Xác định tính đa hình thái đơn Pro47ser gen P53 trên bệnh nhân ung thư phổi bằng kỹ thuật giải trình tự gen

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN PRO47SER GEN P53<br /> TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN<br /> Trần Khánh Chi, Trần Vân Khánh, Nguyễn Đức Hinh,<br /> Nguyễn Thị Hà, Lê Văn Hưng, Tạ Thành Văn, Trần Huy Thịnh<br /> Trư ng H YH N<br /> <br /> Ngh n ư th h n ụ t nh t nh h nh th ơn t tr n 4 (Pr 4 r) g n 5<br /> nh nh n ng thư h ng hương h g tr nh t g n 1 0 nh nh n ng thư h 9 ngư h ng<br /> nh ng thư ư h n ngh n th t g tr nh t g n ư ụng nh NP Pr 4 r<br /> (P4 ) g n 5 t h ng h t h n ư n g n Pr - rt tr n4 g n 5<br /> tr n 2 nh ngh n<br /> <br /> Từ khóa: ung thư phổi, đa hình thái đơn nucleotid Pro47Ser, gen p53<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ ung thư. Tuy nhiên, mối tương quan giữa tính đa hình<br /> thái của SNP P47S gen p53 với nhiều loại ung thư trong<br /> Gen áp chế ung thư p53 (OMIM, 191170) nằm tại vị đó có ung thư phổi chưa được khẳng định nhất quán<br /> trí p13.3 trên NST số 17, mã hoá protein p53 với 393 trên các quần thể nghiên cứu khác nhau [7; 8].<br /> acid amin, có trọng lượng phân tử 53kDa [1]. Đột biến Nhằm góp phần nghiên cứu về đặc điểm gen người<br /> gen p53 gặp ở 50 - 70% ung thư ở người. Ước tính Việt Nam trong mối liên quan đến bệnh ung thư phổi,<br /> có 85 đa hình thái và 27.580 đột biến soma trên gen đề tài này được thực hiện với mục tiêu: Xác định tính<br /> p53 đã được biết đến [2]. Một số đa hình thái gen p53 đa hình thái đơn tại vị trí codon 47 (SNP P47S) của gen<br /> có liên quan đến khuynh hướng dễ mắc bệnh ung thư p53 trên bệnh nhân ung thư phổi bằng phương pháp<br /> do làm tăng tính nhạy cảm với bệnh. Các biến đổi của giải trình tự gen.<br /> gen như đột biến hay đa hình thái làm mất chức năng<br /> và bất hoạt vai trò của protein p53 dẫn đến phát sinh II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> ung thư. Nhiều đa hình thái của gen đã được phát hiện<br /> trên vùng không mã hoá và vùng mã hoá trong đó đa 1. Đối tượng<br /> số là các đa hình thái đơn Nucleotid (Single Nucleotide - 170 mẫu máu của bệnh nhân ung thư phổi nguyên<br /> Polymorphisms-SNP)[3,4]. phát tại trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học Hạt nhân và<br /> Đa hình Pro47Ser nằm trên vùng exon 4 của gen Ung bướu - bệnh viện Bạch Mai, được chẩn đoán xác<br /> p53. Đa hình codon 47 là sự thay thế acid amin prolin định bằng xét nghiệm mô bệnh học.<br /> bằng serin tại vị trí codon 47 do biến đổi nucleotid từ C - 97 mẫu máu của người không mắc bệnh ung thư được<br /> - T, được xác định đầu tiên bởi Felley – Bosco năm lựa chọn tại khoa Khám bệnh - bệnh viện Bạch mai<br /> 1993. Các biến thể đa hình Ser47 là rất hiếm, với tần<br /> - Hóa chất dùng trong nghiên cứu của các hãng QIA-<br /> số alen ít hơn 5% trong dân số có nguồn gốc châu Phi<br /> GEN, Sigma, Fermentas.<br /> [5,6]. Trong điều kiện bình thường, dưới tác động của<br /> protein p38 và (homeodomain - interacting protein ki-<br /> 2. Quy trình nghiên cứu<br /> nase 2) HIPK2, p53 được phosphoryl hóa tại vị trí Ser46<br /> dẫn đến sự tăng cường sao chép các gen liên quan đến - Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu máu theo phương<br /> quá trình apoptosis. Và khi alen p53 - Pro47 được thay pháp sử dụng enzym protease K và phenol: chloroform:<br /> thế bởi alen p53 - Ser47 sự phosphoryl hóa tại vị trí isoamyl alcohol.<br /> Ser46 bị giảm sút làm giảm hoạt tính tác động lên các - Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng<br /> gen đích của quá trình apoptosis và tăng khả năng mắc phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% và đo mật<br /> độ quang tại bước sóng 260/280 nm.<br /> h n h Tr n h nh Ch nH nh trư ng - Khuếch đại vùng gen chứa codon 47 trên exon 4 gen<br /> h YH N p53 bằng phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi đặc<br /> h h g hiệu:<br /> Ng nh n 2 2014 F: 5’ - CGT TCT GGT AAG GAC AAG GG – 3’<br /> Ng h th n 1 11 2014 R: 5’-CAC TGA CGA GAA GCC AAA GG – 3’<br /> <br /> 1<br /> TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> + Thành phần phản ứng PCR (thể tích 10μl) gồm: 1X phút, 25 chu kỳ [96oC/10 giây, 54oC/5 giây, 60oC/4 phút].<br /> đệm PCR; 2,5mM dNTP, 0,2μMmồi xuôi và ngược, Bảo quản mẫu ở 15oC<br /> 0,5U Taq polymerase, 20-50ng DNA và H2O. + So sánh kết quả thu được với trình tự gen p53 trên<br /> + Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC/5 phút, Genbank (NG_017013).<br /> 35 chu kỳ [94oC/40 giây, 54oC/30 giây, 72oC/45 giây],<br /> 72oC/7 phút. Bảo quản mẫu ở 15oC. 3. Đạo đức trong nghiên cứu<br /> - Giải trình tự gen: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào<br /> chứa codon 47 trên exon 4 của gen p53 bằng kỹ thuật nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu<br /> giải trình tự gen theo quy trình thường quy của trung khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Các<br /> tâm Nghiên cứu Gen - Protein. thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật.<br /> + Thành phần phản ứng giải trình tự (thể tích 20μl)<br /> gồm: Đệm 3μl, BigDye 2μl, mồi xuôi hoặc ngược 1μl,<br /> III. KẾT QUẢ<br /> 20 - 50ng DNA và nước<br /> 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu<br /> + Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự: 96oC/1<br /> <br /> Bảng 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu<br /> <br /> UTP (n1 = 170) Chứng (n2 =97)<br /> <br /> Min 33 47<br /> Tuổi Max 86 87<br /> X ± SD 59,96 ± 9,72 66,42 ± 8,19<br /> n % n %<br /> Giới Nam 115 67,6 55 56,7<br /> Nữ 55 32,4 42 43,3<br /> <br /> <br /> - Bệnh nhân trẻ tuổi nhất là 33 tuổi, lớn tuổi nhất là 86 tuổi, trung bình là 59,96 ± 9,72 tuổi<br /> - Tỷ lệ nam/nữ là 2,09/1.<br /> - Nhóm chứng trẻ tuổi nhất là 47 tuổi, lớn tuổi nhất là 87 tuổi, tuổi trung bình 66,42 ± 8,19<br /> 2. Kết quả xác định SNP Pro47Ser trên gen p53<br /> <br /> Khuếch đại vùng gen mang SNP Pro47Ser trên gen p53<br /> M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 511pb<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mang SNP Pro47Ser trên gen p53.<br /> M: Thang chuẩn 100b; 1÷5: sản phẩm PCR của nhóm chứng; 6÷11: sản phẩm PCR của bệnh<br /> nhân ung thư phổi<br /> <br /> 2<br />  TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> Sản phẩm PCR thu được có chất lượng tốt, gồm 1 băng có kích thước đặc hiệu là 511bp.<br /> <br /> 3. Kết quả giải trình tự xác định kiểu gen SNP Pro47Ser gen p53<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen chứa codon 47 của gen p53 (a mẫu bệnh),<br /> (b mẫu chứng: đồng hợp tử CCG (Prolin))<br /> Kết quả giải trình tự DNA của bệnh nhân cho phép xác định được kiểu gen tại vị trí codon 47 của gen p53.<br /> Bảng 2. Tần số alen và kiểu gen SNP Pro47Ser của gen p53<br /> trên DNA các mẫu nghiên cứu<br /> <br /> n = 267<br /> Alen/Kiểu gen Nhóm bệnh Nhóm chứng<br /> n1 = 70 % n2 = 97 %<br /> C(Prolin) 340 100 194 100<br /> T(Serin) 0 0 0 0<br /> CC (Prolin) 170 100 97 100<br /> CT(Prolin/Serin) 0 0 0 0<br /> TT(Serin/Serin) 0 0 0 0<br /> <br /> Tất cả các mẫu nghiên cứu bao gồm cả nhóm bệnh và nhóm chứng đều có kiểu alen Prolin (CCG) và kiểu gen<br /> Prolin/Prolin<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN Các nghiên cứu về dịch tễ học trên thế giới cũng<br /> như ở Việt Nam đều khẳng định ung thư phổi phổ biến<br /> Nghiên cứu được thực hiện trên 170 bệnh nhân ung hơn ở nam giới. Nghiên cứu này gồm 115 bệnh nhân<br /> thư phổi với tuổi mắc bệnh trẻ nhất là 33, cao nhất là 86 nam giới (67,6%) và 55 bệnh nhân nữ giới (32,4%), tỷ lệ<br /> và tuổi trung bình là 59,96 ± 9,72. 97 người không mắc nam/nữ là 2,1/1. Kết quả thu được phù hợp với nghiên<br /> bệnh ung thư được xác định tính đa hình thái codon 47 cứu của Ngô Quý Châu và cộng sự (2012), bệnh nhân<br /> gen p53 để đối chứng. Kết quả nghiên nghiên cứu trên nam giới chiếm 73,3%, tỷ lệ nam/nữ là 2,75/1 [9]. Theo<br /> nhóm bệnh nhân ung thư phổi phù hợp với ghi nhận ghi nhận về tình hình ung thư năm 2007, ước tính có<br /> của một số nghiên cứu trong nước và thấp hơn so với khoảng 1.549.121 trường hợp ung thư phổi mới phát<br /> một số nghiên cứu trên thế giới. Theo Ngô Quý Châu hiện trên toàn thế giới, trong đó nam giới chiếm 71,6%,<br /> và cộng sự (2012), tuổi trung bình của bệnh nhân ung tỷ lệ nam/nữ là 2,5/1 [11].<br /> thư phổi là 58,9 ± 8,6[9]. Yang P. và CS (2005) nghiên Mặc dù mối tương quan giữa đa hình codon 47 và<br /> cứu các đặc điểm lâm sàng trên 5628 bệnh nhân ung ung thư phổi đã cómột số tác giả nghiên cứu, tuy nhiên<br /> thư phổi được chẩn đoán từ 1997 đến 2003 tại Mayo vì là một đa hình hiếm và chưa có nhiều công bố nên<br /> Clinic đã ghi nhận tuổi trung bình của bệnh nhân là 65,4 chưa cho thấy được mối tương quan giữa SNP P47S<br /> ± 11,0 [10]. Tuổi mắc bệnh được xác định là khác nhau với ung thư phổi. Trong nghiên cứu này, kết quả giải<br /> giữa các khu vực địa lý, chủng tộc và điều kiện sống trình tự gen cho thấy đoạn gen khuếch đại exon 4 gen<br /> [11]. p53 là đặc hiệu, chính xác và cho phép xác định được<br /> <br /> 3<br /> TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> kiểu gen tại vị trí codon 47. Với kết quả xác định tính đề tài nhánh cấp nhà nước “Đánh giá sự phân bố kiểu<br /> đa hình thái đơn codon 47 trên 170 bệnh nhân ung thư gen của một số gen liên quan đến ung thư phổi và ung<br /> phổi và 97 người không mắc ung thư đối chứng thấy thư gan” thuộc đề tài nhiệm vụ Quỹ gen “Đánh giá đặc<br /> 100% có kiểu gen đồng hợp tử Pro/Pro. Kết quả này điểm di truyền người Việt Nam”. Nhóm nghiên cứu trân<br /> phù hợp với nghiên cứu của Auer và cộng sự năm 1999 trọng cảm ơn trung tâm Hô Hấp, trung tâm Y học Hạt<br /> khi toàn bộ 64 bệnh nhân ung thư phổi nghiên cứu đều nhân và Ung bướu - bệnh viện Bạch Mai, trung tâm<br /> có kiểu gen đồng hợp tử Pro/Pro [12]. Nghiên cứu của Gen - Protein đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình<br /> Felley - Bosco và cộng sự năm 1993 trên 101 bệnh nghiên cứu.<br /> nhân ung thư phổi ghi nhận được 3 trường hợp có kiểu<br /> gen Pro/Ser ở người Mỹ gốc Phi và không tìm thấy trên TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> người da trắng [5]. Nhiều nghiên cứu về tính đa hình<br /> thái đơn codon 47 cũng được tiến hành trên các đối 1. McBride O.W., D.Mery and D. Givol (1986). The<br /> tượng nghiên cứu khác nhau, tuy nhiên tần suất gặp gene for human p53 cellular tumor antigen is located on<br /> alen Ser47 rất thấp. Năm 2008, Siraj và cộng sự tiến chromosome 17 short arm (17p13). Pr N t<br /> hành nghiên cứu trên 223 bệnh nhân ung thư tuyến , 83, 130 - 134.<br /> giáp và 229 đối chứng người Ả Rập nhưng không ghi<br /> 2. Hollstein M., D. Sidransky, B. Vogelstein et al.<br /> nhận được alen Ser47 [13]. Tương tự, nghiên cứu trên (1991). P53 mutations in human cancers. n , 253:<br /> 100 bệnh nhân ung thư vú và 100 đối chứng người Ả 49 - 53.<br /> Rập của Al-Qasem thấy 100% đối tượng nghiên cứu<br /> 3. Costa S., D. Pinto, D. Pereira et al. (2008). Impor-<br /> đều có kiểu gen đồng hợp tử Pro/Pro [14]. Sameer và<br /> tance of TP53 codon 72 and intron 3 duplication 16bp<br /> cộng sự nghiên cứu trên 226 bệnh nhân ung thư đại<br /> polymorphisms in prediction of susceptibility on breast<br /> trực tràng và 156 người đối chứng người Kashmir. Kết<br /> cancer. C C n r 8, 8 - 32.<br /> quả nghiên cứu này ghi nhận được 5 trường hợp bệnh<br /> nhân, 4 trường hợp đối chứng có kiểu gen đồng hợp tử 4. Whibley C, Pharoah PD and Hollstein M (2009).<br /> Ser/Ser, tuy nhiên không thấy mối liên quan giữa tính p53 polymorphisms: cancer implications. N t<br /> đa hình thái đơn codon 47 với bệnh ung thư đại trực C n r 9: 95 - 107.<br /> tràng [15]. Nghiên cứu của Jaiswal năm 2011 ở Bắc 5. Felley-Bosco E, Weston A, Cawley HM, Bennett<br /> Ấn Độ trên 181 bệnh nhân ung thư bàng quang và 176 WP, et al. (1993). Functional studies of a germ-line<br /> đối chứng ghi nhận được 6% nhóm bệnh, 3,5% nhóm polymorphism at codon 47 within the p53 gene.<br /> chứng có kiểu gen dị hợp tử Pro/Ser, 3,5% nhóm bệnh H n t 53, 752 - 759.<br /> và 8,5% nhóm chứng có kiểu gen đồng hợp tử Ser/Ser. 6. Pietsch EC, Humbey O and Murphy ME (2006).<br /> Sự xuất hiện của alen Ser47 ở các nghiên cứu này có Polymorphisms in the p53 pathway. n g n 25:<br /> thể do đặc điểm chủng tộc. 1602 - 1611.<br /> Hiện nay, hầu hết bệnh ung thư vẫn còn là thách 7. Li X., Dumont P., Pietra A.D,. et al (2005). The co-<br /> thức lớn đối với Y học thế giới, phần lớn bệnh nhân tử don 47 polymorphism in p53 is functionally significant,<br /> vong hoặc để lại hậu quả nặng nề cho gia đình và xã Ch 280, 24245 - 24251.<br /> hội. Đối với bệnh ung thư phổi, các nhà khoa học trên 8. Feng L., Hollstein M. and Xu Y., (2006). Ser46<br /> thế giới vẫn đang tiếp tục nghiên cứu tìm ra liệu pháp phosphorylation regulates p53-dependent apoptosis<br /> gen điều trị hiệu quả bệnh ung thư phổi. Do đó, phát and replicative senescence. C C 5, 2812 - 2819.<br /> hiện sớm và phòng ngừa các yếu tố nguy cơ vẫn là<br /> 9. Ngô Quý Châu, Lê Hoàn, Nguyễn Thanh Phương<br /> những biện pháp tốt nhất nhằm giảm thiểu tỷ lệ bệnh<br /> (2012). “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và cận lâm<br /> ung thư phổi ở Việt Nam và trên toàn Thế giới.<br /> sàng ung thư phổi nguyên phát di căn sọ não tại Trung<br /> tâm Hô Hấp- Bệnh viện Bạch Mai”, T h Yh<br /> V. KẾT LUẬN<br /> ng 68, 30 - 34<br /> 10. Yang P., Allen M.S., Marie C. Aubry M.C., et al.<br /> 100% đối tượng nghiên cứu đều mang kiểu gen<br /> (2005). Clinical Features of 5,628 Primary Lung Cancer<br /> đồng hợp tử Pro47Pro của gen p53.<br /> Patients: Experience at Mayo Clinic From 1997 to 2003,<br /> Ch t 128, 452 - 462.<br /> Lời cảm ơn<br /> 11. American Cancer Society (2007). C n r<br /> Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của t g r 200<br /> <br /> <br /> 4<br />  TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> 12. Auer H., Warncke K., Nowak D. Et al., (1999). Vari- 14. Al-Qasem A., Toulimat M., Tulbah A. Et al.,<br /> ations of p53 in cultured fibroblast of patients with lung (2012). The p53 codon 72 polymorphism is associated<br /> cancer who have a presumed genetic predisposition, with the risk and early onset of breast cancer among<br /> C n n 22, 278 - 282. Saudi women, n tt 3, 875 - 878<br /> 13. Siraj A.K., Al-Rasheed M., Ibrahim M. et al., 15. Sameer A. S., Shah Z. A., Syeed N. Et al., (2010).<br /> (2008). RAD52 polymorphisms contribute to the devel- TP53 Pro47Ser and Arg72Pro polymorphisms and colo-<br /> opment of papillary thyroid cancer susceptibility in Mid- rectal cancer prdisposition in an ethnic Kashmiri popu-<br /> dle Eastern population, n rn n t 31,893- lation, n t 9, 651 - 660.<br /> 899.<br /> <br /> <br /> <br /> Summary<br /> DETERMINATION OF PRO47SER POLYMOPHISM OF P53 GENE IN LUNG<br /> CANCER PATIENTS SEQUENCING METHOD<br /> This study was conducted to determine Pro47Ser polymorphism of p53 gene in lung cancer patients by sequencing<br /> method.170 lung cancer patients and 97 controls were selected for this study. The sequencing method was used to<br /> analyze Pro47Ser polymorphism in p53 gene. Results: we did not find any P47S polymorphism of p53 gene in both<br /> lung cancer patient group and control group.<br /> <br /> Keywords: Lung cancer, Pro47Ser polymorphism, p53 gene<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 5<br />