Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận văn là phân lập và định danh các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò, và thịt gà tại các chợ bán lẻ ở khu vực Hà Nội; xác định đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được; phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***………… NGUYỄN THANH VIỆT NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 9420107 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS. Nghiêm Ngọc Minh Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ’, ngày … tháng … năm 2019. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), gánh nặng của các bệnh từ thực phẩm là rất lớn. Theo đó, mỗi năm cứ khoảng 10 người thì có 1 người bị bệnh. Bệnh từ thực phẩm có thể tiến triển nghiêm trọng, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ, người già và người suy giảm miễn dịch. Trong số các bệnh do thực phẩm gây ra thì tiêu chảy là phổ biến nhất do sử dụng thực phẩm không an toàn, 550 triệu người bị bệnh này mỗi năm, trong đó có 220 triệu trẻ em dưới 5 tuổi. Salmonella là một trong 4 nguyên nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy trên toàn cầu. Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella đang tăng lên nhanh chóng và trở thành mối đe dọa lớn tới sức khỏe loài người. Salmonella kháng kháng sinh gây khó khăn cho việc kiểm soát nhiễm khuẩn, dự phòng và điều trị bệnh. Do vậy, việc phân lập và xác định đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella từ thực phẩm là việc làm cần thiết. Việc nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc dự phòng, kiểm soát bệnh tật cũng như kiểm soát ô nhiễm thực phẩm và quy định sử dụng kháng sinh trong điều trị và chăn nuôi nhằm hạn chế khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn này. Ở Việt Nam hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về phân tích các nhóm gen ở vi khuẩn Salmonella đa kháng kháng sinh phân lập được từ thực phẩm bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới. Nghiên cứu các nhóm gen này giúp hiểu biết sâu về dịch tễ học phân tử các gen kháng kháng sinh. Quan trọng hơn là có thể phát hiện được các đột biến mới ở gen kháng kháng sinh gây ra tính kháng kháng sinh ở Salmonella. Ngoài ra còn có thể tìm ra các nhóm gen mới có khả năng gây nên tính kháng kháng sinh ở loài vi khuẩn này 1
Theo tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc, Việt Nam là quốc gia có lượng tiêu thụ thịt bò, thịt lợn, và thịt gia cầm tăng lên rất nhanh kể từ năm 1993 trở lại đây và được dự báo là sẽ tăng lên đáng kể trong những năm tiếp theo. Vì vậy, luận án này đã được thực hiện với mục tiêu và nội dung sau: 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án • Phân lập và định danh các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò, và thịt gà tại các chợ bán lẻ ở khu vực Hà Nội. • Xác định đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được. • Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án • Nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn từ các mẫu thịt thu thập được ở các chợ trên địa bàn Hà Nội, lựa chọn các mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella. • Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, từ đó lựa chọn ra các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh. • Giải trình tự gen thế hệ mới một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh để phân tích các nhóm gen liên quan. Xác nhận một số kết quả bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm sinh học của Salmonella Salmonella là trực khuẩn Gram âm, di động, không có vỏ và không sinh bào tử. Salmonella dễ nuôi, vừa ưa khí vừa kỵ khí, có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc như XLD. Trong môi trường XLD, khuẩn lạc của Salmonella thường có màu đỏ, ở giữa có màu đen. Salmonella có sức đề kháng cao ở ngoại cảnh, tuy nhiên 2
nhạy cảm với nhiệt độ, có thể bị tiêu diệt từ 700C trở lên. Salmonella có 3 loại kháng nguyên là kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H, và kháng nguyên Vi. Ngày nay, Salmonella được phân thành hai loài là S. bongori và S. enterica. Trong đó, S. enterica được chia thành 6 dưới loài là: I (enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV (houtenae) và VI (indica). 1.2. Đặc điểm hệ gen của Salmonella 1.2.1. Cấu trúc hệ gen Kích thước hệ gen của Salmonella rất khác nhau (3,39-5,59 Mb). Số gen trung bình là 4.742. Salmonella có từ 1 đến 2 plasmid kích thước từ 2-200 kb. S. enterica cần khoảng 3.499 gen và S. bongori cần khoảng 3.368 gen để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng bình thường. Hệ gen của Salmonella có độ tương đồng từ 65% đến 99%, có tính bảo thủ cao và sự biến đổi chỉ tập trung vào một số vùng đặc biệt. Có khoảng 2.800 họ gen có mặt ở tất cả các Salmonella và tổng số họ gen của tất cả các serovar là khoảng 10.000. 1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella Salmonella thường đề kháng một số nhóm kháng sinh phổ biến là aminoglycoside, β- lactam, chloramphenicol, quinolone, tetracycline, sulfonamide và trimethoprim. Nhóm Aminoglycoside. Salmonella sử dụng cơ chế biểu hiện các enzyme để biến đổi aminoglycoside qua trung gian plasmid để đề kháng aminoglycoside. Các enzyme này được phân loại thành ba nhóm và được đặt tên dựa trên các phản ứng mà chúng thực hiện là acetyltransferase, phosphotransferase và nucleotidyltransferase. Nhóm β-lactam. Ở Salmonella, bài tiết β-lactamase là cơ chế đề kháng kháng sinh β-lactam phổ biến. Các enzyme này hoạt động 3
bằng cách thủy phân các vòng cấu trúc của β-lactam, tạo ra các β amino acid không có hoạt tính kháng khuẩn. Hiện nay người ta đã tìm ra hơn 340 gen mã hóa enzyme β-lactamase. Kháng sinh chloramphenicol (C). Chloramphenicol là chất ức chế tổng hợp protein bằng cách liên kết với trung tâm peptidyltransferase của đơn vị 50S ribosome. Có hai cơ chế đề kháng C ở Salmonella là: (i) các enzyme chloramphenicol acetyltransferases hoặc gen kháng chloramphenicol cm1A và (ii) các kênh bơm thải C. Nhóm Quinolone. Đề kháng quinolone ở Salmonella được phân thành 2 cơ chế. Một là do đột biến các gen gyrA, gyrB mã hóa enzyme DNA gyrase và gen parC mã hóa enzyme topisomerase IV, và hai là do tăng biểu hiện của kênh bơm thải thuốc AcrAB-TolC. Sự kết hợp nhiều đột biến sẽ tạo ra khả năng đề kháng quinolon hơn là một đột biến đơn lẻ. Kháng sinh tetracycline (TE). Cơ chế chính trong kháng tetracycline ở Salmonella là do hệ thống các kênh bơm thải thuốc, kênh này làm giảm nồng độ tetracycline ở trong tế bào. Hiện nay người ta đã xác định được 46 gen đề kháng TE. Sulfonamide/trimethoprim (SXT). Những loại kháng sinh này có hoạt tính kìm khuẩn và cơ chế hoạt động là ức chế cạnh tranh các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp tetrahydrofolic acid. Sulfonamide ức chế enzyme dihyrdropteroate synthetase, trong khi trimethoprim ức chế reductase dihydrofolate. Khả năng đề kháng của Salmonella với sulfonamide là do sự hiện diện của gen sul. Ngoài ra còn do các gen dhfr và dfr. 1.2.3. Liên quan giữa đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở vi khuẩn 4
Mối quan hệ giữa đột biến gen và thay đổi kiểu hình kháng kháng sinh hiện vẫn chưa được làm sáng tỏ. Mối quan hệ này không phải lúc nào cũng đơn giản là quan hệ nhân quả. Thường thì nhiều đột biến mới tạo ra được một kiểu hình đề kháng một loại kháng sinh. Nhìn chung, mối quan hệ phức tạp giữa khả năng kháng kháng sinh và đột biến gen vẫn chưa rõ ràng. 1.2.4. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc (efflux pumps) Các kênh bơm thải thuốc không những có khả năng đào thải một lượng lớn các loại kháng sinh mà còn tạo ra các cơ chế kháng kháng sinh khác bằng cách làm giảm nồng độ kháng sinh trong tế bào và thúc đẩy quá trình tích tụ đột biến. Biểu hiện của hệ thống kênh bơm thải thuốc ở vi khuẩn có liên quan đến tính kháng kháng sinh của chúng trên lâm sàng. 1.3. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của các Salmonella trong thực phẩm 1.3.1. Trên thế giới Đã có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về tỷ lệ ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm đã được công bố ở khắp nơi trên thế giới. Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các chủng Salmonella phân bố khác nhau tùy theo từng khu vực địa lý và theo nguồn thực phẩm. Các type huyết thanh phổ biến khác nhau theo vùng địa lý và tỷ lệ đề kháng kháng sinh của chúng tăng lên hàng năm. 1.3.2. Tại Việt Nam Các công bố gần đây cho thấy rằng các nguồn thực phẩm tại Việt Nam nhiễm Salmonella với tỷ lệ khác nhau, trong đó có nhiều loài đa kháng kháng sinh. Tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thực phẩm và tỷ lệ đa kháng kháng sinh ở các loài Salmonella phân lập được tăng lên hàng năm. Vì vậy việc tiến hành phân lập và xác định đặc điểm 5
kháng kháng sinh của Salmonella ở từng loại thực phẩm ở từng khu vực địa lý vào từng khoảng thời gian khác nhau là cần thiết.. 1.4. Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu biểu hiện gen Hiện nay người ta thường sử dụng bốn kỹ thuật là Reverse transcription PCR (RT-PCR), Real-time PCR (qPCR), Microarray, và giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) để nghiên cứu biểu hiện gen. Trong số các kỹ thuật trên thì giải trình tự thế hệ mới có ưu điểm hơn cả, kỹ thuật này có thể khắc phục được nhược điểm của ba kỹ thuật còn lại và là kỹ thuật duy nhất có khả năng phát hiện được các gen mới. Giải trình tự thế hệ mới NGS là phương pháp đo trực tiếp trình tự nucleic acid có mặt trong mẫu nghiên cứu. Số lượng trình tự tuyến tính với nồng độ trình tự nucleic acid có mặt trong mẫu nghiên cứu. Hơn nữa, NGS không phụ thuộc vào thông tin của trình tự nucleic acid có thể biểu hiện trong mẫu nghiên cứu, không phụ thuộc vào các gen tương đồng cao. Do đó có thể phát hiện được các gen mới. Trong số các công nghệ giải trình tự thế hệ mới thì công nghệ Illumina tạo ra dữ liệu có độ chính xác cao nhất, quy trình làm thí nghiệm đơn giản, và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Hiện nay, hơn 90% dữ liệu trình tự trên thế giới được tạo ra bởi công nghệ Illumina. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Tổng số 90 mẫu thịt, gồm 30 mẫu thịt lợn (được ký hiệu từ TL-1 đến TL-30), 30 mẫu thịt gà (được ký hiệu từ TG-1 đến TG-30), 6
và 30 mẫu thịt bò (được ký hiệu từ TB-1 đến TB-30), thu thập ngẫu nhiên tại 10 chợ ở Hà Nội. 2.1.2. Môi trường, hóa chất, kháng sinh, các bộ kit Môi trường nuôi cấy, kháng sinh, các bộ kit sử dụng được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới. 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu Các thiết bị được sử dụng tại các cơ sở nghiên cứu uy tín trong nước như: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Bỏng Quốc Gia, Học viện Quân y. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu Các mẫu được lấy theo tiêu chuẩn TCVN 4833-2002. Thời gian từ 7-8 giờ sáng mùa đông, từ tháng 10 đến tháng 12 năm 2016. 2.2.2. Định danh Salmonella Định danh Salmonella theo quy trình ISO 6579:2002. 2.2.3. Kháng sinh đồ Phương pháp khoanh giấy khuếch tán của Kirby-Bauer. 2.2.4. Giải trình tự thế hệ mới Lựa chọn một số chủng Salmonella đa kháng để giải trình tự hệ phiên mã bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới của Illumina. 2.2.5. Nhóm phương pháp tin sinh học Chất lượng trình tự được kiểm tra bằng phần mềm FastQC. Các trình tự adapter và trình tự xấu được cắt bỏ bằng phần mềm Trimmomatic 0.32. Trình tự tinh sạch ở điểm chất lượng Q20 được lắp ráp de novo bằng phần mềm Geneious R11. Trình tự de novo được chú thích chức năng các gen bằng các cơ sở dữ liệu khác nhau như: RAST, PATRIC 3.5.2, BASys, và phần mềm Geneious R11. Xác định gen kháng kháng sinh bằng các cơ sở dữ liệu: ResFinder, ARG- 7
ANNOT, CARD, và PATRIC 3.5.2. Xác định đột biến gen đề kháng kháng sinh nhóm quinolone bằng công cụ ResFinder. 2.2.6. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger Để xác khẳng định kết quả dự đoán về đột biến gen kháng kháng sinh thu được từ phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, các đột biến gen mới liên quan đến kháng kháng sinh nhóm quinolone sẽ được kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger từ cDNA của các mẫu nghiên cứu. 2.2.7. Xử lý thống kê Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để tính các giá trị χ2, Fisher exact test, giá trị p. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Phân lập và định danh type các chủng Salmonella nghiên cứu 3.1.1. Kết quả phân lập Salmonella Từ kết quả tăng sinh không chọn lọc, tăng sinh chọn lọc và khẳng định sinh hóa, chúng tôi đã thu được các chủng Salmonella từ các mẫu nghiên cứu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng Salmonella ở các mẫu nghiên cứu Tổng số Dương tính Âm tính Mẫu mẫu Số mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu Tỷ lệ (%) Thịt gà 30 11 36,7 19 63,3 Thịt lợn 30 9 30,0 21 70,0 Thịt bò 30 5 16,7 25 83,3 Tổng số 90 25 27,8 65 72,2 χ2 = 3,102; df = 2; p = 0,212 8
Danh sách các mẫu dương tính với Salmonella từ các nguồn phân lập được trình bày trong bảng 3.2 Bảng 3.2. Danh sách các mẫu dương tính với Salmonella STT Nguồn mẫu Tên mẫu 1 Thịt gà (11 mẫu) TG-1, 2, 3, 4, 5, 6, 14, 25, 28, 29, 30 2 Thịt lợn (9 mẫu) TL-1, 2, 3, 4, 5, 15, 26, 29, 30 3 Thịt bò (5 mẫu) TB-1, 2, 3, 15, 29 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nghiên cứu này là 27,8%, tương đương với nghiên cứu của Đỗ Ngọc Thúy và CS (30%). Tuy nhiên tỷ lệ này thấp hơn các nghiên cứu khác như: Ta và CS (48,7%), Nguyen và CS (69,7%), Boomar và CS (80%). Theo chúng tôi, nguyên nhân thấp hơn có thể là do thu thập mẫu vào buổi sáng, lúc thịt còn tươi và sạch nên hạn chế lây nhiễm vi khuẩn. Hơn nữa thời điểm thu thập mẫu là vào mùa đông, nhiệt độ và độ ẩm không khí thấp, kết hợp với thời tiết khô hanh là những điều kiện bất lợi cho vi khuẩn phát triển. Trong số các mẫu nhiễm Salmonella, mẫu thịt gà nhiễm nhiều nhất (36,7%), tiếp theo là mẫu thịt lợn (30%), mẫu thịt bò nhiễm thấp nhất (16,7%). Kết quả này giống với kết quả nghiên cứu của Đỗ Ngọc Thúy và CS, Zhao, Miranda. Tuy nhiên khác so với các nghiên cứu khác như Phan (lợn, bò, gà), Nguyen (lợn, gà, bò). Tỷ lệ nhiễm khuẩn ở thịt gà thường cao hơn thịt lợn có thể là do gà được vặt lông và mổ trực tiếp trên nền xi măng, không có sự cách ly rõ ràng giữa khu vực làm lông và moi ruột nên vi khuẩn từ phân, môi trường dễ dàng nhiễm vào thịt. Từ các kết quả nghiên cứu trên có thể thấy rằng, tỷ lệ nhiễm Salmonella ở các loại thịt bán lẻ là rất khác nhau, phụ thuộc vào khu vực địa lý thu thập mẫu. 9
3.1.2. Kết quả định danh type các chủng Salmonella phân lập được Từ các Salmonella thu được, tiến hành định type, chúng tôi thu được 9 serovar khác nhau. Trong đó S. Typhimurium phổ biến nhất (11/25 chủng). Tiếp theo là S. Derby (4/25 chủng). Các S. Warragul, S. Indiana, S. Rissen (2/25 chủng). S. London, S. Meleagridis, S. Give, S. Assine chiếm tỷ lệ ít nhất (1/25 chủng). Chúng tôi nhận thấy rằng ở các nghiên cứu khác nhau thì serovar phổ biến cũng khác nhau. Ví dụ, Moe và CS (S. Albany), Patchanee (S. Rissen). Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng, các serovar phổ biến ở các nghiên cứu là khác nhau, phụ thuộc vào khu vực địa lý và thời gian thu thập mẫu. 3.2. Đặc điểm kháng kháng sinh của các Salmonella phân lập được 3.2.1. Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được Từ kết quả kháng sinh đồ, chúng tôi thu được 52% (13/25) số chủng đề kháng ít nhất một kháng sinh, trong đó tỷ lệ đa kháng là 36%. Streptomycin (STR) và tetracyclin (TE) bị đề kháng nhiều nhất (44%). Đây là điều dễ hiểu vì hai kháng sinh này được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam, cả trong điều trị và chăn nuôi. Tất cả Salmonella đều nhạy cảm với ceftazidime (CAZ), vì thế đây một kháng sinh tốt có thể dùng để điều trị nhiễm Salmonella, cần phải giám sát tình hình sử dụng kháng sinh này. Salmonella đề kháng kháng sinh là nguồn lây truyền các gen kháng thuốc cho sinh vật khác, nguy hiểm hơn là cho người thông qua việc tiêu thụ thức ăn. Tỷ lệ kháng kháng sinh trong nghiên cứu này (52%) thấp hơn kết quả của một số nghiên cứu ở Việt Nam (62,2%), Nhật Bản (89,9%). Tỷ lệ đa kháng (36%) thấp hơn một số kết quả nghiên cứu khác như Nguyen (41,1%), Katoh (90,2%). Sự khác biệt này theo một số tác giả thì có thể là do tỷ lệ lạm dụng thuốc kháng 10
sinh trong chăn nuôi và điều trị khác nhau giữa các vùng, điều này làm tăng áp lực chọn lọc, dẫn tới sự xuất hiện và tồn tại các vi khuẩn kháng kháng sinh với tỷ lệ khác nhau. Số lượng mẫu trong nghiên cứu này còn ít (25 mẫu). Vì thế cần tiến hành các nghiên cứu tiếp theo về tỷ lệ đề kháng và tỷ lệ đa kháng kháng sinh với số lượng mẫu lớn hơn. 3.2.2. Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của Salmonella theo nguồn phân lập giúp đánh giá chi tiết đặc điểm kháng kháng sinh của chúng theo từng nguồn thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy Salmonella phân lập từ thịt lợn đề kháng nhiều kháng sinh nhất, với tỷ lệ 66,7% (6/9 chủng), trong đó 44,4% (4/9 chủng) đa kháng kháng sinh. Tiếp theo là các chủng phân lập từ thịt gà với tỷ lệ 36,4% (4/11 chủng) trong đó 27,3% (3/11 chủng) đa kháng. Chỉ có duy nhất 1 chủng S. Typhimurium từ thịt bò kháng kháng sinh và là chủng đa kháng. S. Typhimurium chiếm tỷ lệ lớn ở cả ba nguồn phân lập (11 chủng), nhưng chỉ có 3 chủng kháng kháng sinh đồng thời là chủng đa kháng. 3.2.3. Số lượng Salmonella đề kháng từng kháng sinh theo nguồn phân lập Việc xác định khả năng kháng kháng sinh của Salmonella theo nguồn phân lập giúp đánh giá chi tiết đặc điểm kháng kháng sinh của chúng theo từng nguồn thực phẩm. Theo đó, tất cả Salmonella phân lập từ thịt gà đều kháng kháng sinh (trừ CAZ). Không có chủng nào phân lập được từ thịt lợn và thịt bò đề kháng CIP. Salmonella có nguồn gốc từ ba nguồn thịt đều đề kháng AM, STR, C, TE và SXT, trong đó các chủng phân lập được từ thịt lợn có tỷ lệ đề kháng kháng sinh cao nhất. Toàn bộ các Salmonella phân lập được từ thịt bò đều nhạy cảm với CAZ, GN và CIP. Salmonella phân lập được từ thịt lợn đề kháng 11
AM, STR, và TE với tỷ lệ lớn nhất. Salmonella từ thịt gà đề kháng C nhiều nhất, đặc biệt là các chủng kháng CIP chỉ tìm thấy ở thịt gà. Thịt bò là mẫu ít nhiễm Salmonella nhất và các chủng này nhạy cảm với nhiều kháng sinh nhất 3.2.4. Kiểu hình kháng kháng sinh Từ kết quả kháng sinh đồ chúng tôi đã xác định được kiểu hình kháng kháng sinh của Salmonella nghiên cứu. Hai kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến là TE, STR, AM (2/9), và C, TE, SXT, STR, AM (3/9). Kiểu hình TE, STR, AM chỉ có ở Salmonella phân lập được từ thịt lợn. Hai kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến trong nghiên cứu này khác với kiểu hình kháng kháng sinh được công bố trong nghiên cứu của Miranda và CS, Kim và CS. Từ các kết quả trên có thể nhận định rằng kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến là khác nhau giữa các nghiên cứu. Việc xác định kiểu hình kháng kháng sinh ở các mẫu nghiên cứu là quan trọng. Kết quả kiểu hình này kết hợp với kết quả phân tích hệ gen sẽ cho biết các gen kháng kháng sinh, các đột biến liên quan đến kháng kháng sinh. Từ kết quả kiểu hình trên, chúng tôi đã thu được 9 Salmonella đa kháng, trong đó S. Typhimurium phổ biến nhất. Thịt lợn là nguồn phân lập được nhiều Salmonella đa kháng nhất (5 serovar), tiếp theo là thịt gà (3 serovar), ít nhất là thịt bò (1 serovar). Tỷ lệ kháng kháng sinh, tỷ lệ đa kháng, và kiểu hình kháng kháng sinh là khác nhau ở các nghiên cứu đã được công bố. Sự khác biệt này theo một số nhà nghiên cứu thì có thể là do lạm dụng kháng sinh trong điều trị và chăn nuôi, làm tăng áp lực chọn lọc lên vi khuẩn dẫn tới xuất hiện nhiều chủng Salmonella đa kháng kháng sinh khác nhau theo vùng địa lý. 12
3.3. Kết quả phân tích các nhóm gen ở một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh Giải trình tự hệ gen phiên mã hiếm khi được sử dụng để xác định các gen kháng kháng sinh ở vi khuẩn. Thay vào đó, người ta thường sử dụng giải trình tự DNA toàn bộ hệ gen. Việc giải trình tự hệ gen phiên mã cho phép nghiên cứu chức năng của các gen tốt hơn so với giải trình tự DNA. Trong nghiên cứu này chúng tôi muốn tập trung nghiên cứu hệ gen chức năng của vi khuẩn. Điều này là quan trọng vì các gen không cần thiết sẽ không biểu hiện và có xu hướng mất đi hoặc bị thoái biến. Hơn nữa kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen không phân biệt được các gen đã bị bất hoạt trong hệ gen và các chức năng liên quan khác của gen đó. Ngoài ra, theo chúng tôi thì gen biểu hiện sẽ có mối liên quan với kiểu hình, cụ thể ở đây là kiểu hình kháng kháng sinh cao hơn so với gen không biểu hiện. Chúng tôi đã thực hiện giải trình tự hệ gen phiên mã của Salmonella đa kháng kháng sinh giống như phương pháp mà tác giả Marcelino và cộng sự đã công bố (tác giả cũng giải trình tự hệ phiên mã của vi khuẩn trong ruột chim để xác định các gen kháng kháng sinh). Một điều hết sức quan trọng là các gen kháng kháng sinh cũng biểu hiện ở vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh trong điều kiện nuôi cấy thông thường. Do đó trong nghiên cứu này chúng tôi không sử dụng chủng nhạy cảm với kháng sinh để đối chiếu. Thay vào đó chúng tôi sử dụng chính kiểu hình nhạy cảm và đề kháng với từng loại kháng sinh ở các chủng để tham chiếu với nhau. Từ đó rút ra dự đoán gen nào, hoặc đột biến nào có thể liên quan đến kháng kháng sinh ở vi khuẩn này. Để phân tích các nhóm gen ở Salmonella đa kháng, một số serovar đa kháng cần được lựa chọn để giải trình tự toàn bộ hệ gen 13
phiên mã. Tuy nhiên, trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi chỉ lựa chọn 6 chủng theo tiêu chí tỷ lệ nhiễm cao, đề kháng nhiều kháng sinh và theo nguồn phân lập, gồm S. Derby, S. Give, S. Indiana, S. Typhimurium S384, S. Typhimurium S360, và S. Typhimurium S181. Sau khi tách RNA từ 6 mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng bằng đo nồng độ và OD260/280, kết hợp với điện di. Kết quả cho thấy các mẫu RNA này đều đạt yêu cầu. Mẫu này sau đó được chuyển thành cDNA và kiểm tra độ toàn vẹn và cho thấy giá trị RIN (RNA Integrity Number) đều trên 8,0, đạt yêu cầu để giải trình tự. Kết quả thu được như sau: 3.3.1. Số lượng trình tự đọc (read) Từ kết quả trình tự thô chúng tôi tiến hành tinh sạch bằng phần mềm Trimmomatic: Tổng số có 160.043.486 read, tổng số lượng các read có điểm Q20 là 146.080.642. Số lượng read nhiều nhất là ở Sal 4 và ít nhất là ở Sal 6. Các trình tự read có điểm chất lượng Q20 sẽ được sử dụng để lắp ráp de novo và sử dụng cho các phân tích tiếp theo. 3.3.2. Lắp ráp de novo Kết quả lắp ráp de novo cho thấy kích thước hệ gen phiên mã dao động từ 4,69 Mb (Sal 4) đến 5,1 Mb (Sal 11), giá trị GC dao động quanh 52%, giá trị N50 cao và L50 thấp. Kết quả này tương tự với kết quả giải trình tự toàn bộ hệ gen của S. Derby 07CR553 công bố bởi Kérouanton và cộng sự. Từ đó có thể kết luận là trình tự của 6 mẫu nghiên cứu có chất lượng tốt, đủ điều kiện cho các phân tích tiếp theo. 3.3.3. Chú thích chức năng các gen Để hạn chế việc bỏ sót các gen, nhiều công cụ phân tích gen đã được sử dụng. Số lượng các gen phát hiện được ở các công cụ này là khác nhau. Kết quả phát hiện các gen của các công cụ này khác nhau là do phương pháp phân tích của chúng khác nhau, và hiện chưa có 14
một phương pháp chuẩn, thống nhất trong việc chú thích các gen được chấp nhận trên thế giới. Số lượng các trình tự mã hóa tìm được bởi các cơ sở dữ liệu khác nhau được trình bày trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Trình tự mã hóa ở 6 mẫu nghiên cứu Số lượng các trình tự mã hóa Cơ sở dữ liệu Sal 4 Sal 6 Sal 7 Sal 8 Sal 11 Sal 12 RAST 4.807 4.917 5.154 5.097 5.357 5.000 PATRIC 4.807 4.917 5.154 5.049 5.357 5.000 BASys 4.973 5.100 5.336 5.253 5.566 5.209 Genious R11 4.400 4.513 5.022 5.207 5.304 5.309 Năm 2017, Baek và cộng sự công bố rằng có nhiều gen kích thước nhỏ, mã hóa cho protein có chiều dài dưới 100 amino acid không phát hiện được khi chú thích hệ gen của vi khuẩn. Do đó, cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về các gen trên trong các mẫu nghiên cứu. 3.3.4. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella nghiên cứu Ngoài housekeeping gen…Chúng tôi đã xác định được các nhóm gen quan trọng biểu hiện ở các Salmonella đa kháng như sau: 3.3.4.1. Nhóm gen kháng kháng sinh Kết quả tóm tắt các gen kháng kháng sinh và kiểu hình kháng kháng sinh được trình bày trong bảng 3.4. Theo đó, tổng số có 107 gen kháng kháng sinh (danh sách các gen không được trình bày trong tóm tắt này). Bao gồm 22 gen kháng kháng sinh nhóm β-lactam, 46 gen kháng aminoglycoside, 8 gen kháng quinolone, 7 gen kháng phenicol, 6 gen kháng cycline, 3 gen kháng sulfonamide, 3 gen kháng trimethoprim. Ngoài ra chúng tôi còn phát hiện được 12 gen kháng kháng sinh nhóm macrolides, rifamycin, fosfomycin, lincosamide, polymyxin, và peptide. Số lượng và sự đa dạng trong các gen kháng 15
kháng sinh ở nghiên cứu này tương tự như kết quả nghiên cứu của tác giả Saskia (2018). Tổng số 42 kiểu hình được tạo ra từ kết quả kháng sinh đồ. Có 29 kiểu hình kháng kháng sinh có biểu hiện của các gen kháng kháng sinh. Có 12 kiểu hình nhạy cảm kháng sinh có biểu hiện của gen kháng kháng sinh. Chỉ có duy nhất một kiểu hình nhạy cảm là không có biểu hiện của gen kháng kháng sinh đó là Sal 6 nhạy cảm với kháng sinh SXT và không có biểu hiện của gen kháng kháng sinh nào. Như vậy, sự phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình là (29+1)/42 = 71,4%. Và sự không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình kháng kháng sinh là 12/42 = 28,6%. Tỷ lệ phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình này tương tự với kết quả nghiên cứu của tác giả Owen và cộng sự, 2017 (72,7%). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với các kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác như McDermott và CS, 2016 (99%), Zankari và CS 2013 (99,74%). Sự không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình trong nghiên cứu này có thể giải thích là do các gen kháng kháng sinh biểu hiện ở mức độ chưa đủ, do có nhiều cơ chế kháng kháng sinh cùng tham gia kháng một loại kháng sinh, do các cơ chế kháng kháng sinh khác chưa được tìm ra. 16
Bảng 3.4. Kết quả tóm tắt các gen kháng kháng sinh và kiểu hình kháng kháng sinh ở các mẫu nghiên cứu KS Mẫu nghiên cứu (Kiểu hình kháng kháng sinh/gen kháng kháng sinh) Sal 4 Sal 6 Sal 7 Sal 8 Sal 11 Sal 12 (R) (R) (R) (R) (R) (R) AM blaOXA-1 blaTEM blaTEM family blaTEM family blaTEM family blaTEM family blaTEM family, PBPE** family PBPE** PBPE** PBPE** (R) (S) (S) (S) (R) (S) aac family* aac(6')-Iy aac (6')-Iy, aac6-Iy, aac (6')-Iaa, aac3-IIa, aac family* aac(6')-Iaa, aac6- GN aph family* kdpE aadA8, aadA17; aadA17, aadA8b aph family* Iaa, aph(6)-Id, ant family*, kdpE kdpE aph3-IIa, kdpE kdpE aph(3'')-Ib strA, strB, kdpE (R) (R) (R) (R) (R) (R) STR aac family* aac(6')-Iy aac (6')-Iy, aac6-Iy aac (6')-Iaa, aac3-IIa aac family* aac(6')-Iaa, aac6-Iaa aph family* kdpE aadA8, aadA17 aadA17, aadA8b aph family* aph(6)-Id, aph(3'')-Ib ant family*, kdpE kdpE aph3-IIa, kdpE kdpE strA, strB, kdpE (R) (S) (S) (S) (S) (S) CIP aac(6')Ib-cr, gyrA, gyrA, gyrB, qnr-S1, qnr-S3, qnrS1, qnr-S3, qnr-S5, gyrA, gyrB, parC gyrA, gyrB, parC gyrB, parC parC gyrA, gyrB, parC, gyrB, parC parE (R) (S) (R) (R) (R) (S) C floR, cmlA1, catB3, floR, cmlA1 floR, cmlA1, cmlA5, floR, cmlA1, cmlA5, floR, cmlA1 cmlA1 catB4, catB8 cat2 cat2 (R) (R) (R) (R) (R) (R) TE tet(A), tet(R) tet(A), tet(A), tet(M), tet(A), tet(B), tet(C), tet(A), tet(B), tet(A) et(M), tet(S) tet(R), tet(S) tet(M), tet(R), tet(S) tet(C), tet(R) SXT (R) (S) (R) (R) (R) (S) sul1, sul2, dfrA12 sul2, sul3, dfrA12 sul2, sul3, dfrA12 sul2, dfrA14, dfrA5 sul2 Chú thích: *Aac (Acetylation) family; Aph (Phosphorylation) family; Ant (Adenylylation) family; ** Penicillin Binding Protein E. coli. KS (kháng sinh), AM (ampicillin), GN (gentamycin), STR (streptomycin), CIP (ciprofloxacin), C (chloramphenicol), TE (tetracyclin), SXT (sulfamethoxazol/trimetoprim). 17
3.3.4.2. Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone Kháng sinh nhóm quinolone được sử dụng phổ biến trong điều trị nhiễm Salmonella ở người. Đối với Salmonella có nguồn gốc thực phẩm, đề kháng quinolone được quan tâm nhất và đã được đề cập đến trong danh sách các kháng sinh quan trọng nhất của WHO trong lĩnh vực y học năm 2016. Một trong những cơ chế đề kháng quinolone ở Salmonella là do đột biến các gen gyrA, gyrB và parC. Dó đó, chúng tôi tiến hành tìm đột biến của các gen trên, kết quả được trình bày trong bảng 3.5. Bảng 3.5. Kết quả xác định đột biến gen kháng kháng sinh nhóm quinolone Kết quả Đột biến gen Mẫu KSĐ gyrA parC parE Sal 4 Đề kháng S83F;D87G T57S; S80R; T255S; A628S Sal 6 Nhạy cảm T57S; T255S; N395S Sal 7 Nhạy cảm S83Y T57S; T255S; A352V S592N Sal 8 Nhạy cảm T255S; N395S; S469A; A620T Sal 11 Nhạy cảm T255S; N395S; S469A; A620T Sal 12 Nhạy cảm T255S; N395S; S469A; A620T Chú thích: A (Alanine), N (Asparagine), R (Arginine), S (Serine), T (Threonine), V (Valine), KSĐ (Kháng sinh đồ). Kết quả bảng 3.5 cho thấy, đã xác định được các đột biến: S83F, S83Y, D87G, S80R, T57S, T255S, N395S, S469A, A620T, A628S, S592N. Tính đến thời điểm hiện tại, chưa có công bố nào về các đột biến A628S, T255S, N395S, S469A, và A620T. Tuy nhiên, các đột biến T255S, N395S, S469A, A620T lại xuất hiện ở các chủng nhạy cảm với CIP là Sal 6, Sal 7, Sal 8, Sal 11, và Sal 12 chứng tỏ các 18