Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật multiplex PCR trên các bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết đề tài Bacillus anthracis và Yersinia pestis là hai loài vi khuẩn gây bệnh tối nguy hiểm tương ứng là bệnh than và dịch hạch, từng gây nên nỗi kinh hoàng trong lịch sử loài người, có thể bị lợi dụng làm vũ khí sinh học. Ở Việt Nam, B. anthracis còn xuất hiện rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc, trong khi Y. pestis vẫn tồn tại trên một số loài gặm nhấm ở khu vực Tây Nguyên và có thể bùng phát thành dịch bất kỳ lúc nào. Mặt khác, chúng ta cần có phương án ứng phó nhanh, kịp thời trong phòng chống khủng bố sinh học. Trong một vụ tấn công nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu môi trường nghi nhiễm các mầm bệnh này, việc phát hiện nhanh, chính xác tác nhân sinh học là một trong những yếu tố quyết định đến sức khỏe cộng đồng và an ninh quốc gia. Việc sàng lọc nhanh những mẫu nghi ngờ giúp kiểm soát sự lây lan và đảm bảo điều trị chính xác. Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là “tiêu chẩn vàng” trong xác định B. anthracis và Y. pestis. Tuy nhiên, mặc dù có độ nhạy cao, phương pháp này đòi hỏi thời gian 2 3 ngày, một số trường hợp độ đặc hiệu không cao, cần tiến hành các thử nghiệm bổ sung. Ngoài ra, phương pháp này cần tiến hành ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 3 (BSL3) với nhân viên được đào tạo và có kinh nghiệm. Các phương pháp miễn dịch được nghiên cứu dưới dạng các que thử nhanh rất thuận tiện nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu thấp. Do đó, các phương pháp này khó ứng dụng trong chẩn đoán trên thực địa và phòng chống khủng bố sinh học. Hiện nay, đã có một số kỹ thuật dựa trên PCR dùng để xác định nhanh và chính xác B. anthracis cũng như Y. pestis được phát triển với những ưu điểm nổi bật như độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể thực hiện với các mẫu đã bất hoạt (nên chỉ cần thực hiện ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 2). Tuy nhiên, hầu hết các kỹ thuật này chỉ phát hiện một loại plasmid độc lực với từng tác nhân nên không phát hiện được các trường hợp chủng thiếu một trong các plasmid trên. Đối với B. anthracis trong tự nhiên, để chẩn đoán chính xác những chủng gây bệnh, ngoài gen đặc trưng trên nhiễm
sắc thể, cần chỉ ra được sự có mặt đầy đủ của hai plasmid độc lực là pXO1 và pXO2. Trong thực tế có những chủng B. anthracis thiếu một trong hai plasmid trên nên khả năng gây bệnh thay đổi. Tương tự, Y. pestis chứa hai plasmid liên quan đến tính độc là pPCP1 và pMT1 với các gen đặc trưng tương ứng. Do đó, các kỹ thuật này có thể không đánh giá được đầy đủ tình trạng độc lực của B. anthracis, Y. pestis và phải phụ thuộc vào thiết bị chuyên dụng đắt tiền nhưng vẫn có thể bỏ sót chẩn đoán, chưa đề cập đến là chúng có thể không phù hợp với một số chủng trong nước. Ở Việt Nam, việc sử dụng các kỹ thuật dựa trên PCR để chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis đã được một số tác giả công bố, tuy nhiên những nghiên cứu này chỉ mới dừng ở việc thiết kế kỹ thuật PCR để chẩn đoán từng loại vi khuẩn trên. Điều này có nghĩa là trong thực tế khi bệnh dịch xảy ra mà chưa biết tác nhân nào được sử dụng, nếu dùng PCR với tác nhân thứ nhất cho kết quả âm tính thì phải dùng PCR lần thứ hai với tác nhân khác, như vậy đòi hỏi thời gian và kinh phí. Do đó, kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR mPCR) có thể xác định chính xác đồng thời hai loại tác nhân B. anthracis và Y. pestis là một lựa chọn khả thi. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật multiplex PCR trên các bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập. 3. Nội dung nghiên cứu của đề tài Thiết kế các cặp mồi cho kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis.
Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR chẩn đoán đồng thời B. anthracis và Y. pestis trong phòng thí nghiệm và các chủng phân lập. Phân tích trình tự các gen đích đặc trưng và gen độc lực của các chủng B. anthracis và Y. pestis. 4. Đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Kỹ thuật multiplex PCR với 6 cặp mồi được thiết kế, tối ưu cho phép khuếch đại đồng thời 7 sản phẩm bao gồm: 3 gen đích là vrrA (thuộc nhiễm sắc thể), pagA (thuộc plasmid pXO1), capA (thuộc plasmid pXO2) của B. anthracis; và 3 gen đích là ypo2088 (thuộc nhiễm sắc thể), pla (thuộc plasmid pPCP1), caf1 (thuộc plasmid pMT1) của Y. pestis, cùng 1 gen chứng nội tại là plasmid tái tổ hợp để xác minh kết quả chẩn đoán. Do đó, khắc phục được hiện tượng dương tính giả đối với trường hợp các chủng vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis không đầy đủ độc lực, phân biệt với chủng gây bệnh, giúp giảm giá thành chẩn đoán so với việc phải thực hiện các lần PCR riêng rẽ, rút ngắn thời gian chẩn đoán. 5. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 139 trang, được chia thành các phần: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (30 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (47 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả (21 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Các công trình đã công bố của tác giả (1 trang). Tóm tắt nội dung luận án bằng tiếng Anh (6 trang), Tài liệu tham khảo (15 trang). Luận án có 16 bảng biểu, 44 hình và 151 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo các tài liệu trong và ngoài nước về 3 vấn đề chính: (1) Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis: đặc điểm sinh học, hệ gen cũng như sự liên quan giữa B. anthracis, Y. pestis và vũ khí sinh học; (2) Các phương pháp xác định B. anthracis và Y. pestis: các phương pháp vi sinh truyền thống, xác định sinh hóa, dựa trên ái lực và các phương pháp dựa trên axit nucleic; (3) Kiểm định kit mPCR chẩn đoán. B. anthracis là trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus gồm các vi khuẩn Gram dương sinh bào tử, đa số không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (Bacillus cereus), một số có lợi cho con người ( Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides). Đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý, sinh hoá, tính chất nuôi cấy của các loài thuộc chi Bacillus rất giống nhau. Tuy nhiên, B. anthracis có đặc điểm khác biệt với các loài trực khuẩn hiếu khí sinh bào tử khác, đo la co ́ ̀ ́ plasmid pXO1 ma hoa khang nguyên b ̃ ́ ́ ảo vệ va pXO2 mã hoá vo. ̀ ̉ Y. pestis thuộc chi Yersinia, họ Enterobacteriaceae. Chi Yersinia có 11 loài, là các vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử. Trong chi Yersinia, chỉ có ba loài gây bệnh ở người là Y. pestis, Yersinia pseudotuberculosis và Yersinia enterocolitica (Radnedge, 2001). Loài nguy hiểm nhất, Y. pestis gây bệnh dịch hạch và viêm phổi cấp tính. Vũ khí sinh học hiện nay đã trở thành mối quan tâm hàng đầu của an ninh quốc gia bởi có thể bị các tổ chức khủng bố lợi dụng trong chiến tranh sinh học. Trong các tác nhân đã được WHO và
CDC nêu ra, B. anthracis, Y. pestis được đánh giá là tác nhân có nguy cơ cao nhất trong khủng bố vì gây bệnh nguy hiểm, dễ nuôi cấy, tăng sinh khối với số lượng lớn, không cần trang bị hiện đại lại dễ sử dụng, vận chuyển và gây nhiễm. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về phòng chống chiến tranh sinh học đề phòng các tình huống địch tấn công bằng vũ khí sinh học. Sự quan tâm được đặt ở mức đặc biệt với hai loại vi khuẩn là B. anthracis và Y. pestis. Xác định tầm quan trọng của việc xác định nhanh và chính xác hai loại vi khuẩn này, đề tài KCB 0109 và một số đề tài đã thiết kế các phản ứng PCR chẩn đoán cho từng loại tác nhân. Năm 2005, Lê Thanh Hòa và cs. đã nghiên cứu xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh Y. pestis trên các loại môi trường giả định. Tuy nhiên, công trình chỉ dừng lại ở việc khẳng định Y. pestis thông qua một đoạn gen duy nhất trên plasmid gây độc là pPCP1 (Lê Thanh Hòa, 2005). Trên thực tế, một số chủng Y. pestis plasmid pPCP1 có thể bị mất đi thì sản phẩm của nghiên cứu này sẽ không áp dụng được (Marston, 2005). Hay nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ từ chủng B. anthracis VCM1167 (Phạm Thúy Kiều, 2006). Như vậy, có thể nói các đề tài về B. anthracis và Y. pestis ở Việt Nam hiện nay còn ít và riêng lẻ cho từng loại tác nhân. Do đó, việc nghiên cứu phát triển kỹ thuật mPCR xác định nhanh và chính xác đồng thời hai tác nhân nguy hiểm này là cấp thiết, đáp ứng yêu cầu an ninh quốc phòng và phòng chống dịch bệnh. Kỹ thuật mPCR được phát triển nhằm xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis một cách chính xác hơn bằng việc sử dụng cặp mồi thiết kế trên nhiễm sắc thể, đồng thời cũng sử dụng các cặp mồi để phát hiện các gen độc lực trên plasmid. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
Các chủng vi khuẩn, plasmid Chủng chuẩn B. anthracis 17JB (ký hiệu: Ba) và Y. pestis SVCM7 (ký hiệu: Yp) đầy đủ độc lực. Chủng chuẩn đối chứng âm: Bacillus cereus ATCC 6464, E. coli ATCC 25922, Y. enterocolitica ATCC 27729. Các chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ B. anthracis: gồm 23 chủng B. anthracis Ba1Ba23; 2 chủng Y. pestis Yp1, Yp2. Plasmid pJET1.2capA chứa toàn bộ trình tự gen capA (thuộc plasmid pXO1) của B. anthracis. Sinh phẩm, hoá chất, thiết bị: Sinh phẩm, hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm được đặt mua từ các hãng: Thermo Scientific, Integrated DNA Technologies IDT, Qiagen, Norgen, bioMérieux, Biolabs, Gibco, Invitrogen. Các trang thiết bị Bộ môn Vi sinh y học, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực nghiệm mô tả, phân tích trong phòng thí nghiệm và trên thực địa với các kỹ thuật vi sinh kinh điển và sinh học phân tử. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu gồm: 2.2.1. Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 2.2.2. Tách chiết DNA tổng số 2.2.3. Khuếch đại gen bằng PCR 2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose 2.2.5. Tinh sạch DNA 2.2.6. Thiết kế kỹ thuật mPCR xác định đồng thời gen đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis 2.2.7. Tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis 2.2.8. Thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp của kỹ thuật mPCR 2.2.9. Tối ưu kỹ thuật mPCR chứa chứng nội tại 2.2.10. Thiết lập và đánh giá bộ mẫu chuẩn đánh giá độ nhạy, đặc hiệu và ổn định của kit mPCR
2.2.11. Xác định các chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh 2.2.12. Thử nghiệm kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập 2.2.13. Kiểm tra các chủng vi khuẩn bằng giải trình tự Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis 3.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR Kỹ thuật mPCR ly t ́ ưởng đê ̉ xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis phải được thiêt kê phat hiên đông th ́ ́ ́ ̣ ̀ ơì B. anthracis, Y. pestis và đánh giá đầy đủ các mức độ độc lực khác nhau của chúng trong tự nhiên. Trong đó, với B. anthracis cần 1 cặp mồi trên nhiễm sắc thể (lựa chọn gen vrrA) và 2 cặp mồi trên plasmid pXO1 và pXO2 tương ứng là gen pagA và capA. Tương tự, với Y. pestis, gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể), pla (pPCP1) và caf1 (pMT1) được lựa chọn. Như vậy, 6 cặp mồi đặc hiệu cho mPCR được thiết kế đảm bảo khuếch đại 6 gen đích kích thước khác nhau. Với gen vrrA, dựa vào trình tự tham chiếu trên NCBI, đã thiết kế được 5 cặp mồi cho khuếch đại một phần trình tự gen đích (Hình 3.2). Cặp mồi gen vrrA chưa được lựa chọn ngay bởi còn phụ thuộc vào kết quả thiết kế các cặp mồi cho 5 gen đích còn lại. Tương tự cho thiết kế các cặp mồi gen pagA, capA (B. anthracis) và ypo2088, pla, caf1 (Y. pestis). Sau khi kiểm tra về khả năng hình thành cấu trúc bậc 2 hay bắt cặp chéo giữa các mồi cũng như sự phù hợp về kích thước sản phẩm, 6 cặp mồi đã được lựa chọn. vrrA
Hình 3. 2. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen vrrA Bảng 3. 1. Thông tin 6 cặp mồi của mPCR xác định B. anthracis và Y. pestis Tổng số Kích thước Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tm* base (bp) CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA-F 59.76 vrrAF1/R1 20 222 CCTCGCGCACTTCTTTTTCT-R 59.13 AAATGGAGCACGGCTTCTGA-F 59.96 pagAF1/R1 20 751 AGCCTGTATCCACCCTCACT-R 59.96 TGACGATGACGATGGTTGGT-F 59.39 capAF1/R1 20 610 GCTTCCTGTCTAGGACTCGG-R 59.26 GGATGAGATAACGCGGGTGT-F 59.90 ypoF1/R1 20 103 AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R 59.90 CGGGATGCTGAGTGGAAAGT-F 60.04 plaF1/R1 20 438 ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R 60.11 CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F 60.25 cafF1/R1 20 271 GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R 59.69 *Tm. Nhiệt độ nóng chảy 3.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR Kỹ thuật mPCR được thiết kế và đánh giá trên 2 chủng chuẩn có đầy đủ độc lực là B. anthracis Ba và Y. pestis Yp cùng đối chứng âm là B. cereus và E. coli, Y. enterocolitica. 3.1.2.1. PCR đơn mồi phát hiện gen vrrA, pagA, capA của B. anthracis Để có cơ sở cho thiết kế kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen đích B. anthracis, PCR đơn mồi được thực hiện ban đầu giúp kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm và độ đặc hiệu từng cặp mồi.
Hình 3. 8. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích pagA, vrrA, capA của B. anthracis Ba bằng PCR đơn mồi ĐC(). Đối chứng âm là nước khử ion; M. Marker 100 bp (Thermo Scientific) Các gen pagA (751 bp), vrrA (222 bp) và capA (610 bp) đều xuất hiện băng đặc hiệu và không có băng phụ (Hình 3.8). Như vậy, nồng độ các thành phần, chu trình nhiệt trong PCR đơn mồi này sẽ được sử dụng cho mPCR tiếp theo. 3.1.2.2. Kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen vrrA, pagA, capA của B. anthracis Kỹ thuật mPCR đã khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B. anthracis. 3.1.2.3. PCR đơn mồi phát hiện gen ypo2088, pla, caf1 của Y. pestis PCR đơn mồi cho Y. pestis được thực hiện tương tự, sản phẩm là pla (438 bp), caf1 (271 bp), ypo2088 (103 bp) (Hình 3.10). Hình 3. 10. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích pla, caf1, ypo của Y. pestis Yp bằng PCR đơn mồi ĐC(). Đối chứng âm là nước khử ion; M. Marker 100 bp (Thermo Scientific) 3.1.2.4. Kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen ypo2088, pla, caf1 của Y. pestis Kỹ thuật mPCR đã khuếch đại đồng thời 3 gen đích của Y. pestis. 3.1.2.5. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và từng tác nhân
Để kiểm tra các cặp mồi của tác nhân này có bắt cặp chéo với DNA tác nhân còn lại, kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 1 khuôn hoặc DNA B. anthracis hoặc Y. pestis được thực hiện. Đường chạy Yp với khuôn là DNA Y. pestis chỉ xuất hiện 3 băng đích của Y. pestis. Tương tự, đường chạy Ba chỉ xuất hiện 3 băng đích của B. anthracis (Hình 3.12). Như vậy, các cặp mồi đã được thiết kế đặc hiệu cho B. anthracis, Y. pestis và không có hiện tượng bắt cặp chéo. bp ĐC(-) Yp Ba M bp Hình 3. 12. Sản phẩm PCR với 6 cặp mồi, từng loại DNA khuôn ĐC(). Đối chứng âm là nước khử ion; Yp. Sản phẩm mPCR với khuôn DNA Y. pestis; Ba. Sản phẩm mPCR với khuôn DNA B. anthracis; M. Marker 100 bp (Thermo Scientific) 3.1.2.6. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 tác nhân Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 loại khuôn chỉ thu được 3 băng đích của Y. pestis. 3.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis Cần tối ưu các thông số của mPCR để đảm bảo xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis như: nồng độ mồi, đệm, MgCl2, dNTPs cũng như các điều kiện về chu trình nhiệt để thu được đồng thời 6 băng sản phẩm đích đặc hiệu. Nồng độ các mồi Y. pestis 0,1 μM và B. anthracis 0,6 μM là tối ưu trong mPCR (Hình 3.14).
Hình 3. 14. Tối ưu nồng độ mồi của mPCR M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1. 0,1 μM; 2. 0,2 μM; 3. 0,4 μM; 4. 0,6 μM Với nhiệt độ gắn mồi 56oC, nông đô ̀ ̣ MgCl2 và dNTPs tối ưu tương ứng la ̀0,6 mM và 0,25 mM, phan ̉ ưng mPCR cho kêt qua ́ ́ ̉ 6 băng đặc hiệu rõ nét nhất. Nồng độ dung dịch đệm được khảo sát ở 4 mức là (1; 1,2; 1,4; 1,5X), và nông đô 1,2X ̀ ̣ được lựa chọn. 3.1.4. Nghiên cứu thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong kỹ thuật mPCR Trong chẩn đoán phân tử, chứng nội tại (Internal amplification control IC) là rất cần thiết để loại trừ các trường hợp âm tính giả do quá trình tách chiết không hiệu quả hay những chất ức chế ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR. Do đó, song song với việc thiết kế mPCR, chúng tôi đã thiết kế IC cho mPCR, đảm bảo kết quả chẩn đoán là chính xác bằng con đường tái tổ hợp. Quá trình tạo dòng IC đạt được kết quả như sau: một đoạn gen lef (IC1) phân lập từ B. anthracis bằng cặp mồi IC1FBamHI/RNdeI, tạo dòng phụ trong vector pJET1.2blunt, kiểm tra vector pJET1.2IC1 tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc (Hình 3.18). Cặp enzyme BamHI và NdeI được sử dụng cắt đồng thời các vector pJET1.2IC1 và pJET1.2capA. Đoạn IC1 (0,65 kb từ pJET1.2IC1) và phần còn lại của vector pJET1.2capA (~4 kb) được tinh sạch gel, nối ghép tạo thể tái tổ hợp pJET1.2capAIC1. Plasmid này được kiểm tra bằng enzyme giới hạn và giải trình tự. Plasmid này chứa trình tự nhận biết của cặp mồi capAF1/R1 nên cũng được khuếch đại trong mPCR, cho sản phẩm kích thước 1000 bp phân biệt với sáu sản phẩm của gen chẩn đoán.
Hình 3. 18. Phân lập gen lef bằng cặp mồi IC1FBamHI/RNdeI và tạo dòng phụ trong vector pJET1.2/blunt a) Sản phẩm khuếch đại gen lef (IC1) trên gel agarose 1,2%; M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1. Sản phẩm khuếch đại gen lef. b) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1,2%, M. Marker 1 kb (Thermo Scientific); 13. Các dòng khuẩn lạc 13 Hình 3. 20. Kiểm tra mPCR bổ sung chứa vector tái tổ hợp pJET1.2IC1. IC trong quá trình tách chiết DNA ở các nồng độ khác nhau với mẫu B. anthracis M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 109103. Các mức nồng độ IC tương ứng. Để kiểm soát toàn bộ các công đoạn của xét nghiệm, IC được bổ sung vào trong quá trình tách chiết với một lượng tối thiểu có thể phát hiện được nhằm loại bỏ tối đa sự ảnh hưởng đến hiệu quả tách chiết cũng như mPCR. Kết quả trên cho thấy, băng chứng nội tại (1 kb) xuất hiện rõ ở các mức nồng độ plasmid từ 109105 copy/ mẫu. Ở mức nồng độ IC là 106105 copy/ mẫu xuất hiện đầy đủ 3 băng đích của B. anthracis và băng IC. Trong đó, băng IC xuất hiện rõ nét, không bị smear và quan trọng hơn, băng đích capA cũng xuất hiện. Còn mức nồng độ IC là 104 và 103 copy không còn xuất hiện băng IC (Hình 3.20). Qua quá trình tối ưu trên các mẫu B. anthracis, Y. pestis, mPCRIC cho các băng đích rõ nét, tách biệt gồm 6 băng cho xác định B. anthracis và Y. pestis và 1 băng IC. Có thể thấy rằng, mức nồng độ IC 5x104copy/ mẫu cho các băng rõ nét nhất và đây chính là nồng độ được lựa chọn sau khi tối ưu lại nồng độ của cặp mồi capAF1/R1 (0,64 µM), các thông số khác của mPCR đã tối ưu ban đầu cơ bản vẫn giữ nguyên (Hình 3.21). Như vậy, đã thiết kế thành công kỹ thuật mPCRIC tại xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Chu trình nhiệt: Biến tính 94oC/4 phút, 32 chu kỳ (94oC/1 phút; 56oC/45 giây; 72oC/50 giây), 72oC/10 phút.
Hình 3. 21. Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung IC ở các nồng độ 105 và 5x104 copy M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1, 2. Mẫu Y. pestis; 3, 4. Mẫu B. anthracis và Y. pestis; 5, 6. Mẫu B. anthracis. 3.1.5. Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis Sau khi xây dựng được quy trình kỹ thuật mPCR, chúng tôi đã tiến hành chế tạo master mix theo thành phần tối ưu. Bước đầu đã chế tạo 1000 test, 50 test/bộ, bảo quản ở điều kiện 20oC cho đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện, độ ổn định của kit mPCR theo thời gian và thử nghiệm trên các chủng phân lập (Ký hiệu kit BaYpmPCR) (Hình 3.22). Hình 3. 22. Master mix mPCR được đóng gói kèm hướng dẫn sử dụng 3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP
3.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy của kit mPCR Ngưỡng nồng độ DNA tối thiểu có thể phát hiện được bằng PCR là thông số cần khảo sát trước khi xây dựng bộ mẫu chuẩn độ nhạy. Mẫu gốc DNA được tách chiết, tinh sạch đạt nồng độ 120 ng/µl, từ mẫu này pha loãng trong nước khử ion. B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 M ĐC(-) Hình 3. 23. Xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis M. Marker 50 bp; B50B59. các mức nồng độ DNA; ĐC(). Đối chứng âm Mẫu có nồng độ DNA thấp nhất còn cho khả năng phát hiện được là B55 (mã số gốc PBA19) (Hình 3.23), nồng độ 0,000092 ng/µl tương đương 81,5 copy/ phản ứng mPCR sử dụng 5 µl DNA. Với kết quả xác định ngưỡng của mPCR phát hiện B. anthracis như trên, tiến hành thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EB1 đến EB10) x 10 cột. Sử dụng 10 mức nồng độ ở bộ mẫu chuẩn xác định ngưỡng mPCR phát hiện B. anthracis từ PBA10 (0,046875 ng/µl) PBA19 (0,000092 ng/µl) tương ứng ký hiệu EB1 EB10. Tương tự, ngưỡng phát hiện của bộ mẫu chuẩn Y. pestis là 130,5 copy/ phản ứng. Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định Y.
pestis cũng được thiết lập gồm 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EY1 đến EY10) x 10 cột. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu chẩn đoán của kit mPCR Các bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu mPCR đối với B. anthracis được thiết lập tương tự với các bộ mẫu chuẩn độ nhạy, sử dụng chủng B. cereus. Tương tự, sử dụng chủng E. coli và Y. enterocolitica cho Y. pestis. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis Để thuận tiện cho việc đánh giá nội bộ, sau khi thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy và đặc hiệu xác định từng tác nhân, chúng tôi tiến hành phối trộn các bộ mẫu chuẩn riêng rẽ tương ứng để tạo các bộ mẫu chuẩn hỗn hợp đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Đánh giá kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis trên bộ mẫu chuẩn Khả năng phát hiện B. anthracis của bộ kit mPCR được kiểm tra trên 100 mẫu (từ mẫu EB1 đến EB10, mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis cho kết quả là 100% các mẫu đều phát hiện đầy đủ các gen đặc trưng của B. anthracis. Tương tự cho đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR đối với Y. pestis, đồng thời B. anthracis và Y. pestis đều cho kết quả 100%. Chúng tôi tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của kit BaYp mPCR trên 100 mẫu (từ C1 đến C10 mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu đã thiết lập từ B. cereus. Kết quả 100% các mẫu không xuất hiện gen đặc trưng capA, pagA của B. anthracis nhưng 100% các mẫu dương tính với gen vrrA. Với Y. pestis, độ đặc hiệu của bộ kit mPCR là 100%. ̀ ̉ Cac thanh phân cua kit BaYpmPCR co s ́ ̀ ́ ự ôn đinh trên 12 thang ̉ ̣ ́ ̉ ̉ ở điều kiện 20oC (Hình 3.32). bao quan
Hình 3. 32. Kiểm tra độ ổn định mPCR sau thời gian 12 tháng M. Marker 100 bp; 110. Các mẫu DNA EBY2 3.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi xác định đồng thời gen đặc trưng, gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis đã được thiết kế và tối ưu thành công trên chủng chuẩn. Việc đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn là trong điều kiện lý tưởng điều kiện tiên quyết cho bất kỳ bộ kit nào trước khi đưa ra thử nghiệm lâm sàng. Với các chủng lâm sàng B. anthracis cũng như Y. pestis, đặc biệt là các mẫu phân lập ngoài môi trường hay lưu trữ thời gian dài trong phòng thí nghiệm, một số tính chất về kiểu hình, kiểu gen có thể bị biến đổi. Do đó, để khẳng định việc thiết kế thành công kỹ thuật mPCR, các chủng phân lập B. anthracis và Y. pestis sau khi được kiểm tra, xác định bằng nuôi cấy, được xác định bằng kỹ thuật mPCR. Kết quả xác định của mPCR được khẳng định bằng phân tích trình tự toàn bộ chiều dài một số gen tiêu biểu trên nhiễm sắc thể, các plasmid độc lực. Xác định chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh Các chủng nghi ngờ B. anthracis và chủng chuẩn B. anthracis Ba (đối chứng dương) được nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu ở 37oC/CO2 5%/ 24 giờ. Kết quả, tất cả các chủng cho khuẩn lạc dạng R, màu xám, trực khuẩn Gram dương, hình vuông hai đầu, xếp đôi, chuỗi, bào tử ở giữa và không làm biến đổi hình dạng vi khuẩn, trong đó 11 chủng không tan máu β trên môi trường thạch máu cừu có 4 chủng hình thành vỏ ( B. anthracis Ba, Ba1, Ba3, Ba4). 13 chủng còn lại tan máu β. Định danh cho 11 chủng là B. anthracis, còn lại là B. cereus (ID > 90%). Chủng Y. pestis Yp1, Yp2 cho kết quả mọc các khuẩn lạc kích thước 1 2 mm dạng S,
màu xám đục, bờ đều, bề mặt nhẵn, trung tâm lồi giống hình trứng oplet và không tan máu, là trực khuẩn Gram âm nhỏ, oxydase (). Định danh là Y. pestis với ID Yp1, Yp2 lần lượt là 98,6 và 96,4%. Thử nghiệm kỹ thuật mPCR Kỹ thuật mPCR được thử nghiệm trên các mẫu nghiên cứu B. anthracis, Y. pestis và các mẫu đối chứng âm là B. cereus, E. coli. Mẫu hỗn hợp được tạo ra bằng cách trộn lẫn chủng B. anthracis và Y. pestis sau đó tiến hành tách DNA tổng số. Ở tất cả các mẫu đối chứng và mẫu thử nghiệm đều xuất hiện băng chứng nội tại IC, điều này chứng tỏ quá trình tách chiết DNA và mPCR đảm bảo, theo đó các kết quả xác định là đáng tin cậy (minh họa ở Hình 3.36). Mẫu đối chứng âm chỉ xuất hiện băng có kích thước khoảng 220 bp tương ứng với gen vrrA, ngoài ra không xuất hiện thêm băng nào khác. Điều này là phù hợp, vì đối chứng âm sử dụng chủng B. cereus, gen vrrA có mặt trong các loài nhóm “B. cereus”. Còn mẫu đối chứng dương xuất hiện cả 6 gen đích đối với cả 2 tác nhân (Hình 3.36a), hoặc xuất hiện 3 gen đích đối với từng tác nhân (Hình 3.36b).
(+) (-) M BY2 Yp1 Yp2 Ba4 M Ba5 Ba6 (+) (-) M Ba3 Ec Hình 3. 36. Xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis bằng kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội tại IC M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); a) (+). Đối chứng dương là hỗn hợp B. anthracis và Y. pestis; (). Đối chứng âm là hỗn hợp B. cereus và E. coli; BY2. Mẫu thử nghiệm hỗn hợp B. anthracis Ba4 và Y. pestis Yp2; Yp1. Y. pestis Yp1; Yp2. Y. pestis Yp2; Ba4. B. anthracis Ba4; Ba5. B. anthracis Ba5; Ba6. B. anthracis Ba6; b) (+). Đối chứng dương là mẫu B. anthracis Ba; (). Đối chứng âm B. cereus; Ba3. B. anthracis Ba3; Ec. E. coli Kết quả thử nghiệm kỹ thuật mPCR cho thấy, khi chỉ xuất hiện 1 băng có kích thước tương ứng với gen đích vrrA (mẫu Ba5 Hình 3.36a) hay không xuất hiện băng đích nào (mẫu Ec Hình 3.36b), được xác định là mẫu âm tính với B. anthracis và Y. pestis gây bệnh (tương ứng là mẫu B. anthracis Ba5 và E. coli). Cụ thể, kết quả Hình 3.36a, đường chạy ký hiệu BY2 xuất hiện đầy đủ 6 băng đích có kích thước đúng với mẫu đối chứng dương, được xác định là mẫu dương tính đồng thời với B. anthracis và Y. pestis có đầy đủ độc lực. Mẫu ký hiệu Yp1, Yp2, Ba4 (Hình 3.36a) và mẫu Ba3 (Hình 3.36b) xuất hiện đầy đủ 3 băng của các gen đích cho từng đối tượng, được xác định lần lượt là chủng Y. pestis và B. anthracis gây bệnh. Trong khi đó, đáng chú ý trên Hình 3.36a, mẫu Ba6 chỉ xuất hiện 2 băng có kích thước tương ứng với 2 gen đích là pagA và vrrA, không xuất hiện băng chỉ thị gen capA. Đây là mẫu B. anthracis bị thiếu plasmid pXO2, không đầy đủ độc lực
(chủng B. anthracis Ba6). Như vậy, trong 10 chủng phân lập B. anthracis, bằng kỹ thuật mPCR đã xác định được 3 chủng B. anthracis đầy đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1 chủng giảm độc do thiếu gen capA thuộc plasmid pXO2 (chủng B. anthracis Ba6), 6 chủng còn lại là B. anthracis không độc. Đồng thời với Y. pestis, kỹ thuật mPCR đã xác định được 2/2 chủng Y. pestis có đầy đủ gen độc lực. Để khẳng định kết quả, băng điện di đặc hiệu cho các gen đích chẩn đoán được tinh sạch gel và giải trình tự. Kết quả, tất cả các trình tự đều thuộc các gen đích tương ứng của B. anthracis và Y. pestis. Như vậy, kỹ thuật mPCR đã được thử nghiệm thành công trên chủng chuẩn và chủng phân lập. Phân tích trình tự gen đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis Kỹ thuật mPCR được phát triển ở trên chứa 6 cặp mồi xác định các đoạn ngắn trình tự bảo thủ của gen đích tương ứng. Tuy nhiên, mỗi gen đích có chiều dài khác nhau và phân bố ở các vị trí khác nhau. Cụ thể, với B. anthracis, gen đặc trưng vrrA thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pagA, capA thuộc plasmid pXO1, pXO2. Với Y. pestis, gen đặc trưng ypo2088 thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pla, caf1 thuộc plasmid pPCP1, pMT1. Để đánh giá kỹ thuật mPCR được phát triển, đồng thời nghiên cứu trình tự các gen đặc trưng và gen độc ở các chủng phân lập được ở Việt Nam có sự giống và khác nhau như thế nào với các chủng quốc tế, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự toàn bộ chiều dài gen độc lực và gen đặc trưng của B. anthracis và Y. pestis. Phân lập toàn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực Đối với B. anthracis, 7 gen vrrA, pagA, cya, lef, capA, capB, capC đã được nhân dòng cho xác định toàn bộ trình tự. Các gen này đã khuếch đại thành công, sản phẩm PCR có kích thước lần lượt là 551, 2323, 2544, 2580, 1325, 1439 và 561 bp đúng với lý thuyết. Đối với Y. pestis, gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể là ypo2088 và 2 gen trên plasmid pPCP1 và pMT1 tương ứng là pla và caf1 cho sản phẩm kích thước là 645, 1019 và 654 bp.
Nghiên cứu tạo dòng toàn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực Sản phẩm khuếch đại các gen đích được tinh sạch và tạo dòng trong vector pJET1.2/blunt. Chúng tôi lựa chọn một số enzyme giới hạn để cắt kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp, BglII được sử dụng trong tất cả các trường hợp bởi nằm trên vùng đa điểm cắt. Ngoài ra, trong một số trường hợp, chúng tôi sử dụng thêm một số enzyme khác có trình tự nhận biết ở trên vector và trong trình tự gen đích. Quá trình cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn được minh họa với vector tái tổ hợp pJET1.2pagA (Hình 3.39). a) b) Hình 3. 39. Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.2/blunt a) Sơ đồ biểu hiện quá trình cắt kiểm tra vector pJET1.2pagA bằng BglII; b) Cắt kiểm tra vector pJET1.2pagA trên gel agarose 1,2%. Sử dụng enzyme giới hạn BglII, cặp enzyme XbaI và EcoRI, chúng tôi đã chọn được các dòng tế bào mang plasmid chứa gen pagA cho sản phẩm kích thước khoảng 4,0 và 1,2 kb (cắt bằng XbaI và EcoRI) và khoảng 2,8; 2,4 kb đối với BglII. Như vậy, các gen đích đã được tách dòng thành công. Phân tích trình tự các gen đích đặc trưng và gen độc lực Phân tích trình tự gen vrrA trên 10 chủng B. anthracis phân lập cho thấy, gen vrrA giống nhau hoàn toàn, độ tương đồng từ 99 100% so với chủng tham chiếu. Phân tích trình tự gen pagA của 3 chủng B. anthracis độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4) xác định được 3 đột