hài và 10 mẫu giống tham chiếu được chia thành 4 phân nhóm phụ. - Phân nhóm phụ 1.1 gồm 6 mẫu giống lan hài là H16, H12, H4, H23, H18 và H7 với 6 mẫu giống tham chiếu. Sáu mẫu giống này có mức tương đồng về trình tự nucleotide dao động từ 79,4% (giữa mẫu giống H12 và H18) đến 94,9% (giữa mẫu giống H7 và H23). Trong đó mẫu giống H16 - hài Xanh có mức tương đồng về trình tự nucleotide cao nhất với mẫu giống tham chiếu JQ929336.1 P.malipoense (98.9%). Mẫu giống H12 - hài Jacki có mức tương đồng về trình tự nucleotide cao nhất với mẫu giống tham chiếu MH550872.1_P.jackii (97.6%). Tương tự mẫu giống H4 – hài Mốc vàng có mức tương đồng về trình tự nucleotide cao nhất với mẫu giống tham chiếu AY643431.1_P.armeniacum (99.2%). Mẫu giống H23 - lan hài Mốc hồng có mức tương đồng về trình tự nucleotide cao nhất với mẫu giống tham chiếu KX931039.1 P.micranthum (99.7%). Mẫu giống H18 - hài Điểm Ngọc có mức tương đồng về trình tự nucleotide cao nhất với mẫu giống tham chiếu MH550877.1 P.emersonii (99.5%). Mẫu giống H7 - hài Hằng có mức tương đồng về trình tự nucleotide cao nhất với mẫu giống tham chiếu MH550873.1_P.hangianum (99.5%). - Phân nhóm phụ 1.2 gồm duy nhất mẫu giống H5 - hài Hồng tương đồng 99.3% về trình tự nucleotide với mẫu giống tham chiếu JQ929314.1 P.delenatii. - Phân nhóm phụ 1.3 gồm 3 mẫu giống H3, H20 và H22 có mức tương đồng về trình tự nucleotide với nhau rất cao là 98.5% (giữa mẫu giống H3 và H22) và 99% (giữa mẫu giống H3 và H20). Ba mẫu giống này có mức tương đồng về trình tự nucleotide với 2 mẫu giống tham chiếu P.vietnamense là 99,1% (giữa mẫu H3 - lan hài Việt Nam nuôi cấy mô và mẫu tham chiếu MH550870.1 P.vietnamense); 99,2% (giữa mẫu H20 - con hài Việt Nam x hài Hồng và mẫu tham chiếu MH550871.1 P.vietnamense) và 99.8% (giữa mẫu H22 - lan hài Bóng thu thập từ rừng và mẫu tham chiếu MH550870.1 P.vietnamense). - Phân nhóm phụ 1.4 gồm duy nhất mẫu giống H21 - hài Râu tương đồng 99.5% về trình tự nucleotide với mẫu giống tham chiếu MK161269.1_Paphiopedilum_dianthum. * Nhóm thứ hai gồm 7 mẫu giống H10, H2, H9, H11, H17, H1, H13 và 6 mẫu giống tham chiếu. Các mẫu giống trong nhóm này có hệ số tương đồng với nhau dao động từ 96,6% (giữa mẫu giống H10 và H13) đến 99% (giữa mẫu giống H2 và H9). * Nhóm thứ 3 gồm duy nhất mẫu giống H19 - hài Gấm tương đồng 99.2% về trình tự nucleotide với mẫu giống tham chiếu JQ929313.1 Paphiopedilum concolor.
16 Hình 3.4. Sơ đồ hình cây của 23 mẫu giống lan hài và các mẫu giống tham chiếu * Nhóm thứ 4 gồm 4 mẫu giống H8, H15, H14, H6 và 3 mẫu giống tham chiếu. Bốn mẫu lan hài trong nhóm này có mức tương đồng về trình tự nucleotide với nhau dao động từ 82.1% (giữa mẫu H8 và H15) đến 98.5% (giữa mẫu H6 và H14). 3.3. Đánh giá, xác định một số loài lan hài có triển vọng, tiềm năng phát triển và đề xuất hướng bảo tồn và phát triển Từ các kết quả đánh giá về đặc điểm hình thái và đa dạng di truyền của các loài lan hài ở nội dung 1 và nội dung 2 đồng thời dựa trên các tài liệu (sách, báo, ấn phẩm) lan hài. Luận án dề xuất một số giải pháp như sau: 1. Cần có biện pháp bảo tổn các loài lan hài phân bố và nuôi trồng tại khu vực miền núi phía Bắc theo nhiều hình thức (nhân giống, bảo tồn tại chỗ, bảo tồn chuyển chỗ). Đặc biệt cần có biện pháp khẩn cấp đối với loài lan hài đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên (hài Việt Nam), và những loài lan hài đang trong tình trạng nguy cấp (hài Điểm Ngọc, hài Hằng, hài Chân tím, hài Đuôi Công). Trong khuân khổ luận án có hạn đã lựa chọn lan hài Việt Nam và lan hài Điểm Ngọc đưa vào nhân giống. 2. Cần phải thực hiện các phép lai cùng loài và khác loài nhằm tạo ra các con lai đáp ứng nhu cầu người chơi. 3.3.1. Xác định nguồn gen ưu tú để thiết lập các cặp bố mẹ phục vụ công tác lai tạo Trong lai tạo giống cây trồng nhà chọn giống luôn hướng tới tìm ra các cặp bố mẹ để tận dụng ưu thế lai, đánh giá đặc điểm di truyền là phương pháp nhanh nhất giúp nhà chọn tạo giống có thể lựa chọn ra cặp bố mẹ có khả năng cho ưu thế lai cao. Ưu thế lai sẽ thể hiện ở các cặp bố mẹ có hệ số di truyền xa nhau. Dựa vào đặc điểm hoa, màu sắc hoa, thời gian ra hoa, chiều dài cuống hoa, khả năng thích nghi, dễ ra hoa và đánh giá đa dạng di truyền ở mức kiểu hình và phân tử đề xuất 1 số cặp lai như sau:
17 - Các cặp bố mẹ có hệ số di truyền xa nhau STT Tên cặp lai (♀ x ♂) Ký hiệu 1 ♀Hài Điểm Ngọc x ♂hài Việt Nam ♀H18 x ♂H20 2 ♀Hài Gấm x ♂hài Điểm Ngọc ♀H19 x ♂H18 3 ♀Hài Gấm x ♂hài Việt Nam ♀H19 x ♂H20 4 ♀Hài Gấm x ♂hài Hằng ♀H19 x ♂H7 5 ♀Hài Điểm Ngọc x ♂hài Hồng ♀H19 x ♂H5 6 ♀Hài Hằng x ♂hài Việt Nam ♀H7 x ♂H20 - Các cặp bố mẹ có hệ số di truyền gần nhau STT Tên cặp lai (♀ x ♂) Ký hiệu Đặt tên 1 ♀Hài Mạng đỏ tía x ♂hài Gấm ♀H23 x ♂H19 HG01 2 ♀Hài Điểm Ngọc x ♂hài Hằng ♀H18 x ♂H7 HN01 3 ♀Hài Hồng x ♂ hài Việt Nam ♀H5 x ♂H20 HV01 3.3.2. Đánh giá khả năng lai tạo của 9 cặp bố mẹ lan hài 3.3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của sức sống hạt phấn đến tỷ lệ đậu quả Hạt phấn của 6 loài lan hài (Hài Việt Nam, Hài Hồng, Hài Mạng đỏ tía, Hài Điểm Ngọc, Hài Hằng và Hài Gấm) có sức sống nảy mầm cao trong 3 ngày đầu sau khi nở. Tỷ lệ nảy mầm của hạt phấn trong 3 ngày đầu dao động từ 50,4 đến 89,3%. Đến ngày thứ 4 hạt phấn lan hài bắt đầu giảm dần và đến ngày thứ 10 hạt phấn nảy mầm rất kém, ống phấn vươn ngắn, do vậy nên sử dụng hạt phấn lan hài để làm vật liệu thụ phấn cho nhụy trong thời gian từ khi hoa nở 1-3 ngày đầu tiên. 3.3.2.2. Ảnh hưởng của thời điểm lai trong ngày đến tỷ lệ đậu quả của các cặp lan hài lai Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, tỷ lệ đậu quả trong lai giống thường phụ thuộc vào phương thức thụ phấn, sức sống hạt phấn, thời điểm thụ phấn, cây mẹ, điều kiện môi trường và thao tác kỹ thuật thụ phấn. Trong 9 tổ hợp lai thì có 3 tổ hợp sử dụng cây mẹ là hài Việt Nam cho kết quả thụ phấn thấp, tỷ lệ thụ phấn đạt được và sử dụng làm cây mẹ đều cho kết quả lai tạo thấp. Tỷ lệ đạt 0% đến 20%. Cao nhất là tổ hợp lai HG x HMD tỷ lệ thụ phấn đạt 20 – 70%. Trong đó thời gian thụ phấn thích hợp nhất là giai đoạn từ 8-10h. Các tổ hợp lai Hằng x Hương cũng tỏ ra thích hợp thời điểm thụ phấn từ 8-10h. 3.3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của 1 số loại dinh dưỡng đến khả năng tăng trưởng quả lai Trong 9 cặp lai chỉ có 3 cặp lai H19 x H23; H23 x H18; H5 x H20 quả phát triển. Còn những cặp lai khác có quá trình héo hoa sau thụ phấn, sau 20 ngày thụ phấn quả hình thành nhưng không phát triển sau 1-2 tháng thì quả rụng. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng phối trộn đến khả năng sinh trưởng của quả lan hài cho thấy phân bón số 1 (Phân trùn quế) thích hợp với tăng trưởng của cây cũng như tăng trưởng quả. 3.4. Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống đối với một số loài lan hài có giá trị và một số sản phẩm lai Từ kết quả điều tra, nghiên cứu cho thấy cần phải bảo tồn và phát triển các loài lan hài có giá trị và đang ở mức độ nguy cấp cần phải thực hiện biện pháp nhân