Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm tạo được các con lai lại (backcross) giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo được dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG MÃ SỐ: 62 62 01 11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2016
Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: 1. GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH 2. TS. RAMONA THIEME Phản biện 1: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC THÀNH Viện Công nghệ Sinh học Phản biện 2: PGS.TS. HÀ VIẾT CƢỜNG Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: PGS.TS. ĐẶNG TRỌNG LƢƠNG Viện Di truyền Nông nghiệp Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trong các bệnh gây hại khoai tây, bệnh mốc sương do Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây ra được coi là bệnh phổ biến và nguy hại nhất. Trong điều kiện thuận lợi bệnh có thể phát triển nhanh thành dịch, phá hủy toàn bộ mùa màng trong vòng một đến hai tuần lễ. Việc sử dụng biện pháp phòng chống bệnh hại bằng thuốc hóa học vừa gây ô nhiễm môi trường vừa tăng chi phí sản xuất (Darsow et al., 2008) nhưng vẫn không giảm thiệt hại hoàn toàn. Hơn nữa, nấm mốc sương có tính di truyền khá linh động và thích ứng cao nên dễ kháng các loại thuốc hóa học. Chọn giống kháng bệnh mốc sương được coi là một biện pháp hiệu quả. Chọn giống khoai tây kháng bệnh vào đầu thế kỷ 20 (những năm 1950 và 1960) tập trung vào việc sử dụng các gen trội (R còn gọi là gen Rpi) chính kháng mốc sương từ loài hoang dại Solanum demissum và 11 gen R được chuyển vào khoai tây. Mặc dù gen kháng chính có hiệu quả cao, nhưng tính kháng ở các giống mang gen kháng chính R nhanh chóng bị vượt qua vì nấm mốc sương có khả năng thích nghi với cây kháng rất nhanh (Fry, 2008; McDonald and Linde, 2002). Tuy nhiên, nhiều chiến lược khác nhau được xem xét để sử dụng nhiều gen kháng để tạo ra khả năng kháng đồng ruộng bền vững (Jones, 2001; Park et al., 2009; Darsow, 2014) và sử dụng các gen kháng từ nhiều loài hoang dại khác nhau. Các gen kháng từ các nguồn khác nhau được tích tụ nhờ phương pháp lai chuyển gen truyền thống và sử dụng chị thị phân tử (Tan et al., 2008, 2010). Các nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài khoai tây dại mang nguồn gen kháng bệnh mốc sương cao (Szczerbakowa et al., 2005, Thieme et al., 2008, 2010). Tuy nhiên, rất khó để chuyển đặc tính kháng này qua con đường lai hữu tính giữa các loài hoang dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do cơ chế cách ly về sinh sản (Jackson and Hanneman, 1999), cụ thể là sự khác biệt về số lượng nhiễm sắc thể và số cân bằng nội nhũ (Borgato et al., 2007; Tiwari et al,, 2010). Để khắc phục rào cản lai này nhà chọn giống có thể sử dụng kỹ thuật nhiễm sắc thể, lai bắc cầu, thụ phấn mento, xử lý auxin và cứu phôi. Dung hợp tế bào trần để tạo con lai, gọi là con lai soma, là một giải pháp để khắc phục rào cản lai xa (Oberwalder et al., 2000; Wielgat and Wasilewska, 2001) và chuyển nhiều gen kháng vào khoai tây trồng. Dung hợp tế bào trần hay lai soma có thể chuyển các tính trạng đơn gen và đa gen từ các loài hoang dại vào khoai tây nhưng vẫn bảo toàn được hệ gen nhân và tế bào chất (Gavrilenko et al., 2003) và tạo ra nguồn vật liệu đa dạng mang mức kháng bệnh cao (Mattheij et al., 1992; Thach et al., 1993; Davey et al., 2005; Thieme et al., 2010). 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định được các thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sương và các giống khoai tây 1
trồng mẫn cảm với bệnh mốc sương. Tạo được các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại vào khoai tây trồng. Tạo được các con lai lại (backcross) giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo được dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Trên cơ sở thu thập được nguồn vật liệu quý là các dòng khoai tây dại mang nguồn gen kháng bệnh mốc sương, đề tài tập trung nghiên cứu quy trình tách, dung hợp tạo các thể lai soma cải thiện được khả năng kháng bệnh mốc sương đồng thời tổ hợp được những tính trạng quý từ khoai tây trồng. Trên nền đa dạng di truyền đã tạo ra tiền hành đánh giá, chọn lọc các thể lai soma có khả năng kháng bệnh mốc sương và mang các đặc tính nông sinh học quý. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đã xác định được các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại mang gen kháng bệnh mốc sương và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp ở thông số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trường nuôi cấy các sản phẩm sau dung hợp là môi trường VKMII lỏng; môi trường Cul-medium để tạo callus và môi trường RJM để tái sinh chồi. Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội (2x) mang gen kháng bệnh mốc sương (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) với giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) tứ bội (4x) mẫn cảm với bệnh mốc sương (Agave, Atlantic, Delikat, Quarta và Rasant) nhưng có năng suất và chất lượng tốt. Các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng khoai tây dại S.bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10 và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sương Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn vật liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh của Việt Nam. Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo được 11 tổ hợp lai và chọn được 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sương đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nước ta. 2
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Đây là một nghiên cứu có tính khoa học chuyên sâu về di truyền chọn giống cây trồng. Đề tài cũng là một bước phát triển kỹ thuật cao của công nghệ tế bào thực vật (kỹ thuật dung hợp tế bào trần) trong tạo giống khoai tây. Các kết quả của đề tài có giá trị khoa học cả trong nước và quốc tế. Đề tài đã góp phần chứng minh khả năng chuyển được tính kháng bệnh mốc sương từ các loài khoai tây dại sang các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần và ứng dụng thành công kết quả này trong chọn tạo các giống khoai tây trồng kháng các loại bệnh quan trọng. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu đã chọn tạo được thành công 4 dòng con lai soma và khoai tây trồng giống Delikat (blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat là các dòng 13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11 có khả năng kháng bệnh mốc sương đồng thời có đặc điểm nông sinh học phù hợp. Đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chương trình chọn giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT KHOAI TÂY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Theo số liệu tổng kết của FAOSTAT (2014), tổng diện tích trồng khoai tây trên thế giới năm 2013 là 19.463.041 ha, trong đó khu vực Châu Á chiếm 51,68% tổng diện tích trồng khoai tây trên thế giới, Việt Nam có diện tích trồng khoai tây năm 2013 là 23.077 ha). Năng suất bình quân của thế giới là 18,9 tấn/ha trong đó năng suất bình quân thực tế của Việt Nam chúng ta mới chỉ đạt 13,6 tấn/ha. Vấn đề khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó là giống, đặc biệt là các giống khoai tây sạch bệnh. Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ đáp ứng từ 20-25% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan… 2.2. NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI VÀ TÌNH HÌNH KHAI KHÁC NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI Có rất nhiều các loài dại đã được phát hiện mang các đặc tính kháng sâu bệnh và chống chịu với các điều kiện bất thuận đã được phát hiện và khai thác vào nguồn gen khoai tây trồng. Ross (1986) đã chỉ ra rằng có 6 loài khoai tây dại được khai thác cho các giống khoai tây trồng của Châu Âu bao gồm: S. demissum (kháng mốc sương, PLRV), S. acaule (Kháng PVX, PLRV, PSTV, wart, Globoder và chịu sương giá), S. stoloniferum (Kháng PVA, PVY), S. chacoense (Kháng PVA, PVY, mốc sương, Colorado beetle, bọ nhậy), S. spegazzinii (kháng Fusarium, wart, Globodera), S. vernei (kháng GloboderaI, có hàm lượng tinh bột cao). Theo thời gian, nguồn gen kháng từ các loài khoai tây dại đã được khai thác và chuyển vào nguồn gen khoai tây trồng. 3
2.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƢƠNG PHÁP DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN Những khâu quan trọng của kỹ thuật này bao gồm: tách, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần; dung hợp tế bào trần; chọn lọc các thể lai soma. Để tách được tế bào trần người ta có thể sử dụng hai phương pháp tách cơ học và tách bằng enzyme. Trong đó phương pháp enzyme hiện nay được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao.Tế bào trần sau khi được tách được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp có khả năng tái tạo thành tế bào, phân chia và tạo cây hoàn chỉnh. Những yêu cầu về mặt dinh dưỡng cho việc nuôi cấy tế bào trần gần giống với môi trường nuôi cấy mô tế bào. Các phương pháp nuôi cấy nói chung đã được nhiều tác giả công bố trong đó có phương pháp nuôi cấy dịch huyền phù và giọt. Tế bào trần được hòa lơ lửng trong môi trường lỏng ở mật độ khoảng 10 5 tế bào trần /ml trong hộp chứa một lớp mỏng môi trường và nuôi cấy trong điều kiện tĩnh. Quá trình nuôi cấy giọt đã được phát triển bởi Kao et al. (1974). Các tế bào trần sau khi nuôi cấy thường có biểu hiện tăng thể tích tế bào chất, tăng kích thước và phát sinh hầu hết các cơ quan tử (chủ yếu là lục lạp) tụ thành đám quanh nhân (có thể quan sát rõ trên kính hiển vi). Tỷ lệ tái tạo và độ thành thục của thành tế bào trong quá trình nuôi cấy phụ thuộc vào các yếu tố: giai đoạn phân hóa của tế bào trần, điều kiện tách tế bào trần và tính đặc thù của loài thực vật. Quá trình tái tạo thành tế bào diễn ra ngay vài giờ sau khi tách và có thể hoàn thiện sau 2-7 ngày. Sau khi thành tế bào được tái tạo hoàn chỉnh, tế bào trần không còn giữ nguyên hình dạng như ban đầu. (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Sự phân chia diễn ra liên tục và tạo thành các cụm đa bào goi là microcallus (những cụm đa bào này là kết quả của sự tái tạo thành và sự phân chia tế bào). Sau 3-8 tuần có thể thu được các marcocallus với kích thước 0,5-1,5mm nằm trên bề mặt thạch. Các marcocallus được cấy chuyển tiếp sang môi trường tái sinh RJM (Möllers and Wenzel, 1992), đặt trong điều kiện nuôi cấy macrocallus. Khoảng 8- 12 tuần sau khi cấy chuyển, marcocallus sẽ tái sinh thể chồi. Các thể chồi được chuyển sang môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) để tạo cây hoàn chỉnh. Hai đối tượng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một cách tự phát hoặc được cảm ứng bởi tác nhân như hóa chất (dung hợp hóa chất polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện- electrofusion). Đối với cây khoai tây người ta đã sử dụng cả hai phương pháp trên. Tuy nhiên so với phương pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung điện được áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản, tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độc đối với tế bào. Phương pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thường gây độc cho tế bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh sau này 4
(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Nhìn chung khoảng 20%-25% tế bào trần có thể bị kích thích dung hợp bởi các yếu tố kích thích mặc dù sự hình thành thể nhân có thể là 50-70% (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Tuy nhiên, sự nhận biết các thể dị nhân là không đơn giản, cần phải có các phương pháp chọn lọc đặc trung. Việc tách được các cá thể lai heterocariot (dị nhân) ra khỏi các cá thể đồng dung hợp hay chưa dung hợp khi tái sinh là hết sức quan trọng. Trong mục tiêu nghiên cứu lý thuyết, người ta có thể sử dụng cả “bố”, “mẹ” có đặc trưng rất khác nhau để dễ dàng thanh lọc ra các thể lai trên môi trường chọn lọc. Bằng các phương pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) hoặc isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả bố và mẹ dung hợp. 2.4. BỆNH MỐC SƢƠNG TRÊN CÂY KHOAI TÂY Bệnh mốc sương do nấm Phytophthora infestans gây ra là bệnh gây hại nghiêm trọng bậc nhất cho cây khoai tây, đặc biệt bệnh nếu bùng phát thành dịch sẽ rất nguy hiểm ở các vùng chuyên canh. Một nguồn gen kháng mốc sương mới được phát hiện gần đây và hiện đang được tập trung nghiên cứu là các gen kháng có nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum bulbocastanum. Đây là loài dại nhị bội, có nguồn gốc từ vùng trung Mỹ, phát triển tại vùng đồi núi có độ cao từ 1200 đến 2300 mét so với mực nước biển, thuộc đông bắc Mexico (Spooner et al., 2005). Cho đến nay các nhà khoa học đã phát hiện và nhân dòng được 4 gen kháng bệnh mốc sương có nguồn gốc từ loài dại Solanum bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu Leucine (NBS-LRR), bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al., 2003) hay còn được biết đến với tên RB (Song et al., 2003); gen Rpi-blb2 (van der Vossen et al., 2005); gen Rpi- blb3 (Lokosou et al., 2009); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al., 2009) được phát hiện từ phép lai giữa S. bulbocastanum và S. tuberosum. 2.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY 2.5.1. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp truyền thống Các phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống thường được áp dụng như kỹ thuật lai tạo, lai lại (backcross), đột biến và chọn lọc (Kuckuck et al., 1985). Nhược điểm của phương pháp truyền thống là vấp phải những khó khăn về mặt đặc tính di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum). 2.5.2. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen trên cây khoai tây đã được ứng dụng để chuyển gen kháng bệnh virus, kháng bệnh mốc sương, bệnh tuyến trùng (root-knot), héo xanh (Verticillium wilt) và rệp. Tuy nhiên phương pháp chuyển gen còn nhiều hạn chế: nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây trồng bằng công nghệ gen do chúng được kiểm soát bởi đa gen; hoặc các gen kiểm soát các 5
tính trạng mong muốn vẫn chưa được biết đến; nhiều gen rất khó để tách ra được và nhân dòng thành công; ngoài ra do khoai tây là cây lương thực, thực phẩm nên vẫn còn nhiều tranh cãi về sử dụng sản phẩm chuyển gen (GMO). 2.5.3. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần Đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại để chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai hữu tính (Thieme et al., 2010): S. Chacoense (Butenko et al., 1982); S.niggrum (Binding et al., 1982, 1988); S.brevidens (Austin et al., 1985; Helgeson, 1993); S.circaeifolium (Mattheij et al., 1992); S.berthaultii (Serraf et al.,1991); S.commersonii (Cardi et al., 1993); S.khasianum, S.aculeatissimum (Stattmann et al., 1994); S.torvum (Jadari et al., 1992); S.phureja (Puite et al., 1986); S.pinnatisectum (Sidorov et al., 1987, 1994; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995); S.bulbocastanum (Austin et al., 1993; Brown et al., 1995; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995). Thieme et al. (1997) đã lai tạo thành công giữa khoai tây trồng S. tuberosum (2n = 2x và 2n = 3x) với 2 loài khoai tây dại nhị bội Mê-xi-cô (S.pinnasisexta và S.bulbocastana) qua dung hợp tế bào trần bằng xung điện. Dinu and Thieme (2000) đã tạo thành công tổ hợp lai giữa các loài khoai tây dại với các giống khoai tây trồng S. tuberosum L., các dòng khoai tây chọn tạo giống và các dòng nhị bội nhằm để chuyển các gen kháng bệnh mốc sương và các gen kháng bệnh virus vào khoai tây trồng. Thieme et al. (2010) cũng đã tạo được các con lai không chỉ đa dạng về hình thái, các tính trạng nông sinh học mà chúng cũng đồng thời kháng được cả bệnh và sâu hại. Để chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài khoai tây dại Solanum michoacanum (mch) (có khả năng kháng bệnh mốc sương cao) vào khoai tây trồng Solanum tuberosum, các phép lai soma bằng dung hợp tế bào trần đã được áp dụng giữa mch với 2 dòng khoai tây nhị bội DG 81-68 và DG 88-89 và giống khoai tây trồng tứ bội Rynal nhạy cảm với bệnh mốc sương (Smyda et al., 2013). Tiếp nối các nghiên cứu này, Smyda et al. (2016) đã dung chỉ thị DArT (Diversity array technology) để phân tích thành phần genom nhân của 97 con lai soma của tổ hợp lai giữa S.michoacanum với S.tuberosum và 11 con lai cùng loài 4x mch (những con lai có tính kháng bệnh mốc sương). Phân tích cấu trúc nhiễm sắc thể của các con lai đã cho thấy sự có mặt hay không có mặt của các chỉ thị phân tử từ genom của cả bố và mẹ dọc theo chiều dài của nhiễm sắc thể của các con lai soma. Ở Việt Nam, cho đến nay công nghệ này vẫn còn hết sức mới mẻ. Hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu nay ở Việt Nam chủ yếu vẫn là công tác nhập nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù hợp cho sản xuất. Gần đây, nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây có sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần đã được bắt đầu tiến hành ở Việt Nam (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2009, 2011, 2012; Đỗ 6
Thị Thu Hà và cs., 2012, Đinh Thị Thu Lê và cs, 2012, Vũ Thị Thu hằng và cs., 2012). Tiếp tục hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp được đặc tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại và các đặc tính nông học quý từ khoai tây trồng. Đây là hướng đi quan trọng để tạo vật liệu khởi đầu cho chương trình chọn tạo giống khoai tây của Việt Nam. PHẦN 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được tiến hành tại Viện Sinh học nông nghiệp – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam và Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI- CHLB Đức) trong thời gian nghiên cứu từ năm 2011 đến năm 2015. 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc sương: S. bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế tại Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK, Genebank). Các giống khoai tây trồng mang các tính trạng nông sinh học quý thích nghi với điều kiện khí hậu ở Việt Nam. 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.3.1. Nội dung 1: Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng - Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic - Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng thu thập được - Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp 3.3.2. Nội dung 2: Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đếm độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR - Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội Flow cytometry - Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR 3.3.3. Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử - Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử - Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học của các con lai soma 3.3.4. Nội dung 4: Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc - Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng - Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai BC thu được về khả năng kháng mốc sương và các đặc tính nông sinh học 7
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 3.4.1.1. Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch enzym đến mật độ tế bào trần thu được Vật liệu được nhân 10-20 cây in vitro/mỗi kiểu gen bố mẹ trong bình thủy tinh từ 3-4 tuần tuổi, trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng và 22oC, để các nguyên liệu này trong tối trước khi tiến hành các thí nghiệm dung hợp. Phương pháp tách tế bào trần (Theo quy trình Cooking et al. (1960), có cải tiến theo Thach et al. (1993) và Thieme et al. (1997)). Tiến hành tách tế bào trần ở 4 nồng độ enzym khác nhau: E1 = Dung dịch enzym 1: có 0,2% Macerozym, 0,8% Cellulase; E2 = Dung dịch enzym 2: có 0,1% Macerozym, 0,6% Cellulase, E3 = Dung dịch enzym 3:có 0,1% Macerozym, 0,8% Cellulase; E4 = Dung dịch enzym 4: có 0,1% Macerozym, 1% Cellulase. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym đến mật độ tế bào trần thu được Tiến hành ủ các mẫu lá của các dòng/giống khoai tây (đã được cắt nhỏ và xử lý qua dung dịch gây co nguyên sinh) ở các thời gian ủ khác nhau trong dung dịch enzym: 13 giờ; 14 giờ; 15 giờ và 16 giờ. 3.4.1.2. Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng thu thập được (Theo Thieme et al., 2008) Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế bào sau dung hợp Tiến hành dung hợp tế bào trần ở mật độ 2 x 10 5 tế bào/ml trong dung dịch dung hợp với các thông số dung hợp khác nhau: CT1: AC=700 kHz+ 3 lần xung (Rokka et al., 1994), CT2: 800 kHz+ 2 lần xung, CT3: 900 kHz+2 lần xung, CT4: 1000KHz+1 lần xung. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp Tiến hành thí nghiệm dung hợp với các thông số dung hợp tối ưu đã tìm ra ở thí nghiệm trên với các mật độ khác nhau: 1x 105 tế bào trần/ml ; 2x 105 tế bào trần/ml, 3 x 105 tế bào trần/ml, 4 x 105 tế bào trần/ml, 3 x 105 tế bào trần/ml Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế bào sau dung hợp Theo dõi ảnh hưởng của các tổ hợp lai khác nhau đến kết quả tái sinh sau dung hợp 3.4.1.3. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phân chia của tế bào trần sau khi dung hợp 8
Tiến hành nuôi cấy các tổ hợp lai trên 3 nền môi trường: VKM II lỏng (không chứa agar); VKM II bán lỏng (nhỏ giọt agar) và VKM II rắn (bổ sung 5g agar/lít môi trường). Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia của các tổ hợp lai sau dung hợp Tiến hành nuôi cấy các tổ hợp lai trên các loại môi trường lỏng khác nhau: môi trường VKM II (Thieme et al., 1997), Medium A* (Ehsanpour et al., 2001), KM8P* (Davey et al. 1994). Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi của các tổ hợp lai Cấy chuyển các callus trên các môi trường tái sinh khác nhau: RIM (Masson et al., 1988), MSO (Pan et al., 2004), K8P (Wei et al., 1994). 3.4.2. Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đếm độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR Thí nghiệm 9. Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội Flow cytometry (Theo Thieme et al., 2008) Sử dụng nguyên liệu lá cây in vitro của các kiểu gen khác nhau bao gồm các dòng đối chứng (nhị bội), con lai sau dung hợp, giống khoai tây trồng tứ bội. Sử dụng máy xác định độ bội Cell Lab QuantaTM Flow cytometry (Beckman Counter). Thí nghiệm 10. Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR Các con lai ngẫu nhiên được xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Theo Dinu and Thieme, 2001) sử dụng cặp mồi (theo Song et al., 2005). Các con lai ngẫu nhiên được xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Dinu and Thieme, 2001). 3.4.3. Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 3.4.3.1. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử Thí nghiệm 11. Phân lập nấm Phytophthora infestans và chuẩn bị dịch lây nhiễm (theo Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009) Phân lập nấm ở các vùng sinh thái khác nhau (Trong thí nghiệm này tiến hành thu thập ở 2 vùng trồng khoai tây là Hà Nội và Lạng Sơn). Tiến hành nuôi nguồn nấm bệnh phân lập được trên lát cắt củ. Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, dùng hàm “standard deviation” (= stdev) để xác định sai số giữa các lần lặp lại. Thí nghiệm 12. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời – Detached Leaflet Assay (Theo Darsow et al., 2004, 2008; Hammann et al., 2009) Mẫu lá khoai tây được lấy từ các cây trồng trong chậu vại hoặc trên đồng 9
ruộng ở giai đoạn cây chuẩn bị ra hoa. Mỗi kiểu gen lặp lại 5 lần (lấy 5 lá). Nhỏ dung dịch lây nhiễm với nồng độ 1,5x104 bọc động bào tử/ml (mỗi giọt khoảng 20 - 30µl) lên chính giữa bề mặt lá, đặt trong điều kiện 12h tối/12h sáng, nhiệt độ 18 – 200C, độ ẩm cần đảm bảo ở mức 90% đến bão hòa. Triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 5-6 ngày sau khi lây nhiễm. Tiến hành đo vết bệnh theo Darsow et al., 2004, 2008 và Hammann et al., 2009. Đo kích thước vết hoại tử bề mặt trước của lá theo điểm từ 1-9: Điểm 1: không có vết bệnh ở cả mặt trước và mặt sau lá; điểm 2: có 1 điểm ở bề mặt sau lá; không có vết bệnh ở bề mặt trước lá; điểm 3: 1-4 % vùng lá bị nhiễm bệnh, khoảng 4 cm2; điểm 4: 5-12% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 5: 13-30% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 6: 31-55% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 7: 56-78% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 8: 79-96% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 9: 97-100% diện tích lá bị nhiễm bệnh. Đo sự hình thành bào tử nấm ở bề mặt sau của lá: điểm 1: từ không có triệu chúng vết bệnh hoạc vết hoại tử 2- 4mm; điểm 2: nhiễm trung bình 5-55% diện tích bề mặt lá; điểm 3: 56-100% diện tích lá bị nhiễm bệnh. Thí nghiệm 13. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (Tuber slice test) (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009) Củ mới được thu hoạch (trong vòng 24h) hoặc cho các củ được bảo quản trong kho lạnh từ 1 – 2 tháng ở nhiệt độ 8 – 90C. Mỗi kiểu gen được lặp lại 5 lần (5 lát củ). Nhỏ lên mỗi lát củ 1 giọt dung dịch dịnh lây nhiễm (20 - 30µl) với nồng độ 1,5x104túi bào tử/ml, trong điều kiện tối, nhiệt độ 18 – 20oC, độ ẩm cần đảm bảo ở mức 90% đến bão hòa. Triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 7-10 ngày. Đánh giá và cho điểm dựa vào kích thước vết hoại tử trên lát cắt củ (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009) theo điểm từ 1-9: điểm 1: không có vết bệnh; điểm 2: 1% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (20mm2); điểm 3: 0,5-5% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (150mm2); điểm 4: 6-12% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (300mm2); điểm 5: 25% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 6: 43% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 7: 62% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 8: 85% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 9: 96- 100% diện tích củ bị nhiễm bệnh. Thí nghiệm 14. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng (Field test) Thí nghiệm trên đồng ruộng được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại có 15 cây trên 3 luống (bao gồm cả các giống đối chứng và các dòng mang gen kháng R). Nồng độ dung dịch lâu nhiễm là 20 x 10 3 bọc động bào tử/ml. Tiến hành lây nhiễm tại thời điểm khi cây bắt đầu hoặc kết thúc có hoa vào lúc tối muộn khi trời ẩm ướt (lây nhiễm theo kiểu dạng dạng phun mù). Triệu chứng sẽ bắt đầu 10
xuất hiện sau 1 tuần lây nhiễm. Tiến hành đo vết bệnh ít nhất 5 lần khi sự nhiễm bệnh bắt đầu từ 0,1% - 100%. Đánh giá phản ứng của bệnh trong toàn bộ quá trình phát triển của bệnh theo chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (Area Under Disease Progress Curve - AUDPC) và chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian tương đối (r) AUDPC; Phân tích sự sai khác (variance) được sử dụng để đánh giá tất cả các giống. Kết quả có thể được so sánh với giống đối chứng) (Truberg et al., 2008). Thí nghiệm 15. Đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử Xác định các gen kháng Rpi-blb ở các con lai soma có sử dụng các mồi đặc hiệu của các gen: Rpi-blb1, (Wang et al., 2008) và Rpi-blb3 (Lokossou et al., 2010). 3.4.3.2. Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học của các con lai soma Thí nghiệm 16. Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học của các con lai soma Các dòng con lai soma và các dòng bố mẹ sau nuôi cấy in vitro 4 tuần được trồng vào vụ Đông – Xuân năm 2013-2014 tại cánh đồng thực nghiệm- Viện Sinh học Nông nghiệp để đánh giá các tính trạng về hình thái, sinh trưởng, phát triển, các yếu tố cấu thành năng suất cũng như khả năng kháng bệnh. Thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp cho mỗi dòng, mỗi lần lặp lại 10 cây. Phương pháp đánh giá: theo tiêu chuẩn ngành (số 32-1998/QĐ-BNN-KHCN ngày 24 tháng 2 năm 1998) và quy chuẩn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (QCVN 01- 69:2011/BNNPTNT). 3.4.4. Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc Thí nghiệm 17. Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai BC thu được về khả năng kháng mốc sương và các đặc tính nông sinh học Các hạt lai khoai tây được xử lý ngủ nghỉ bằng dung dịch Gibberelic Acid Solution (GA3 nồng độ 1mg/l). Khi hạt nảy mầm đến giai đoạn 2 lá thật thì phun dịch lây nhiễm bệnh mốc sương (nồng độ dịch lây nhiễm là 6000 túi bào tử/ml), Triệu chứng sẽ xất hiện sau 3 ngày, giữ lại cây khỏe và loại bỏ những cây bệnh. Dùng thuốc trừ nấm phun phòng cho những cây khỏe sau lây nhiễm. Tiếp tục chăm sóc cho đến khi thu hoạch củ. 3.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU + Số liệu trong các thí nghiệm tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần được xử lý theo chương trình EXCEL (thí nghiệm 1; 2; 3; 4 và 5) + Số liệu trong các thí nghiệm đánh giá cho điểm bệnh mốc sương được xử lý theo chương trình EXCEL, dùng hàm “standard deviation” (= stdev) để xác định sai số giữa các lần lặp lại (thí nghiệm 11; 12 và 13). 11
+ Số liệu trong các thí nghiệm đánh giá các đặc tính nông sinh học của các con lai (các chỉ tiêu: chiều cao cây, số củ trung bình/khóm, khối lượng củ trung bình/khóm trong thí nghiệm 16) được xử lý thông kê đánh giá sự sai khác có ý nghĩa ở mức α = 0,05 theo phần mềm SAS 9.1. PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ 4.1.1. Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 4.1.1.1. Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic a. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch enzym đến mật độ tế bào trần thu được Các loại dung dịch enzym khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến hiệu quả tách tế bào trần. Để tách tế bào trần có hiệu suất cao nhất, mỗi dòng/giống khoai tây cần một loại dung dịch enzyme phù hợp: dung dịch E1 (0,2% Macerozym và 0,8% Cellulase) sử dụng để tách tế bào trần của các dòng/giống blb2G, trn3G, Rasant, Agave; dung dịch E2 (0,1% Macerozym và 0,6% dùng để tách tế bào trần của các dòng/giống pnt2G và Delikat; dung dịch E3 (0,1% Macerozym và 0,8% Cellulase); dung dịch E4 (0,1% Macerozym và 1% Cellulase) dùng để tách tế bào trần của giống Atlantic b. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym đến hiệu suất tách tế bào trần Thời gian ủ mô lá trong dung dịch enzym có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả tách tế bào trần. Thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ (bảng 4.1). Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian ủ của mô lá trong dung dịch enzym đến hiệu suất tế bào trần thu đƣợc Tên Thời gian ủ (giờ) (số tế bào trần/ml) dòng/giống 13 giờ 14 giờ 15 giờ 16 giờ 5 5 5 pnt2G 0,9 x 10 2,5 x 10 3,0 x 10 3,9 x 105 blb2G 1,4 x 105 2,9 x 105 3, 4 x 105 2, 6 x 105 trn3G 1,1 x 105 2,9 x 105 4,0x 105 3,4 x 105 Delikat 1,2 x 105 2,8 x 105 3,6 x 105 2,8 x 105 Quatar 1,2 x 105 2,9 x 105 3,4 x 105 3,3x 105 Rasant 2,4 x 105 4,6 x 105 3,8 x 105 2,8 x 105 Agave 2,1 x 105 4,4 x 105 3,9 x 105 2,5 x 105 Atlantic 2,1 x 105 3,5 x 105 3, 1 x 105 2,1 x 105 12
4.1.1.2. Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng thu thập được a. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế bào sau dung hợp Tế bào được dung hợp ở các thông số của CT2 (tần số 800kHz và 2 lần xung), tế bào có tỷ lệ nguyên vẹn cao, thời gian xuất hiện hiện phân chia sớm (sau 2 ngày nuôi cấy), các microcallus hình thành sau 18 ngày nuôi cấy trên môi trường lỏng, số macrocallus hình thành/đĩa nhiều nhất (trung bình 85,4 macrocallus/đĩa) (bảng 4.2). Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lƣợng tế bào sau dung hợp của tổ hợp Solanum bulbocastanum và Delikat Thời gian tế bào Thời gian xuất hiện Số lƣợng STT CT phân chia (ngày) microcallus (ngày) macrocallus/đĩa 1 CT1 3 21 49,5 2 CT2 2 18 65,4 3 CT3 4 28 27,6 4 CT4 4 24 38,2 Chú thích: CT1- AC=700 kHz+ 3 lần xung (Rokka et al, 1994), CT2- 800 kHz+ 2 lần xung, CT3- 900 kHz+2 lần xung, CT4- 1000KHz+1 lần xung b. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp Mật độ ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào và tỷ lệ con lai lục bội tạo thành. Mật độ tế bào tham gia dung hợp càng cao thì tế bào phân chia sớm và tỷ lệ con lai con lai lục bội (6x) càng tăng (bảng 4.3). Dung hợp ở mật độ 4 x 105 tế bào/ml, tế bào cảm ứng nhanh và phân chia chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ con lai 6x ở mật độ dung hợp này là 65,6% con lai là con lai 6x . Như vậy mật độ xung cho hiệu quả dung hợp tạo con lai 6x cao nhất là 4 x 105 tế bào/ml (bảng 4.3). Bảng 4.3. Kết quả tái sinh và độ bội của các con lai tái sinh sau dung hợp ở các mật độ tế bào dung hợp khác nhau của tổ hợp Solanum bulbocastanum và Delikat Mật độ Thời gian Số Số cây Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ xung hợp xuất hiện macrocallus/đĩa tái sinh cây 2x cây 4x cây 6x (tế bào/ phân chia Sau 4 ngày (cây) (%) (%) (%) ml) (ngày) Sau 8 tuần 5 1x 10 3 28,5 16 56,3 25,0 18,7 5 2 x 10 2 75,7 35 37,1 34,3 28,6 5 3 x 10 2 85,6 46 13,9 45,6 40,5 5 4x 10 2 68,3 47 14,9 31,9 53,2 5 5 x 10 2 62,6 29 10,3 24,1 65,6 Chú thích: dung hợp với các thông số AC= 800 kHz, DC=120V và 2 lần xung c. Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế bào sau dung hợp Toàn bộ các tổ hợp dung hợp phân chia tế bào xảy ra sau 2-3 ngày nuôi cấy. Khả năng tạo macrocallus và tái sinh chồi phụ thuộc vào tổ hợp dung hợp hay phụ thuộc vào 13
bản chất di truyền của dòng cây nghiên cứu. Tổng cộng đã tạo được 7 tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng (bảng 4.4). Bảng 4.4. Kết quả dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội bằng phƣơng pháp xung điện STT Tên tổ hợp lai Số lƣợng Số lƣợng chồi Tỷ lệ tái callus tái sinh tái sinh sinh (%) 1 trn3G + Agave 120 39 32,5 2 trn3G + Rasant 97 25 25,8 3 blb2G + Delikat 250 31 12,4 4 trn3G + Delikat 250 64 25,6 5 Pnt2G + Atlantic 193 23 11,9 6 blb2G + Atlantic 307 4 1,3 7 trn3G + Atlantic 395 2 0,5 Tổng 1612 188 4.1.2. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp a. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phân chia của tế bào trần sau khi dung hợp Trên môi trường lỏng VKMII, thời gian bắt đầu phân chia của tế bào trần của các các tổ hợp lai từ sau 2-3 ngày đã bắt đầu phân chia phục thuộc vào các tổ hợp lai khác nhau. Sau 3 ngày nuôi cấy, toàn bộ các dòng đều phân chia và tạo microcallus sau khoảng 2 tuần nuôi cấy. Trên môi trường lỏng, hầu như các tế bào phân chia tạo hạt microcallus sau khoảng 10-14 ngày với chất lượng microcallus trắng sáng, kích thước hạt to như hạt tấm. Trong khi đó các tế bào trần trên môi trường bán lỏng (nhỏ giọt agar) có thời gian xuất hiện phân chia lâu hơn (sau từ 4-7 ngày). Trên môi trường rắn, các tế bào hầu như không có khả năng phân chia hoặc chỉ có rất ít tổ hợp có xuất hiện phân chia tế bào (blb2G + Delikat; trn3G + Delikat; blb2G + Atlantic) nhưng sau thời gian lâu hơn rất nhiều (trên 9 ngày) (bảng 4.5). Bảng 4.5. Sự phân chia của các tổ hợp lai sau khi dung hợp trên các điều kiện môi trƣờng khác nhau* Thời gian xuất hiện tế Thời gian xuất hiện Tổ hợp lai bào phân chia (ngày) microcallus (ngày) Lỏng Bán lỏng Rắn Lỏng Bán lỏng Rắn trn3G + Agave 3 4 - 12 21 - trn3G + Rasant 3 3 - 14 21 - blb2G + Delikat 2 5 15 11 26 - trn3G + Delikat 3 6 9 12 25 - pnt2G + Atlantic 2 6 - 10 22 - blb2G + Atlantic 3 5 11 12 23 - trn3G + Atlantic 3 4 - 14 24 - Chú thích: (*) 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp được theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi trường VKM II trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia. 14
b. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh của các tổ hợp lai sau dung hợp Các tế bào trần nuôi cấy trên môi trường VKMII bắt đầu phân chia chỉ sau 2- 3 ngày nuôi cấy tùy thuộc vào dòng khoai tây nuôi cấy. Sau 3 ngày nuôi cấy, toàn bộ các dòng đều phân chia và tạo microcallus sau 2 tuần nuôi cấy. Các tổ hợp lai khác nhau cũng có sự phân chia và sự hình thành microcallus khác nhau trên môi trường VKMII. Như vậy: môi trường VKMII lỏng là môi trường thích hợp để nuôi cấy tạo microcallus của tế bào trần sau khi dung hợp (bảng 4.6). Bảng 4.6. Sự phân chia của các tổ hợp lai trên các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau Thời gian xuất Thời gian xuất Số lƣợng hiện tế bào phân hiện microcallus microcallus trung Tổ hợp lai chia (ngày) (ngày) bình/đĩa petri VK KM8P VKM KM8 VK KM8 A* A* A* MII * II P* MII P* trn3G + Agave 3 5 6 12 - - 22,7 - - trn3G + Rasant 3 4 5 14 21 - 13,3 4,4 - blb2G + Delikat 2 7 5 11 - - 29,6 - - trn3G + Delikat 3 9 4 12 21 - 35,7 - 5,8 Pnt2G + Atlantic 2 6 6 10 - 22 48,3 - 1,3 blb2G + Atlantic 3 9 4 12 - - 5,1 - - trn3G + Atlantic 3 7 8 14 21 - 9,4 5,9 - Chú thích: 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp được theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi trường lỏng trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia c. Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi của các tổ hợp lai Trên môi trường RJM, hầu như các tổ hợp lai đều có khả năng tái sinh tạo chồi với số chồi trung bình/đĩa dao động từ 1,3-9,1 chồi/đĩa. Khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai khác nhau cũng khác nhau rõ rệt. Các tổ hợp lai trn3G + Delikat, pnt3G +Atlantic có khả năng tái sinh cao với số chồi trung bình/đĩa lần lượt là 8,8 và 6,4. Các chồi này phát triển tốt, màu xanh. Tổ hợp lai blb2G +Atlantic; trn3G +Atlantic có khả năng tái sinh kém, chất lượng chồi kém, màu trắng xốp (bảng 4.8). Tổng hợp các kết quả nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp thì thấy đã tái sinh được tổng số 1612 callus và tạo được 188 chồi trong đó tỷ lệ tái sinh chồi của các tổ hợp lai khác nhau rõ rệt (bảng 4.7). 15
Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai Số lƣợng chồi tái sinh/chất lƣợng chồi Tổ hợp lai Môi trƣờng Môi trƣờng Môi trƣờng K8P RJM MSO trn3G + Agave 3,3/++ 0,8/+ 2,5/+ trn3G + Rasant 5,5/++ 1,6/+ 1,3/+ blb2G + Delikat 6,5/++ 0/- 2,4/+ trn3G + Delikat 8,8/++ 0/- 0,8/- pnt2G + Atlantic 6,4/++ 1,65/+ 0/- blb2G + Atlantic 1,7/+ 0/- 0/- trn3G + Atlantic 2,3/- 0/- 0/- (-): Chồi yếu, màu trắng; +: Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt; ++: chồi tốt, mập, xanh 4.1.3. Xác định con lai soma bằng các phƣơng pháp đo độ bội thể (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 4.1.3.1. Xác định con lai soma bằng phương pháp đo độ bội thể (Flow cytometry) Thí nghiệm 9: Xác định con lai soma bằng phương pháp đo độ bội Từ kết quả dung hợp tế bào trần đã tạo được 07 tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây dại nhị bội và các giống khoai tây trồng tứ bội. Các tổ hợp lai được nuôi cấy tái sinh để tạo microcallus, macrocallus và tái sinh chồi. Sử dụng phương pháp phân tích độ bội Flow cyometry để đo độ bội thể của các con lai. Từ 188 chồi tái sinh sau dung hợp chỉ có 82 cây có độ bội thể 2n=6x (chiếm tỷ lệ 43,6 %). Tỷ lệ cây lục bội (2n=6x) phụ thuộc vào các tổ hợp dung hợp khác nhau. Trong 7 tổ hợp dung hợp thì tổ hợp lai Delikat (+) trn3G cho tỷ lệ cây tái sinh có độ bội thể 6x là cao nhất trong khi đó tổ hợp lai giữa Atlantic (+) trn 3G không cho kết quả tạo con lai lục bội (bảng 4.8). Bảng 4.8. Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai sau dung hợp STT Tên tổ hợp lai Số lƣợng Số lƣợng chồi Số dòng lục callus tái sinh tái sinh bội (2n= 6x) 1 trn3G + Agave 120 39 15 2 trn3G + Rasant 97 25 12 3 blb2G +Delikat 250 31 15 4 trn3G + Delikat 250 64 28 5 pnt2G +Atlantic 193 23 9 6 blb2G + Atlantic 307 4 3 7 trn3G + Atlantic 395 2 0 Tổng 1612 188 82 16
4.1.3.2. Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử Thí nghiệm 10: Xác định con lai soma bằng chỉ thị phân tử Trong số 188 con lai tái sinh có 82 con có độ bội 6x nhưng chỉ có 69 con có kiểu gen dị hợp nhân. Tùy thuộc vào các tổ hợp lai khác nhau, tỷ lệ con lai soma của các tổ hợp dung hợp là rất khác nhau (2/11 tổ hợp dung hợp không có con lai soma có kiểu gen dị hợp nhân). Bảng 4.9. Kết quả chọn lọc con lai soma bằng phân tích độ bội thể và chỉ thị phân tử SSR Số cây Tỷ lệ con Số dòng Số dòng lai Tên mồi xác lai soma/ Tổ hợp lai lục bội soma xác định định dòng tái (2n= 6x) (Hetezygous) con lai độ bội sinh (%) trn3G + Agave 39 15 15 38,5 STM2022 trn3G + Rasant 25 12 6 24,0 STM2022, STIIKA blb2G + Delikat 31 15 14 45,2 STM2022 trn3G + Delikat 64 28 28 43,7 STM2022 pnt2G +Atlantic 23 9 6 26,1 STM3023 blb2G + Atlantic 4 3 0 0,0 STM1106 trn3G + Atlantic 2 0 0 0,0 STM1104 Tống 1612 82 69 4.1.4. Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 4.1.4.1. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử a. Thí nghiệm 11: Phân lập nấm Phytophthora infestans và chuẩn bị dịch lây nhiễm Mẫu nấm mốc sương được phân lập từ mẫu lá bệnh thu thập ở các vùng trồng khoai tây tại Hà Nội và Lạng Sơn. Nguồn nấm được nuôi trên các lát củ, sau 6 – 7 ngày triệu chứng của nấm xuất hiện trên lát cắt củ. Nguồn nấm bệnh phân lập được từ 2 vùng sinh thái khác nhau đều thể hiện tính độc trên các giống khoai tây trồng tại Việt Nam, thể hiện mức độ gây bệnh khá cao trên các đối tượng khảo sát. Sau khi xử lý số liệu thống kê chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác về tính độc giữa 2 chủng nấm được phân lập. Nguồn nấm bệnh này hoàn toàn có thể sử dụng cho các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo. b. Thí nghiệm 12: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời Kết quả đánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo cho thấy các dòng khoai tây dại sử dụng để dung hợp S.bulbocastanum; S. tarnii và S. pinnatisectum đều có đặc tính kháng tốt với bệnh mốc sương (điểm đánh giá kích thước vết hoại tử nằm trong 17
khoảng từ 1,0 – 1,8), trong khi các giống khoai tây trồng Delikat, Agave, Atlantic, Quarta, Rasant có tính kháng bệnh mốc sương khá thấp (điểm đánh giá vết hoại tử nằm trong khoảng từ 3,6-4,6). Các tổ hợp lai soma giữa S. tarnii; S. pinnatisectum với các giống khoai tây trồng Delikat, Atlantic, Rasant và Agave hầu như không làm thay đổi khả năng kháng bệnh mốc sương. Chỉ có tổ hợp lai giữa loài dại S. bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat có tính kháng rất cao với bệnh mốc sương. Điều này chứng tỏ dòng dại S.bulbocastanum có khả năng chuyển đặc tính kháng bệnh mốc sương của nó cho các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp. c. Thí nghiệm 13: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ Tất cả các dòng giống đều có biểu hiện kháng mốc sương trên củ với nguồn mốc sương đã phân lập. Mức độ biểu hiện tính kháng bệnh mốc sương trên củ của các con lai soma rất tốt trong đó nổi bật là 4 con lai soma của tổ hợp lai S. bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat. Một số con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng dại S. tarnii với khoai tây trồng cũng có biểu hiện kháng cao với bệnh mốc sương trên củ. Tổng hợp các kết quả lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời và trên lát cắt củ cho thấy các con lai soma của tổ hợp lai giữa S.bulbocastanum và Delikat có tính kháng bệnh mốc sương rất cao. Các con lai này tiếp tục được kiểm tra khả năng có mặt của gen kháng bệnh mốc sương. d. Thí nghiệm 14: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng (Field test) Các vật liệu sẽ tiếp tục được đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sương trên đồng ruộng, sử dụng dung dịch lây nhiễm với nồng độ 20.000 bọc động bào tử/ml. Thí nghiệm lây nhiễm được tiến hành vào chiều tối mát, duy trì nhiệt độ khoảng 180C- 250C, ẩm độ khoảng 70-80%. Triệu chứng bệnh sẽ bắt đầu xuất hiện khoảng 1 tuần sau lây nhiễm. Tiến hành đo đếm mỗi tuần 1 lần trong suốt quá trình diễn biến của bệnh (7 lần). Kết quả được tính theo chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (bảng 4.17). Hệ số kháng bệnh điều chỉnh theo độ thành thục (∆)rAUDPC > 0 cho thấy giống rất mẫn cảm với bệnh, (∆)rAUDPC < 0 nghĩa là giống có khả năng kháng cao với bệnh trong đó giá trị tuyệt đối của (∆)rAUDPC càng nhỏ thì khả năng kháng bệnh càng cao. Giống khoai tây trồng Delikat rất mẫn cảm với bệnh trong khi các con lai soma của dòng giống này với dòng dại S. bulbocastanum có khả năng kháng bệnh cao. Thông qua đánh giá về sự thành thục trên đồng ruộng cũng cho thấy có sự tương quan giữa tính kháng bệnh mốc sương với sự thành thục của các kiểu gen khác nhau. Các kiểu gen có tính kháng bệnh cao thì thường là chín muộn và ngược lại. Con lai SH 2292/4 có độ chín muộn trong khi các con lai khác có độ chín trung bình. Như vậy có 18