intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Xây dựng các quy trình kỹ thuật để hoàn thiện phác đồ chẩn đoán phân tử bệnh hemophilia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:14

Thêm vào BST
Báo xấu
2
lượt xem 0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày các nội dung: Triển khai các kỹ thuật phân tích đột biến để hoàn thiện phác đồ chẩn đoán bệnh hemophilia (A và B) tại Viện Huyết học – Truyền máu TW; Áp dụng và đánh giá hiệu quả của phác đồ chẩn đoán đã hoàn thiện.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng các quy trình kỹ thuật để hoàn thiện phác đồ chẩn đoán phân tử bệnh hemophilia tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương

  1. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU XÂY DỰNG CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT ĐỂ HOÀN THIỆN PHÁC ĐỒ CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ BỆNH HEMOPHILIA TẠI VIỆN HUYẾT HỌC TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG Dương Quốc Chính, Vũ Thị Bích Hường, Trần Tuấn Anh, Nguyễn Lê Anh, Ngô Thu Hằng, Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Hà Thanh, Bạch Quốc Khánh(*). TÓM TẮT 14 100% trong chẩn đoán phân tử bệnh hemophilia Mục tiêu: (1) Triển khai đầy đủ các kỹ thuật A và đạt 100% trong chẩn đoán phân tử bệnh phân tích đột biến để hoàn thiện phác đồ chẩn hemophilia B. Kết luận: Đã hoàn thiện được đoán bệnh hemophilia (A và B) tại Viện Huyết phác đồ chẩn đoán phân tử bệnh hemophilia tại học – Truyền máu TW; (2) Áp dụng và đánh giá Viện Huyết học – truyền máu TW. hiệu quả của phác đồ chẩn đoán đã hoàn thiện. Từ khóa: Hemophilia, F8, F9, yếu tố VIII, Đối tượng nghiên cứu: Các quy trình phân tích yếu tố IX. đột biến gen hemophilia đã công bố trên thế giới (cho mục tiêu 1); 258 mẫu máu ngoại vi của SUMMARY bệnh nhân hemophilia (158 bệnh nhân DIAGNOSTIC ALGORITHM FOR hemophilia A và 100 bệnh nhân hemophilia B) HEMOPHILIA AT THE NATIONAL được chỉ định xét nghiệm phân tích đột biến gen INSTITUTE OF HEMATOLOGY AND F8 và F9 (cho mục tiêu 2). Phương pháp nghiên BLOOD TRANSFUSION cứu: Xây dựng các quy trình phân tích đột biến Aim: (1) To complete diagnostic algorithm dựa trên các quy trình chẩn đoán chung. Áp dụng for hematology at the National Institute of và đánh giá hiệu quả khi phối hợp các kỹ thuật. Hematology and Blood Transfusion. (2) Apply Kết quả: Xây dựng thành công các quy trình kỹ and evaluate the effective of these protocols. thuật phân tích đột biến gen trong bệnh Donors: 258 patients are subjected to either F8 hemophilia bao gồm: kỹ thuật Longrange PCR or F9 genes mutations analysis. Methods: Newly phát hiện đảo đoạn intron 22, kỹ thuật multiplex designed and customized common molecular PCR phát hiện đảo đoạn intron 1, kỹ thuật giải protocols for hemophilia mutation analysis, trình tự gen Sanger (gen F8, F9), kỹ thuật giải applied and evalutated effectiveness of new trình tự gen NGS (gen F8, F9), kỹ thuật MLPA protocols for diagnosis of hemophilia. Results: phát hiện các đột biến mất đoạn/lặp đoạn lớn Successfully designed testing algorithm for trong gen F8, F9. Hoàn thiện phác đồ chẩn đoán hemophilia mutation analysis, including phân tử bệnh hemophilia (A và B) tại Viện Huyết Longrange-PCR for intron-22 inversion, học – Truyền máu TW. Hiệu quả của phác đồ đạt multiplex PCR for intron-1 inversion, Sanger sequencing and next-generation sequencing for F8 and F9 genes, MLPA for large and/or novel (*)Viện Huyết học – Truyền máu TW deletions. The effectiveness of this algorithm is Chịu trách nhiệm chính: Dương Quốc Chính 100% for all of 258 tested cases. In conclusion: Email: chinh.nihbtsmp@gmail.com we have successfully optimized the mutation Ngày nhận bài: 07/9/2020 tests algorithm for hemophilia at the National Ngày phản biện khoa học: 10/9/2020 Institute of Hematology and Blood Transfusion. Ngày duyệt bài: 16/10/2020 802
  2. Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2020 I. ĐẶT VẤN ĐỀ (Longrange - PCR). Với các đột biến mất Kết quả định lượng yếu tố VIII, IX và các đoạn hoặc lặp đoạn gen lớn, chúng ta cần sử thông tin khai thác từ tiền sử gia đình người dụng kỹ thuật MLPA [6] [7]. Chính vì vậy, bệnh hiện vẫn là những yếu tố quyết định để nâng cao hiệu quả chẩn đoán cho bệnh trong chẩn đoán bệnh Hemophilia (A và B). nhân và người mang gen, chúng tôi mong Tuy nhiên, phân tích đột biến gen được muốn xây dựng được bộ công cụ hoàn chỉnh khuyến cáo thực hiện cho tất cả các bệnh gồm nhiều kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại nhân vì thông tin đột biến ở người bệnh góp có khả năng phát hiện mọi loại đột biến phần làm sáng tỏ chức năng sinh học của hemophilia. Cụ thể, đề tài có các mục tiêu gen, về mối tương quan giữa kiểu gen và như sau: kiểu hình bệnh, dự đoán nguy cơ hình thành (1) Triển khai các kỹ thuật phân tích đột các chất ức chế và cơ sở quan trọng để chẩn biến để hoàn thiện phác đồ chẩn đoán bệnh đoán tình trạng mang gen, chẩn đoán trước hemophilia (A và B) tại Viện Huyết học – sinh cũng như chẩn đoán trước chuyển phôi Truyền máu TW [1] [2]. (2) Áp dụng và đánh giá hiệu quả của Phân tích đột biến gen gây bệnh phác đồ chẩn đoán đã hoàn thiện. hemophilia là xét nghiệm phức tạp do: số lượng đột biến gen rất lớn (trên 2000 đột II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU biến gen liên quan đến bệnh hemophilia A và 2.1. Đối tượng nghiên cứu trên 1000 đột biến trong bệnh Hemophilia B) - Các quy trình chẩn đoán phân tử bệnh [3] [4]; kiểu đột biến gen đa dạng (từ các đột hemophilia trên thế giới (thực hiện mục tiêu biến điểm, đột biến đảo đoạn, chèn đoạn, các 1)[6] [7] [8] [9] - 258 mẫu bệnh phẩm là máu ngoại vi của mất đoạn/ lặp đoạn nhỏ đến các mất đoạn/ các bệnh nhân hemophilia được chỉ định xét lặp đoạn lớn); các đột biến không khu trú nghiệm phân tích đột biến gen tại khoa Di trên một vùng ADN nhất định mà trải dài từ truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học- đầu 5’ đến 3’ của gen; tần suất các đột biến Truyền máu TW, từ tháng 1/2015 đến không thống kê được (ngoại trừ đột biến đảo 9/2020. Trong đó, có 158 bệnh nhân đoạn intron 22 và đảo đoạn intron 1 trong hemophilia A, 100 bệnh nhân hemophilia B hemophilia A mức độ nặng) [5] [4]. Do tính (thực hiện mục tiêu 2). chất phức tạp nêu trên, chúng ta không thể áp 2.2. Phương pháp nghiên cứu dụng một thuật chung cho tất cả các loại đột 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: biến. Thực tế, mỗi kỹ thuật chỉ có khả năng - Nghiên cứu hồi cứu, mô tả cắt ngang phát hiện một số loại đột biến nhất định. 2.2.2. Các bước nghiên cứu Hiện tại, kỹ thuật giải trình tự gen (NGS, 2.2.2.1 Xây dựng các quy trình phân Sanger) là tiêu chuẩn vàng để phát hiện các tích đột biến đột biến điểm và các chèn xóa nhỏ. Trong Tối ưu quy trình theo phương pháp của khi đó, để phát hiện các đột biến đảo đoạn Liu Q và cs (1998). Vị trí các mồi sử dụng và hướng dẫn phân tích kết quả thể hiện ở hình gen như intron 22 phòng xét nghiệm phải sử 1. dụng kỹ thuật PCR khuếch đại chuỗi dài 803
  3. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU Quy trình Longrange PCR phát hiện các Quy trình Multiplex PCR phát hiện đảo đảo đoạn intron 22 đoạn intron 1 Hình 1: vị trí mồi thiết kế cho đảo đoạn Hình 2: vị trí mồi thiết kế cho đảo đoạn intron 22 [8] intron 1 [9] Tối ưu quy trình theo phương pháp của Quy trình giải trình tự gen Sanger: giải Rossetti và cs (2005). Vị trí các mồi sử dụng trình tự toàn bộ các exon, vùng nối intron- và hướng dẫn phân tích kết quả thể hiện ở exon, đầu 5; và 3’ của gen F8 và F9 hình 2 Tối ưu quy trình giải trình tự gen F8, F9 theo hướng dẫn chẩn đoán phân tử bệnh hemophilia của Trung tâm hemophilia Vương Quốc Anh (United Kingdom Hemophilia center Doctors’ organisation, UKHCDO) [6] [7]. Vị trí mồi thiết kế để giải trình tự gen F8 Vị trí mồi thiết kế để giải trình tự gen F9 Hình 3: Vị trí thiết kế mồi khuếch đại gen F8, F9 và các bước giải trình tự gen Sanger 804
  4. Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2020 Quy trình MLPA phát hiện các lặp phủ gen F8, F9 của các trình tự mồi đã thiết đoạn/mất đoạn gen lớn trên gen F8, F9 kế trước khi sử dụng. Sử dụng bộ kit phát hiện các lặp đoạn/mất b) Tối ưu quy trình Longrange PCR đoạn gen lớn trên gen F8 (SALSA MLPA khuếch đại gen F8, F9 P178-B4 F8) và gen F9 (SALSA MLPA c) Tinh sạch sản phẩm PCR; chuẩn bị thư P207 F9) của MRC Holland, Amsterdam, viện và giải trình tự gen NGS The Netherlands. Thực hiện quy trình theo − Sử dụng bộ kit Agencourt Ampure XP hướng dẫn của nhà sản xuất. (Beckman coulter), Nextera XT library prep Xây dựng quy trình giải trình tự gen kit 24 samples (Illumina), Miseq reagent kit NGS: giải trình tự toàn bộ gen F9, toàn bộ v2 – 300 cycles PE, Nextera XT index kit 26 exon, đầu 5’, 3’ và phần lớn các intron (Illumina) và thực hiện quy trình theo hướng của gen F8. dẫn của nhà sản xuất. a) Thiết kế các trình tự mồi khuếch đại 2.2.2.2. Áp dụng và đánh giá hiệu quả gen F8, F9: phác đồ chẩn đoán với các kỹ thuật đã − Bước 1: Phân tích kích thước và tính hoàn thiện toán khoảng cách giữa các vùng trình tự để 2.2.3. Xử lý và thống kê dữ liệu chia gen F8, F9 thành các vùng gen có kích - Dữ liệu giải trình tự gen Sanger và NGS thước phù hợp, thuận lợi . được phân tích trên phần mềm CLC − Bước 2: Sử dụng phần mềm Primer3 Genomic Work bench; sử dụng gen tham để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi chiếu cho gen F8 là NG.011403 và vùng gen F8, F9 đã định sẵn. Các cặp mồi NP.000123.1, cho gen F9 là NG_007994.1 được thiết kế gối đầu nhau để đảm bảo và NM_000133.3. khuếch đại được toàn bộ trình tự gen các - Số liệu nghiên cứu được xử lý và thống vùng gen đích. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của kê trên phần mềm Microsoft Excel 2016. các cặp mồi được tính toán để không chênh lệch nhau quá 5 độ. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU − Bước 3: Sử dụng phần mềm 3.1. Kết quả tối ưu quy trình Nucleotide Blast của NCBI để so sánh và Longrange PCR kiểm tra độ đặc hiệu của các trình tự mồi đã Sử dụng các trình tự mồi theo thiết kế của thiết kế. Liu Q và cs, chúng tôi đã tối ưu được thành − Bước 4: Sử dụng phần mềm CLC phần và điều kiện của phản ứng Longrange Genomic Workbench để kiểm tra lại độ bao PCR (hình 4a). Kết quả của phản ứng Longrange PCR được thể hiện trên hình 4b. 805
  5. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU (a) Thành phần phản ứng mix 1 Chu trình nhiệt phản ứng LR-PCR Số chu Nhiệt độ Thời gian kỳ 950C 30 s 1 950C 2 p15 s 950C 12 s 650C 30 s 12 680C 12 p 950C 12 s 650C 30 s 1 (12 p +20 680C 20 s)n+1 680C 7p 1 (b) Thành phần phản ứng mix 2 Kết quả của phản ứng LR-PCR Hình 4: Thành phần, điều kiện tối ưu và kết quả của phản ứng Longrange PCR Nhận xét: quy trình Longrange PCR cho kết quả đặc hiệu, các băng sản phẩm rõ nét, đúng kích thước. 3.2. Kết quả tối ưu quy trình multiplex PCR Sử dụng các trình tự mồi theo thiết kế của Rossetti và cs, chúng tôi đã tối ưu được thành phần và điều kiện của phản ứng mutiplex PCR phát hiện đảo đoạn intron 1(hình 5a). Kết quả của phản ứng multiplex PCR được thể hiện trên hình bb. 806
  6. Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2020 (a)Thành phần phản ứng H1 Chu trình nhiệt phản ứng multiplex PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 910C 10 p 1 940C 30 s 570C 30 s 30 720C 2p 720C 7p 1 Thành phần phản ứng H2 (b) Kết quả của phản ứng multiplex PCR Hình 5: Thành phần, điều kiện tối ưu và kết quả của phản ứng multiplex PCR Nhận xét: Phản ứng multiplex PCR cho các băng ADN đặc hiệu, đúng kích thước theo tính toán lý thuyết. 3.3. Kết quả tối ưu quy trình Sanger Sử dụng các trình tự mồi theo hướng dẫn của UKHCDO, chúng tôi đã tối ưu thành công 32 phản ứng PCR để khuếch đại gen F8, 12 phản ứng PCR để khuếch đại gen F9 (hình 6) và thực hiện giải trình tự thành công các trình tự gen này (hình 7). F8: 32 phản ứng PCR PCR F9: 12 phản ứng PCR Hình 6: Kết quả khuếch đại gen F8, F9 bằng kỹ thuật PCR Nhận xét: Phản ứng PCR cho kết quả rõ ràng, các băng sản phẩm đặc hiệu, đúng kích thước, không có sản phẩm phụ. 807
  7. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU Hình 7: Kết quả giải trình tự gen Sanger Nhận xét: Dữ liệu giải trình tự cho tín hiệu rõ ràng, sắc nét, cường độ tín hiệu cao 3.4. Kết quả tối ưu quy trình NGS 3.4.1. Kết quả thiết kế các cặp mồi F8: Thực hiện các bước thiết kế như đã mô tả ở phần phương pháp, sử dụng phần mềm thiết kế mồi chuyên dụng Primer3, chúng tôi đã thiết kế thành công các trình tự mồi để khuếch đại toàn bộ gen F9; toàn bộ 26 exon, đầu 5’, 3’ cùng với phần lớn các intron của gen F8. Kết quả kiểm tra độ bao phủ của các trình tự mồi trên phần mềm CLC được trình bày ở hình 8 và hình 9. Hình 8: Kết quả kiểm tra độ bao phủ gen F8 trên phần mềm CLC Nhận xét: Trình tự mồi bao phủ hoàn toàn các vùng trình tự đích mong muốn 808
  8. Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2020 Hình 9: Kết quả kiểm tra độ bao phủ gen F9 trên phần mềm CLC Nhận xét: Trình tự mồi bao phủ hoàn toàn gen F9 (35kb) 3.4.2. Kết quả tối ưu quy trình Longrange PCR khuếch đại gen F8, F9 Thực hiện tối ưu phản ứng Longrange PCR với các cặp mồi thiết kế cho gen F8 và F9, chúng tôi thu được kết quả ở hình 10. F9: 8 phản ứng LR-PCR F8: 13 phản ứng LR-PCR Hình 10: Kết quả phản ứng Longrange PCR với các cặp mồi thiết kế Nhận xét: Phản ứng LR-PCR cho các sản phẩm đặc hiệu, đúng kích thước theo lý thuyết 3.4.3. Kết quả giải trình tự gen NGS Sản phẩm của phản ứng Longrange PCR được tinh sạch, chuẩn bị thư viện và giải trình tự gen NGS. Kết quả giải trình tự được trình bày ở hình 11. 809
  9. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU Hình 11: Kết quả giải trình tự gen NGS Nhận xét: Dữ liệu giải trình tự thu được bao phủ hoàn toàn gen các trình tự đích. Độ bao phủ (coverage) tối thiểu của mỗi nucleotide là 70X. 3.5. Áp dụng quy trình MLPA Sử dụng bộ kit SALSA MLPA P178-B4 F8 và SALSA MLPA P207 F9, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, chúng tôi thu được kết quả ở hình 12. Mẫu có đột biến mất đoạn exon 5 810
  10. Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2020 Người bình thường Mẫu có lặp đoạn từ exon 4-8 Hình 12: Kết quả phân tích đột biến bằng kỹ thuật MLPA Nhận xét: Ứng dụng thành công kỹ thuật MLPA trong phân tích các tổn thương di truyền lớn trong bệnh hemophilia 3.6. Hoàn thiện phác đồ chẩn đoán phân tử trong bệnh hemophilia Hình 13: Phác đồ chẩn đoán phân tử bệnh hemophilia 3.7. Áp dụng và đánh giá hiệu quả phác đồ trong chẩn đoán bệnh hemophilia Để đánh giá hiệu quả của phác đồ chẩn đoán phân tử bệnh hemophilia, chúng tôi đã áp dụng chẩn đoán cho 158 bệnh nhân hemophilia A và 100 bệnh nhân hemophilia B đang được điều trị tại Viện Huyết học – Truyền máu TW. 3.7.1. Kết quả chẩn đoán trong bệnh hemophilia A 811
  11. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU Hình 14: Kết quả chẩn đoán trong bệnh hemophilia A Nhận xét: Hiệu quả chẩn đoán của phác đồ trong bệnh hemophilia A đạt 100% 3.7.2. Kết quả chẩn đoán trong bệnh hemophilia B Hình 15: Kết quả chẩn đoán trong bệnh hemophilia B Nhận xét: Hiệu quả chẩn đoán của phác đồ trong bệnh hemophilia B là 100%. 812
  12. Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2020 IV. BÀN LUẬN vùng nối giữa intron-exon và đầu 5’, 3’của Xác định các biến đổi di truyền có vai trò gen F8, F9 theo hướng dẫn của Trung tâm quan trọng trong gia đình người bệnh hemophilia Vương quốc Anh. Trong quá hemophilia vì thông tin về đột biến gen là cơ trình tối ưu quy trình giải trình tự gen sở để tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn sinh sản, Sanger, chúng tôi gặp không ít khó khăn vì chẩn đoán trước sinh, chẩn đoán trước theo thiết kế cần phải sử dụng 64 trình tự chuyển phôi giúp kiểm soát một cách hiệu mồi cho 32 phản ứng PCR để khuếch đại các quả nguồn gen bệnh. Thông tin về đột biến vùng gen F8 cũng như 24 trình tự mồi để gây bệnh cũng hỗ trợ dự đoán nguy cơ hình thực hiện 12 phản ứng PCR cho gen F9. Nếu thành chất ức chế cho bệnh nhân, một biến chỉ tối ưu từng phản ứng PCR riêng rẽ thì chứng được coi là nghiêm trọng nhất trong không phải vấn đề khó tuy nhiên, để có thể điều trị bệnh hemophilia hiện nay [1][4][10]. tiết kiệm thời gian và trang thiết bị khi quy Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học – trình được áp dụng thường quy, chúng tôi đã Truyền máu TW hiện là cơ sở quản lý và phải nghiên cứu để tìm được một điều kiện điều trị bệnh hemophilia lớn nhất trong cả phản ứng PCR chung, trong đó nhiệt độ và nước. Trong phân tích di truyền bệnh thời gian phù hợp cho cả 64 trình tự mồi của hemophilia, chúng tôi đặt ra nhiệm vụ phải gen F8, cũng như một điều kiện phản ứng chẩn đoán đến cùng để tìm được nguyên PCR chung cho tất cả 24 trình tự mồi của nhân gây bệnh cho người bệnh. Chính vì gen F9 để thu được các sản phẩm PCR đặc vậy, song song với tuyên truyền bệnh, chúng hiệu làm đầu vào cho bước giải trình tự gen tôi đặt ra mục tiêu xây dựng một bộ công cụ Sanger. Nếu sản phẩm PCR không đặc hiệu, hoàn chỉnh, trong đó có nhiều kỹ thuật chẩn tín hiệu giải trình tự sẽ bị nhiễu, không phân đoán đáp ứng được với sự đa dạng của các tích được kết quả. Qua một quá trình thử biến đổi di truyền trong bệnh hemophilia. nghiệm, chúng tôi đã thành công khi tìm Trải qua một quá trình nghiên cứu khá được điều kiện phù hợp chung cho 32 phản dài, chúng tôi đã tối ưu và xây dựng thành ứng PCR khuếch đại gen F8, cũng như điều công các kỹ thuật phân tích đột biến trong điện phù hợp chung cho 12 phản ứng PCR bệnh hemophilia theo đúng định hướng của khuếch đại gen F9. Kết quả được thể hiện ở phác đồ chẩn đoán trên thế giới hiện nay. Đó hình 6. Với các sản phẩm PCR đặc hiệu đó, là tối ưu thành công kỹ thuật Longrange PCR chúng tôi đã giải trình tự gen F8, F9 thành phát đảo đoạn intron 22 theo phương pháp công theo phương pháp Sanger với các tín của Liu Q và cs năm 1998, kỹ thuật hiệu rõ ràng, chính xác (hình 7). multiplex PCR phát hiện đoạn intron 1 theo Chúng tôi tiếp tục ứng dụng thành công phương pháp của Rossetti và cs năm 2005 kỹ thuật MLPA để phân tích các bất thường (kết quả thể hiện ở hình 4, hình 5) (các kết di truyền lớn trong bệnh hemophilia như các quả nghiên cứu này đã được báo cáo tại Hội lặp đoạn gen, mất đoạn gen (hình 12). Mặc nghị Huyết học toàn quốc năm 2012 (đảo dù tỷ lệ các bất thường di truyền này chỉ đoạn intron 22) và năm 2014 (đảo đoạn chiếm tỷ lệ 1%-3% trong số các tổn thương intron 1). Tiếp đó, chúng tôi đã ối ưu thành di truyền liên quan đến bệnh [6] [7], nhưng công kỹ thuật giải trình tự gen Sanger để nếu không xác định được thì sẽ không thể phân tích đột biến trong tất cả các exon, các chẩn đoán được tình trạng mang gen cho tất 813
  13. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU cả các thành viên có nguy cơ mang gen trong thường không có khả năng gây bệnh). Kiểm gia đình người bệnh. tra về mặt lý thuyết trên phần mềm CLC Đặc biệt, chúng tôi đã xây dựng thành chúng tôi nhận thấy các trình tự mồi thiết kế công quy trình giải trình tự gen NGS để phân đã bao phủ hoàn toàn các trình tự đích mong tích di truyền trong bệnh hemophilia (A và muốn (hình 8 và 9). Tiếp tục tối ưu phản ứng B). Sau giải trình tự gen Sanger, có khoảng Longrange PCR các cặp mồi đã thiết kế, 3%-5% trường hợp không phát hiện được đột chúng tôi thu được kết quả ở hình 10 với các biến do vị trí đột biến nằm ở ngoài vùng gen băng sản phẩm đặc hiệu, đúng kích thước. phân tích [11]. Chính vì vậy, trong những Các sản phẩm PCR này được tinh sạch, năm gần đây giải trình tự gen NGS cũng bắt chuẩn bị thư viện và giải trình tự gen NGS. đầu được sử dụng để phân tích di truyền Kết quả giải trình tự NGS ở hình 11 đã cho trong bệnh hemophilia [12][13]. Ưu điểm thấy với gen F9, chúng tôi đã thu được toàn của giải trình tự NGS là có thể giải trình tự bộ trình tự gen dài 35 kb; với gen F8 chúng các vùng gen lớn, thậm chí toàn bộ gen nên tôi thu được toàn bộ vùng gen đích tương hiệu quả phân tích sẽ cao hơn. Tuy nhiên, ứng với vị trí thiết kế mồi. Điều đó cho thấy khác với phương pháp Sanger, hiện nay chưa quy trình NGS chúng tôi đã xây dựng đạt độ có một cách tiếp cận chung hoặc một quy chính xác cao. trình NGS chung để hướng dẫn cho các Với tất cả các kết quả trên, có thể nói với phòng xét nghiệm có nhu cầu triển khai xét việc triển khai được đầy đủ các kỹ thuật phân nghiệm này. Để phân lập gen F8, F9 phục vụ tích đột biến, chúng tôi đã hoàn thiện được cho giải trình tự NGS, đa số các nghiên cứu phác đồ chẩn đoán phân tử bệnh hemophilia. sử dụng công nghệ bắt giữ gen đích bằng các Từ năm 2019, khoa Di truyền & Sinh học probe tổng hợp SureSelect Custom Probe, phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu TW SeqCap Probe, hay xGen Lockdown panels, đã tham gia vào chương trình ngoại kiểm của tuy nhiên việc ứng dụng không phải dễ dàng UK NEQAS. Tất cả các kỹ thuật phân tích do chi phí rất cao. Hiện nay mới chỉ có một đột biến nêu trên đều được phối hợp để phân vài nghiên cứu đột biến gen hemophilia với tích mẫu ngoại kiểm và đều cho kết quả quy mô lớn mới có thể sử dụng các panel chính xác so với kết quả tham chiếu. Điều đó probe này [10] [12] [13]. Với mục tiêu triển một lần nữa khẳng định phác đồ chẩn đoán khai được xét nghiệm NGS đạt độ chính xác phân tử bệnh hemophilia với các kỹ thuật cao mà phí vẫn phù hợp để bệnh nhân có thể đang áp dụng tại Viện Huyết học – Truyền sử dụng, chúng tôi đã nghiên cứu và thiết kế máu TW hoàn toàn đạt độ tin cậy. các cặp mồi đặc hiệu (tương ứng với 8 phân Hình 13 mô tả phác đồ đang áp dụng tại đoạn, a1-a8) để khuếch đại toàn bộ gen F9. Viện. Theo đó, trình tự chỉ định xét nghiệm hợp Với gen F8, chúng tôi thiết kế 13 cặp mồi lý đối với các bệnh nhân hemophilia A chưa có (tương ứng với 13 phân đoạn a1-a13) (bảng tiền sử đột biến trong gia đình như sau: 2) để khuếch đại tất cả các exon, các vùng • Với bệnh nhân mức độ nặng (FVIII nối giữa intron-exon, đầu 5’, 3’ và các vùng
  14. Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2020 intron với kỹ thuật Multiplex PCR TÀI LIỆU THAM KHẢO • Bệnh nhân hemophilia A mức độ trung 1. Swystun, L.L. and P.D. James, Genetic bình, mức độ nhẹ và tất cả các bệnh nhân diagnosis in hemophilia and von Willebrand mức độ nặng âm tính với đảo đoạn intron 22 disease. Blood Rev, 2017. 31(1): p. 47-56. 2. Goodeve, A.C., A. Pavlova, and J. và intron 1: chỉ định xét nghiệm giải trình tự Oldenburg, Genomics of bleeding disorders. gen (Sanger/ NGS) Haemophilia, 2014. 20 Suppl 4: p. 50-3. • Chỉ định xét nghiệm MLPA trong tất cả 3. EAHAD. Coagulation Factor IX Variant các trường hợp giải trình tự gen âm tính hoặc Database. http://www.factorix.org. Feb 2020. nghi ngờ có đột biến mất đoạn lớn. 4. EAHAD. Coagulation Factor IX Variant Với các bệnh nhân hemophilia B: Database. http://www.factorix.org. Feb 2020 • Chỉ định xét nghiệm giải trình tự gen 5. Bowen, D.J.J.M.P., Haemophilia A and (Sanger/NGS) cho tất cả các bệnh nhân haemophilia B: molecular insights. 2002. 55(2): p. 127. (không phân biệt mức độ nặng, trung bình 6. Mitchell, M., S. Keeney, and A.J.H. hay nhẹ). Goodeve, Practice guidelines for the • Chỉ định xét nghiệm MLPA trong tất cả molecular diagnosis of hemophilia A. 2010. các trường hợp giải trình tự gen âm tính hoặc 7. Mitchell, M., S. Keeney, and A.J.H. nghi ngờ có đột biến mất đoạn lớn. Goodeve, Practice guidelines for the Chúng tôi áp dụng phác đồ đã hoàn thiện molecular diagnosis of hemophilia B. 2010. được chẩn đoán phân tử cho 158 bệnh nhân 8. Liu, Q et al. “Single-tube polymerase chain hemophilia A và 100 bệnh nhân hemophilia reaction for rapid diagnosis of the inversion B tại Viện Huyết học – Truyền máu TW. Kết hotspot of mutation in hemophilia A.” Blood vol. 92,4 (1998): 1458-9 quả cho thấy tỷ lệ phân tích đột biến thành 9. Bagnall, Richard D et al. “Recurrent công trong cả 2 thể bệnh là 100%. Điều đó inversion breaking intron 1 of the factor VIII cho thấy phác đồ chẩn đoán phân tử bệnh gene is a frequent cause of severe hemophilia hemophilia tại Viện Huyết học – Truyền máu A.” Blood vol. 99,1 (2002): 168-74 TW đạt hiệu quả rất cao. 10. Johnsen, J.M., et al., Novel approach to genetic analysis and results in 3000 V. KẾT LUẬN hemophilia patients enrolled in the My Life, Qua kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi Our Future initiative. Blood Adv, 2017. 1(13): p. 824-834. rút ra một số kết luận sau: 11. Goodeve, A.C., Hemophilia B: molecular 1. Triển khai thành công các kỹ thuật pathogenesis and mutation analysis. J Thromb phân tích đột biến gen trong bệnh hemophilia Haemost, 2015. 13(7): p. 1184-95 và hoàn thiện được phác đồ chẩn đoán phân 12. Bastida, J.M., et al., Application of a tử bệnh hemophilia tại Viện Huyết học – molecular diagnostic algorithm for Truyền máu TW. haemophilia A and B using next-generation 2. Phác đồ chẩn đoán đạt hiệu quả 100% sequencing of entire F8, F9 and VWF genes. trong phân tích 258 bệnh nhân, bao gồm 158 Thromb Haemost, 2017. 117(1): p. 66-74 bệnh nhân hemophilia A và 100 bệnh nhân 13. Lassalle, F., et al., High-Throughput Genotyping of Haemophilia A and B Using hemophilia B tại Viện Huyết học –Truyền Next-Generation Sequencing Technology in máu TW. Lille University Hospital. 2015, American Society of Hematology Washington, DC. 815
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
3=>0