intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Xây dựng quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

Thêm vào BST
Báo xấu
7
lượt xem 2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết này công bố một quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA và EMA, là cơ sở để phục vụ cho việc đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm chứa IRB và HCTZ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS

  1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Chương Ngọc Nãi*, Lê Thị Đào**, Lê Nguyễn Trung Nguyên*, Nguyễn Văn Trung*, Trần Việt Hùng*, Nguyễn Đức Tuấn** TÓMTẮT Mở đầu: Phối hợp của irbesartan (IRB) và hydroclorothiazid (HCTZ) được chỉ định trong điều trị phù nề và tăng huyết áp. Các nghiên cứu lâm sàng về IRB và HCTZ cho thấy sự kết hợp này có hiệu quả lâm sàng. Cho đến nay, chỉ có một chế phẩm phối hợp IRB và HCTZ được sản xuất trong nước với giá thành rẻ hơn so với các sản phẩm ngoại nhập. Để chứng minh hiệu quả điều trị tương đương giữa thuốc generic và thuốc phát minh, cần phải đánh giá tương đương sinh học in vivo. Kỹ thuật LC-MS/MS có nhiều ưu điểm như độ nhạy và tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích ngắn và giới hạn định lượng các chất thấp trên các nền mẫu dịch sinh học. Vì vậy, kỹ thuật này đang được áp dụng phổ biến để định lượng hoạt chất trong dịch sinh học. Hiện tại, chỉ có một vài công trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS được công bố trên thế giới. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có tác giả nào trong nước công bố quy trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người. Do đó, đề tài này được thực hiện với mục tiêu xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA và EMA, là cơ sở để phục vụ cho việc đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm chứa IRB và HCTZ. Đối tượng nghiên cứu: IRB và HCTZ trong các mẫu huyết tương người giả lập. Phương pháp nghiên cứu: Mẫu huyết tương giả lập chứa các chất phân tích và chuẩn nội telmisartan được xử lý bằng các phương pháp như kết tủa protein với methanol, acetonitril; chiết lỏng-lỏng với tert-butyl methyl ether, ethyl acetat và hỗn hợp tert-butyl methyl ether -ethyl acetat. Mẫu sau khi xử lý sẽ được định lượng bằng kỹ thuật LC-MS/MS, sử dụng cột sắc ký pha đảo, pha động methanol và đệm amoni format 5 mM pH 5. Sau cùng, quy trình định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của US-FDA và EMA. Kết quả: IRB, HCTZ và chuẩn nội đã được ion hóa bằng kỹ thuật ESI và được ghi phổ bằng kỹ thuật MRM để thu được các ion phân tử và ion phân mảnh dùng cho định lượng. Quy trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS đã được xây dựng, sử dụng cột sắc ký Gemini C18 (250 x 2 mm; 5 µm), pha động methanol và đệm amoni format 5 mM, pH 5 (80:20, tt/tt), tốc độ dòng 0,4 ml/phút. Mẫu huyết tương giả lập được xử lý bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với hỗn hợp tert-butyl methyl ether - ethyl acetat (50:50, tt/tt) cho hiệu suất chiết trên 95%. Quy trình định lượng đã được thẩm định đạt yêu cầu của một quy trình phân tích thuốc trong dịch sinh học. Kết luận: Quy trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC- MS/MS đã được xây dựng và thẩm định với độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao. Quy trình có thể được ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của các chế phẩm chứa IRB và HCTZ. Từ khóa: LC-MS/MS, irbesartan, hydroclorothiazid, huyết tương người * Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh ** Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913799068 Email: ductuan@ump.edu.vn B – Khoa học Dược 131
  2. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 ABSTRACT DEVELOPMENT OF LC-MS/MS METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF IRBESARTAN AND HYDROCHLOROTHIAZIDE IN HUMAN PLASMA Chuong Ngoc Nai, Le Thi Dao, Le Nguyen Trung Nguyen, Nguyen Van Trung, Tran Viet Hung, Nguyen Duc Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 2 - 2020: 131 - 141 Background - Objectives: Combination of irbesartan (IBR) and hydrochlorothiazide (HCTZ) is indicated in the treatment of edema and hypertension. Clinical studies on IRB and HCTZ suggest that this combination is effective. So far, there has been only one formulation of IRB and HCTZ combination produced locally with a competitive price than one of imported products. In order to prove clinically equivalent efficacy between generic and patent drugs, the in vivo bioequivalence study is mandatory. The LC-MS/MS technique has several advantages such as high sensitivity and specificity, short analysis time and low limit of quantitation. This technique is being applied commonly to quantify active ingredients in biological fluids. There have been several simultaneous quantitative studies of IRB and HCTZ in human plasma by LC-MS/MS until now. However, no local authors have published the simultaneous quantitative studies of IRB and HCTZ in human plasma, so far. Therefore, this study has been performed with the aim of development and validation of the simultaneous quantitative procedure of irbesartan and hydrochlorothiazide in human plasma by LC-MS/MS in accordance with the guidelines of US-FDA and EMA, contributing to the in vivo bioequivalence study of pharmaceuticals containing IRB and HCTZ. Method: The object of this study is IRB and HCTZ spiked into blank human plasma samples. Method: Blank human plasma samples containing the analytes and telmisartan as internal standard, were treated by protein precipitation with methanol, acetonitrile; liquid-liquid extraction with tert-butyl methyl ether, ethyl acetate and mixture of tert-butyl methyl ether and ethyl acetate. The treated samples were quantified by LC-MS/MS, using reverse phase column, mobile phase containing methanol and ammonium formate buffer 5 mM with pH 5. Finally, the quantitative procedure was validated on the basis of FDA and EMA guidelines on bioanalytical method validation. Results: IRB, HCTZ and internal standard were ionized using ESI source and detected by multiple reaction monitoring (MRM) mode to obtain molecular ions and fragment ions for quantification. The procedure for simultaneous assay of IRB and HCTZ in human plasma by LC-MS/MS was developed, using Gemini C18 column (250 x 2 mm; 5 µm), mobile phase containing methanol and ammonium formate buffer 5 mM with pH 5 (80:20, v/v), and flow rate of 0.4 ml/min. The human plasma samples were treated by liquid-liquid extraction with a mixture of tert-butyl methyl ether and ethyl acetate (50:50, v/v), which gave the recovery above 95%. The procedure was successfully validated with general requirements for a bioanalytical procedure. Conclusion: The procedure for simultaneous assay of IRB and HCTZ in human plasma by LC-MS/MS was succesfully developed and validated, that proves high sensitivity, specificity and accuracy. The procedure can be applied for in vivo bioequivalence study of combination medical products containing IBR and HCTZ. Keywords: LC-MS/MS, irbesartan, hydrochlorothiazide, human plasma ĐẶTVẤNĐỀ nghiên cứu lâm sàng về IRB và HCTZ cho thấy sự kết hợp này có hiệu quả lâm sàng(1). Phối hợp của irbesartan (IRB) và Cho đến nay, chỉ có một chế phẩm phối hợp hydroclorothiazid (HCTZ) được chỉ định IRB và HCTZ được sản xuất trong nước với trong điều trị phù nề và tăng huyết áp. Các 132 B – Khoa học Dược
  3. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu giá thành rẻ hơn so với các sản phẩm ngoại đánh giá tương đương sinh học của các chế nhập. Để giảm chi phí điều trị cho người bệnh phẩm chứa IRB và HCTZ. thì cần phải đánh giá tương đương sinh học ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU giữa thuốc generic và thuốc phát minh. Kỹ thuật LC-MS/MS có nhiều ưu điểm như độ Đối tượng nghiên cứu nhạy và tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích IRB và HCTZ trong các mẫu huyết tương ngắn và giới hạn định lượng các chất thấp trên người giả lập. các nền mẫu dịch sinh học. Vì vậy, kỹ thuật Nguyên vật liệu này đang được áp dụng phổ biến để định Chất chuẩn lượng hoạt chất trong dịch sinh học. Hiện tại, chỉ có một vài công trình định lượng đồng thời Irbesartan (IRB) có số lô QT201 040717, hàm IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng lượng 99,40% tính trên nguyên trạng; kỹ thuật LC-MS/MS được công bố trên thế Telmisartan (chuẩn nội, IS) có số lô QT217 giới(2,3). Tuy nhiên, cho đến nay chưa có tác giả 030617, hàm lượng 99,70% tính trên nguyên nào trong nước công bố quy trình định lượng trạng. Tất cả do Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương Chí Minh cung cấp. Hydroclorothiazid (HCTZ) người. Bài báo này công bố một quy trình định có số lô 0114308.01, hàm lượng 99,55% tính trên lượng đồng thời irbesartan và nguyên trạng do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung hydroclorothiazid trong huyết tương người ương cung cấp. Hình 1 minh họa công thức cấu bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn của tạo của IRB, HCTZ và IS. US-FDA và EMA, là cơ sở để phục vụ cho việc 8 7 9 3 5 2 4 6 4 3 1 5 1 3' 2 2' 4' 6 4 2 5 3 6 7 1' 3 1 5 3 4 6 2 5' 4 6' 2 2 1 4 1 5 1' 3 6' 2' 1 5 7 3' 6 5' 4' Telmisartan (IS) Irbesartan (IRB) 5 6 4 3 7 1 2 8 Hydroclorothiazid (HCTZ) Hình 1. Công thức cấu tạo của irbesartan, hydroclorothiazid và chuẩn nội telmisartan B – Khoa học Dược 133
  4. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Dung môi, hoá chất tín hiệu các mảnh ion có tỷ số khối lượng/điện tích (m/z) cao nhất. Acetonitril và methanol đạt tiêu chuẩn dùng cho LC-MS. Ethyl acetat, tert-butyl methyl ether, Khảo sát điều kiện sắc ký dicloromethan, acid phosphoric, amoni format, Dựa vào đặc tính, cấu trúc hóa học của các acid formic đạt tiêu chuẩn phân tích. chất phân tích và tham khảo tài liệu được công Huyết tương trắng bố(2), các điều kiện sắc ký sau đây được lựa chọn Do bệnh viện Truyền máu và Huyết học TP. để khảo sát: hệ pha động acetonitril/ methanol – amoni format 5 mM (pH từ 3 – 6), thay đổi tỷ lệ Hồ Chí Minh cung cấp, được bảo quản ở  -25oC. thích hợp và nồng độ amoni format; Tốc độ Thiết bị và dụng cụ phân tích dòng 0,35 – 0,45 mL/phút; Nhiệt độ cột sắc ký 30 Các thiết bị phân tích đều được hiệu chuẩn - 45oC; Thể tích tiêm mẫu 2 – 10 µL. Chọn điều theo yêu cầu của GLP và ISO/IEC 17025, bao kiện sắc ký thích hợp sao cho các pic hoạt chất và gồm: hệ thống LC-MS/MS 8040 (Shimadzu - pic chất chuẩn nội cân đối, thời gian phân tích Nhật Bản), cân phân tích (Mettler Toledo - Thuỵ ngắn và tín hiệu cao. Sĩ) và máy đo pH (Mettler Toledo - Thuỵ Sĩ). Các Khảo sát phương pháp xử lý mẫu dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu chính xác dùng Dựa theo các công trình đã công bố(2,4) và độ trong phân tích: bình định mức, micropipet. phân cực của chất phân tích, phương pháp tủa Phương pháp nghiên cứu protein và chiết lỏng - lỏng đã được lựa chọn. Chuẩn bị mẫu Chọn phương pháp xử lý mẫu sao cho hiệu suất Dung dịch chuẩn chiết cao, ổn định, sự ảnh hưởng của nền mẫu là Gồm IRB, HCTZ, IS được pha trong tối thiểu. methanol với nồng độ mỗi chất là 1 µg/mL để Xác định khoảng nồng độ định lượng tiến hành khảo sát điều kiện khối phổ. Hỗn hợp Sau khi đã thiết lập được điều kiện sắc ký, chuẩn gồm IRB, HCTZ, IS được pha trong điều kiện khối phổ và phương pháp xử lý mẫu, methanol với nồng độ mỗi chất là 100 ng/mL để cần phải tính toán xây dựng khoảng nồng độ tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký. Mẫu giả lập tuyến tính của từng hoạt chất trong quy trình và được chuẩn bị bằng cách thêm hỗn hợp chuẩn các mức nồng độ của các mẫu kiểm chứng vào huyết tương trắng với tỷ lệ 5% thể tích. (LLOQ, LQC, MQC, HQC) phù hợp với đường Khảo sát điều kiện khối phổ chuẩn và theo những hướng dẫn của quy trình Quy trình phân tích được thực hiện trên hệ định lượng thuốc trong dịch sinh học(5,6). Dựa thống LC-MS/MS với các điều kiện khối phổ ban vào nồng độ Cmax của IRB và HCTZ từ các tài liệu đầu như tốc độ dòng khí nitơ 15,0 lít/phút, tốc độ tham khảo(2,3) xác định khoảng nồng độ định dòng khí phun 3,0 lít/phút, nhiệt độ khí bay hơi lượng các hoạt chất. 250oC, nhiệt độ buồng ion hóa 400oC, áp suất khí Thẩm định quy trình phân tích: phun 25 psi, điện thế mao quản 4000 V. Quy trình định lượng IRB và HCTZ trong Các điều khảo sát bao gồm : chế độ ESI để huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS khảo sát mảnh ion phân tử của các chất, chế độ được thẩm định dựa theo những quy định và MRM để khảo sát mảnh ion định lượng của yêu cầu trong hướng dẫn của US-FDA và các chất, thế phân mảnh và năng lượng va EMA về các chỉ tiêu tính đặc hiệu; đường chạm được khảo sát và tối ưu hóa bằng công chuẩn và khoảng tuyến tính; giới hạn định cụ tối ưu hóa tự động Optimize Voltage của lượng dưới; độ đúng và độ chính xác; hiệu phần mềm Lab Solutions 5.0 sao cho thu được suất chiết; ảnh hưởng của nền mẫu, lượng 134 B – Khoa học Dược
  5. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu mẫu tồn dư và độ pha loãng; độ ổn định của Hoạt chất IRB HCTZ IS Thông số hoạt chất(5,6). Tốc độ dòng khí bay hơi (L/phút) 15 15 15 o KẾT QUẢ Nhiệt độ buồng ion hoá ( C) 400 400 400 Chế độ ghi phổ MRM Khảo sát điều kiện khối phổ Thế Q1 (V) -24 14 -24 Năng lượng va chạm (V) -26 20 -50 Bảng 1. Các thông số khối phổ tối ưu để phân tích Thế Q2 (V) -20 16 -26 IRB, HCTZ và IS Ion phân tử 429,15 295,90 515,00 Hoạt chất Ion phân mảnh 207,00 268,95 276,10 IRB HCTZ IS Thông số Bảng 1 tóm tắt điều kiện khối phổ tối ưu để Kiểu ion hóa ESI + - + Điện thế ion hóa (V) 4000 4000 4000 phân tích IRB và HCTZ. Hình 2 minh họa phổ o Nhiệt độ khí bay hơi ( C) 250 250 250 khối của các chất phân tích. Tốc độ dòng khí phun (L/phút) 3 3 3 Inten. (x1,000,000) Inten. (x1,000,000) 5.0 115 207 (A) (B) 4.0 1.5 3.0 429 1.0 429 2.0 0.5 195 1.0 0.0 0.0 100 200 300 400 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z Inten. (x10,000,000) Inten. (x100,000) 4.0 269 296 1.00 (C) 205 (D) 3.0 296 0.75 2.0 0.50 298 0.25 332 1.0 239 359 165 126 0.00 0.0 100 150 200 250 300 350 400 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z Inten. (x1,000,000) Inten. (x1,000,000) 1.50 276 515 (E) (F) 1.25 ) 5.0 1.00 497 0.75 2.5 0.50 193 289 515 0.25 371 413 537 317 467 0.00 0.0 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z Hình 2. Phổ khối (ion phân tử và ion phân mảnh) của IRB (A và B), HCTZ (C và D), và IS (E và F) ở cùng nồng độ 1 µg/mL Khảo sát điều kiện sắc ký đầu như sau: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 2 Quy trình phân tích được thực hiện trên hệ mm; 5 µm), nhiệt độ cột 40oC, tốc độ dòng 0,4 thống LC-MS/MS với các điều kiện sắc ký ban mL/phút, thể tích tiêm 5 µL. Hỗn hợp chuẩn B – Khoa học Dược 135
  6. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 IRB và HCTZ: 100 ng/mL. Nồng độ dung dịch khi pH tăng từ 5 đến 6. Tuy nhiên, dung dịch chuẩn nội 100 ng/mL. đệm amoni format ở pH 6 không ổn định, dễ bị Khảo sát pha động thay đổi pH khi tiến hành sắc ký trong thời gian dài do amoni format bị phân ly thành NH4+ trong Hai hệ pha động sau đây đã được tiến dung dịch làm pH giảm. Vì vậy, pha động hành khảo sát: acetonitril–amoni format 10 methanol - đệm amoni format 5 mM với pH 5 mM pH 5 (80:20) và methanol–amoni format (80:20) được lựa chọn. 10 mM pH 5 (80:20). Các kết quả khảo sát cho thấy với pha động acetonitril - amoni format Khảo sát tốc độ dòng 10 mM pH 5 (80:20), các chất phân tích không Tiến hành khảo sát tốc độ dòng từ 0,35–0,45 tách hoàn toàn, pic không cân đối. Trong khi mL/phút. Các kết quả khảo sát cho thấy khi tốc đó, với pha động methanol - amoni format 10 độ dòng tăng thì thời gian lưu của các chất phân mM pH 5 (80:20), các chất tách hoàn toàn, pic tích giảm nhiều nhưng áp suất hệ thống lớn hơn cân đối và tín hiệu cao nên pha động này được 200 bar khi tốc độ dòng lên đến 0,45 mL/phút. Vì lựa chọn để khảo sát tiếp. vậy tốc độ dòng 0,4 mL/phút được lựa chọn. Khảo sát nồng độ dung dịch amoni format Khảo sát nhiệt độ cột Tiến hành khảo sát nồng độ dung dịch Khi khảo sát nhiệt độ cột từ 30 - 45oC, tất cả amoni format từ 1-10 mM. Các kết quả khảo sát các chất đều tách hoàn toàn trong khoảng nhiệt cho thấy với dung dịch amoni format 1 mM, các độ khảo sát. Khi nhiệt độ cột tăng thời gian lưu chất không tách được. Khi nồng độ dung dịch của các chất phân tích giảm không đáng kể amoni format tăng từ 3-10 mM, thời gian lưu của nhưng áp suất hệ thống giảm dưới 200 bar khi các chất giảm, tất cả các chất tách hoàn toàn. Ở nhiệt độ cột từ 40 - 45oC do độ nhớt của pha nồng độ 5 mM, pic các chất cân đối, cường độ tín động giảm. Khi nhiệt độ cột 45oC, hệ số đối xứng hiệu các chất khác nhau không nhiều so với của HCTZ lớn hơn 1,5. Ngoài ra, nếu sử dụng nồng độ 3 và 10 mM. Ngoài ra, việc sử dụng cột sắc ký ở nhiệt độ cao trong thời gian phân dung dịch muối có thể gây ức chế sự ion hóa và tích dài sẽ làm giảm tuổi thọ cột. Vì vậy nhiệt độ gây ô nhiễm nguồn ion nên dung dịch amoni cột 40oC được lựa chọn. format nên được sử dụng ở mức nồng độ cần thiết và tối thiểu. Vì vậy, nồng độ dung dịch Khảo sát thể tích tiêm amoni format 5 mM được lựa chọn. Khi thể tích tiêm mẫu tăng từ 2 - 10 µL, Khảo sát tỷ lệ pha động thời gian lưu của các chất phân tích thay đổi Tiến hành khảo sát tỷ lệ pha động với tỷ lệ không đáng kể nhưng hệ số đối xứng của methanol từ 60 - 90%. Các kết quả khảo sát cho hydroclorothiazid thay đổi nhiều và có giá trị thấy với tỷ lệ methanol 80%, tất cả các chất tách khoảng từ 1,5 trở lên khi thể tích tiêm mẫu hoàn toàn, thời gian phân tích ngắn, pic cân đối tăng từ 3 đến 10 µL. Với thể tích tiêm 2 µL tín và cường độ tín hiệu cao nên pha động methanol hiệu các pic vẫn cao. Vì vậy, thể tích tiêm 2 µL - amoni format 5 mM pH 5 với tỷ lệ 80:20 được được lựa chọn. lựa chọn. Từ các kết quả khảo sát, điều kiện sắc ký Khảo sát pH dung dịch amoni format: Tiến thích hợp để định lượng đồng thời IRB và HCTZ hành khảo sát pH dung dịch amoni format như sau: pha động methanol – dung dịch đệm từ 3 đến 6. Các kết quả khảo sát cho thấy khi amoni format 5 mM pH 5 (80:20, tt/tt), cột sắc ký pH dung dịch amoni format tăng từ 3 đến 4, các Gemini C18 (250 x 2 mm; 5 µm), nhiệt độ cột chất không tách hoàn toàn. Trong khi đó, các 40oC, tốc độ dòng 0,4 mL/phút, thể tích tiêm 2 µL chất tách hoàn toàn và chiều cao pic HCTZ tăng và nhiệt độ khay chứa mẫu 10oC. 136 B – Khoa học Dược
  7. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu Khảo sát phương pháp xử lý mẫu bằng 50 µL dung dịch H3PO4 10% (tt/tt), lắc 10 Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp tủa giây. Chiết 2 lần, mỗi lần 2,5 mL ethyl acetat, lắc protein không phù hợp vì mẫu sau khi xử lý cho xoáy 1500 vòng/phút trong 1 phút, lắc vòng 300 pic HCTZ bị chẻ đôi nên hiệu suất không chính vòng/phút trong 5 phút, ly tâm 4000 vòng/phút xác khi áp dụng với chất có nồng độ trong huyết trong 5 phút, lấy dịch trong của 2 lần chiết, bốc tương thấp như HCTZ. Do đó phương pháp hơi dung môi tới cắn dưới dòng khí nitơ ở 40oC. chiết lỏng – lỏng được lựa chọn. Hòa tan cắn trong 500 µL methanol, lắc xoáy 2500 vòng/phút trong 1 phút, siêu âm 5 phút, ly Khảo sát dung môi chiết tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 0oC, lọc qua Với dung môi ethyl acetat, hiệu suất chiết màng lọc milipore 0,22 µm. chuẩn nội và IRB lần lượt tăng lên khoảng 6 và 2 Minh họa sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (Hình 3). lần so với dung môi tert-butyl methyl ether, trong khi đó hiệu suất chiết HCTZ thì tương đương. Với hỗn hợp dung môi tert-butyl methyl 40000 I r b e s a r t a n /3 .8 5 0 T e l m i s a r t a n /4 . 2 0 3 ether – ethyl acetat (5:5), hiệu suất chiết chuẩn H C T Z /1 .5 9 9 nội tăng so với dung môi ethyl acetat, trong khi 30000 đó hiệu suất chiết IRB thì tương đương nhưng hiệu suất chiết HCTZ giảm khoảng 3 lần. Vì vậy dung môi chiết ethyl acetat được lựa chọn để 20000 tiếp tục khảo sát. Khảo sát nồng độ kiềm hóa huyết tương 10000 Hiệu suất chiết HCTZ không ổn định với giá trị RSD lớn hơn 20%. Vì vậy, không kiềm hóa 0 mẫu huyết tương khi chiết mẫu. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 min Khảo sát nồng độ acid hóa huyết tương Hình 3. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn nồng độ 100 ng/mL Khi acid hóa huyết tương, hiệu suất chiết Xác định khoảng nồng độ định lượng các chất cao hơn so với không acid hóa huyết tương. Với nồng độ acid phosphoric 10% hiệu Các kết quả thăm dò và xây dựng phương suất chiết của chuẩn nội và chất phân tích cao pháp sắc ký cho phép xây dựng được khoảng và ổn định nên nồng độ này được lựa chọn để nồng độ định lượng các hoạt chất, được trình acid hóa mẫu huyết tương trước khi chiết. bày trong Bảng 2. Ngoài ra, để đáp ứng phần yêu cầu tính tuyến tính và đặc hiệu, cần chuẩn Khảo sát thể tích acid hóa huyết tương bị thêm mẫu trắng và mẫu không. Trong đó, Với thể tích 50 µL H3PO4 10%, hiệu suất chiết mẫu trắng là mẫu huyết tương không có các chất cao, ổn định và tương đương nhau. chuẩn nội còn mẫu không là mẫu huyết tương Khảo sát số lần chiết trắng được thêm chuẩn nội. Sau 2 lần chiết, hiệu suất chiết của tất cả các Thẩm định quy trình phân tích chất khoảng 95% nên số lần chiết được chọn là 2. Bảng 3 tóm tắt kết quả thẩm định quy trình Từ các kết quả khảo sát, quy trình xử lý mẫu định lượng IRB và HCTZ trong huyết tương huyết tương được đề xuất như sau: người bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng Lấy chính xác 1 mL huyết tương, cho vào dẫn của US-FDA và EMA. Hình 4 minh họa ống nghiệm, thêm 50 µL dung dịch chuẩn nội sắc ký đồ huyết tương trắng và mẫu giả lập telmisartan 1000 ng/mL, lắc 10 giây, acid hóa chứa chất phân tích ở LLOQ. B – Khoa học Dược 137
  8. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Bảng 2. Nồng độ của các hoạt chất trong huyết tương Nồng độ của các hoạt chất trong huyết tương (ng/mL) Dung dịch 1 (LLOQ) 2 (LQC) 3 4 5 6 7 (MQC) 8 9 (HQC) 10 (ULOQ) IRB 5 15 300 600 1500 1800 3000 3600 4800 6000 HCTZ 0,9 3 15 30 75 90 150 180 240 300 IS 90 ULOQ: giới hạn định lượng trên; Dung dịch 1, 2, 3: chỉ số thứ tự dung dịch. Các dung dịch LLOQ, LQC, MQC, HQC và ULOQ lần lượt có nồng độ tương đương với các dung dịch 1, 2, 7, 9 và 10 Bảng 3. Tóm tắt kết quả thẩm định STT Chỉ tiêu Kết quả Mẫu huyết tương giả lập ở mức nồng độ LLOQ có các pic HCTZ (1,675 phút), IRB (3,886 phút) và telmisartan (4,489 phút) tách hoàn toàn. Mẫu huyết tương trắng không xuất hiện pic tại các vị trí pic của IRB, HCTZ và IS. Tỷ số thời gian lưu của IRB và HCTZ so với IS lần lượt 1 Tính đặc hiệu là 0,861 và 0,376. Tín hiệu đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IRB và HCTZ không vượt quá 20% tín hiệu đáp ứng của chất phân tích ở nồng độ LLOQ. Tín hiệu đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chuẩn nội không vượt quá 5% tín hiệu đáp ứng của chuẩn nội ở mẫu LLOQ. Ở nồng độ IRB 5 ng/mL và HCTZ 0,9 ng/mL, các kết quả sau khi phân tích đều cho tỷ số Giới hạn định lượng 2 S/N lớn hơn 5 và đạt độ chính xác và độ đúng theo qui định. Do đó các nồng độ này được dưới (n=6) chấp nhận là giới hạn định lượng dưới. Phương trình hồi quy Đường chuẩn và khoảng 2 3 - IRB (0,005 – 6,00 µg/mL): y = 1,2933x + 0,0867; R = 0,9964 tuyến tính (n=10) 2 - HCTZ (0,9 – 300 ng/mL): y = 0,0001x + 0,0001; R = 0,9981 Độ đúng và độ chính xác Ở 4 mức nồng độ LLOQ, LQC, MQC và HQC: IRB (95,26 – 106,00%; CV: 3,38 – 9,31%), 4 trong ngày và khác ngày HCTZ (101,03 – 107,20%; CV: 2,34 – 6,27%), (n=18) Ở 3 mức nồng độ LQC, MQC và HQC: IRB (90,70 – 103,52%; CV: 1,69 – 4,62%), HCTZ 5 Hiệu suất chiết (n=6) (94,72 – 103,61%; CV: 1,63 – 8,56%), IS (88,48 – 103,12%; CV: 1,64 – 3,40%) o Dung dịch chuẩn gốc ổn định ở -20 C trong ít nhất 62 ngày. Chất phân tích trong huyết o o 6 Độ ổn định tương ổn định ở nhiệt độ phòng 25 C trong 6 giờ, buồng tiêm mẫu 10 C trong 48 giờ, sau 3 o chu kỳ đông-rã đông và ở -70 C trong vòng 62 ngày. Tỷ số MFIRB/ MFIS và MFHCTZ/ MFIS ở mức nồng độ LQC và HQC có giá trị CV lần lượt là Ảnh hưởng nền mẫu 7 1,74-5,83% và 2,61-8,88% (≤ 15%). Phương pháp phân tích có bị ảnh hưởng bởi nền mẫu (Matrix factor, MF), (n=6) nhưng vẫn nằm trong mức cho phép. Kết quả khảo sát cho thấy không có sự ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư đối với IRB, 8 Lượng mẫu tồn dư (n=6) HCTZ và IS. Tỷ lệ thu hồi của IRB và HCTZ đều nằm trong giới hạn cho phép 85 – 115% với giá trị CV 9 Hệ số pha loãng của tỷ lệ thu hồi không quá 15%. Vậy quy trình xử lý mẫu đã xây dựng không bị ảnh hưởng bởi độ pha loãng. Hình 4. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (A), (B), (C) và mẫu huyết tương giả lập có chứa irbesartan (A’), hydroclorothiazid (B’) và telmisartan (C’) ở mức nồng độ LLOQ 138 B – Khoa học Dược
  9. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu BÀNLUẬN một nền mẫu phức tạp như huyết tương, nếu hệ số đối xứng không đạt yêu cầu, tín hiệu Kỹ thuật ion hóa ESI có những ưu điểm như không cao thì sẽ gây sai số trong định lượng. ion hóa êm dịu hơn, thích hợp để phân tích các Vì vậy cần phải tiến hành khảo sát pha động, hợp chất kém bền với nhiệt, không tạo ra quá tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu, cột phân tích, nhiều phân mảnh giúp cho việc lựa chọn mảnh nhiệt độ cột để lựa chọn được điều kiện sắc ký ion định lượng đặc hiệu hơn và có độ nhạy cao hơn. Trong nghiên cứu này, chuẩn nội và thích hợp. Amoni format là một muối dễ bay irbesartan được ion hóa với kiểu ESI(+), trong hơi nên đã được sử dụng là một thành phần khi đó hydroclorothiazid được ion hóa với kiểu của pha động khi phân tích bằng kỹ thuật sắc ESI(-). Năm 2015, Katteboina và cộng sự đã khảo ký lỏng với đầu dò khối phổ. Trong nghiên sát các kiểu ion hóa IRB và đã rút ra kết luận IRB cứu này, nồng độ và pH của dung dịch đệm nên được ion hóa ở chế độ ESI(+) vì sẽ thu được amoni format đã được khảo sát và đánh giá sự cường độ tín hiệu cao nhất và ổn định(7). HCTZ phù hợp khi kết hợp với các dung môi hữu cơ là chất có nhóm SO2 tạo hệ thống liên hợp  -  -  , như methanol và acetonitril để có được pha N có đôi điện tử tự do tham gia vào hệ thống động thích hợp. liên hợp làm cho H liên kết với N rất linh động Cường độ tín hiệu đáp ứng khi phân tích nên dễ bị cắt đứt. Vì vậy, HCTZ không có khả mẫu bằng phương pháp khối phổ dễ bị ảnh năng nhận proton để chuyển thành cation mà hưởng của nhiều yếu tố như: quá trình chuẩn bị ngược lại dễ chuyển thành anion hơn nên phù mẫu, điều kiện ion hóa chất phân tích, độ nhạy hợp với chế độ ion hóa âm. Chuẩn nội telmisartan có các nguyên tử nitơ thứ cấp, dễ của bộ phận phát hiện. Do đó, cường độ tín hiệu nhận proton tạo cation nên phù hợp với chế độ của chất phân tích chịu sự thay đổi đáng kể giữa ion hóa dương. Kỹ thuật ghi phổ MRM được lựa các lần phân tích khác nhau trên cùng một mẫu chọn trong phân tích định lượng vì có độ đặc phân tích, cùng nồng độ chất phân tích và cùng hiệu và độ nhạy cao. Trong thực tế, khi tiến hành một máy phân tích. Bên cạnh đó, huyết tương phân tích vết như định lượng hoạt chất trong người là nền mẫu phức tạp nên dễ ảnh hưởng dịch sinh học, đòi hỏi lựa chọn ít nhất hai ion đến kết quả phân tích. Vì vậy, một chất chuẩn phân mảnh, một ion định tính, một ion định nội thường được yêu cầu thêm vào huyết tương lượng cũng như để có được sự chọn lọc tốt hơn ở giai đoạn sớm nhất có thể trong quá trình xử lý từ các thành phần nội sinh trong nền mẫu huyết mẫu. Cả chất chuẩn nội và chất phân tích được tương. Vì vậy, kỹ thuật ghi phổ MRM đã được phân tích đồng thời để bù lại cho mọi biến đổi có lựa chọn để phân tích định lượng trong nghiên thể có trong quá trình xử lý và phân tích mẫu. cứu này. Ở tứ cực thứ nhất, các ion phân tử có Do đó, việc sử dụng chuẩn nội giúp quy trình giá trị m/z lần lượt là 429,15 và 295,90 tương ứng định lượng đạt được kết quả chính xác và tin với IRB và HCTZ, đã được chọn để đưa vào cậy. Dựa vào các tài liệu tham khảo(2-4) chất buồng va chạm. Lựa chọn này cũng giống với chuẩn nội được lựa chọn để sử dụng thường là các nghiên cứu định lượng IRB và HCTZ trong huyết tương(2-4). Trong buồng va chạm, ion phân các chất đồng vị ổn định và các chất có cấu trúc mảnh của IRB và HCTZ có giá trị m/z lần lượt là tương tự với chất phân tích. Tuy nhiên, các chất 207,10 và 268,95 cho tín hiệu cao và ổn định nên đồng vị ổn định có giá thành cao và ít có sẵn trên được chọn là ion định lượng. thị trường. Vì vậy, trong nghiên cứu này các chất Việc lựa chọn pha động, tốc độ dòng, thể có cấu trúc tương tự với chất phân tích như tích tiêm mẫu và cột phân tích phù hợp sẽ cải losartan, valsartan, telmisartan đã được lựa chọn thiện độ nhạy và độ chọn lọc của phương để khảo sát. Các chất này thỏa mãn được yêu cầu pháp phân tích định lượng. Đối với những về mặt cấu trúc gần giống với IRB và HCTZ. Từ chất có hàm lượng rất thấp như HCTZ trong kết quả thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện khối B – Khoa học Dược 139
  10. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 phổ của từng chuẩn nội, telmisartan có cường độ HCTZ lần lượt là 5 ng/mL và 0,9 ng/mL, thấp tín hiệu của ion định lượng cao hơn so với hơn so với quy trình sử dụng cùng kỹ thuật losartan, valsartan ở cùng nồng độ 1 µg/mL. phân tích LC-MS/MS đã được công bố trước đó. Ngoài ra, telmisartan có sẵn dạng tinh khiết trên Nghiên cứu của Tutunji và cộng sự có LLOQ của thị trường và giá thành hợp lý. Vì vậy, IRB và HCTZ lần lượt là 60 ng/mL và 1 ng/mL(2). telmisartan đã được lựa chọn làm chuẩn nội của Như vậy, độ nhạy của phương pháp với kỹ phương pháp phân tích. thuật xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng- Trong quá trình xây dựng quy trình xử lý lỏng cho phép xác lập giá trị LLOQ ở mức thấp mẫu, phương pháp chiết pha rắn có chi phí hơn với các mức đã công bố trước đây. Đây là cao nên không được lựa chọn để khảo sát, một trong những ưu điểm của phương pháp phương pháp tủa protein với dung môi tủa phân tích. protein như methanol và acetonitril cho thấy KẾTLUẬN pic bị chẻ đôi, hiệu suất không ổn định với Quy trình định lượng đồng thời IRB và chất có nồng độ thấp như HCTZ. Với phương HCTZ trong huyết tương người bằng kỹ thuật pháp chiết lỏng-lỏng, kết quả cho thấy mẫu LC-MS/MS đã được xây dựng và thẩm định đáp sau khi chiết sạch hơn, ít pha loãng hơn so với ứng các yêu cầu theo hướng dẫn của US-FDA và phương pháp tủa protein nên nồng độ các EMA về thẩm định phương pháp phân tích hoạt chất phân tích tăng lên, dẫn đến cường độ tín chất trong dịch sinh học. Phương pháp xử lý hiệu tăng đối với HCTZ. Vì vậy, phương pháp mẫu nhanh và đơn giản. Các kết quả thẩm định chiết lỏng-lỏng đã được lựa chọn. Việc acid đã chứng tỏ quy trình có tính đặc hiệu, độ nhạy hóa huyết tương bằng acid phosphoric trước cao, độ đúng và độ chính xác cao. Quy trình có khi chiết giúp cắt đứt liên kết giữa dược chất thể được ứng dụng để xác định sinh khả dụng và protein nên làm tăng hiệu suất chiết đáng và đánh giá tương đương sinh học của chế phẩm kể và hầu như chiết kiệt các chất. Qua thực chứa IRB và HCTZ. nghiệm cho thấy hiệu suất chiết các chất phân tích đều cao và ổn định, đảm bảo phương TÀILIỆUTHAMKHẢO pháp chiết lỏng-lỏng hoàn toàn có thể áp dụng 1. Bộ Y Tế (2015). Dược thư Quốc Gia Việt Nam, pp.777-779, 835- 837. Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội. cho quy trình phân tích các chất trong mẫu 2. Tutunji LF, Maha F, Tutunji, Mamoun I, et al (2010). huyết tương người sau này. Simultaneous determination of irbesartan and Đề tài đã xây dựng được quy trình xử lý hydrochlorothiazide in human plasma using HPLC coupled with tandem mass spectrometry: Application to bioequivalence mẫu thích hợp nên có hiệu suất chiết rất cao studies. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 985- với giá trị trung bình lần lượt là 97,47%, 990. 98,48% và 96,44% tương ứng với IRB, HCTZ 3. Qiua X, Wang Z, Wanga B, et al (2014). Simultaneous và chuẩn nội telmisartan. So sánh với một số determination of irbesartan and hydrochlorothiazide inhuman plasma by ultra high performance liquid công trình đã công bố trước đó(2,8) quy trình xử chromatographytandem mass spectrometry and its lý mẫu trong nghiên cứu của chúng tôi có hiệu application to abioequivalence study. Journal of suất chiết cao và ổn định hơn (CV < 10%). Chromatography B, 957:110-115. 4. Singh B, Lokhandae RS, Dwivedi A, Sharma S, Dubey N Độ nhạy của phương pháp phân tích cũng có (2013). Improved simultaneous quantitation of candesartan thể được xem là giới hạn định lượng dưới and hydrochlorthiazide in human plasma by UPLC–MS/MS (LLOQ). Vì vậy, việc xác định LLOQ đóng vai and its application in bioequivalence studies. Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(2):144-152. trò quan trọng trong phát triển phương pháp 5. EMA (2015). Guideline on bioanalytical method validation, phân tích hoạt chất trong dịch sinh học. Trong pp.1-23. European Medicines Agency, United Kingdom UK. nghiên cứu của chúng tôi, LLOQ của IRB và 6. FDA (2018). Guidance for industry - Bioanalytical method 140 B – Khoa học Dược
  11. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu validation, pp.1-41. Rockville, USA. extraction technique: a pharmacokinetic study. International 7. Shah JV, Shah PA, Sanyal M, et al (2017). Simultaneous Journal of Pharmaceutical Sciences, 7(9):335-340. quantification of amiloride and hydrochlorothiazide in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Ngày nhận bài: 18/10/2019 Journal of Pharmaceutical Analysis, 7(5):288-296. Ngày phản biện nhận xét bài báo: 08/11/2019 8. Katteboina MY, Pilli NR, Inamadugu JK, et al (2015). LC- Ngày bài báo được đăng: 20/03/2020 MS/MS assay for irbesartan in human plasma using solid phase B – Khoa học Dược 141
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
8=>2