Xây dựng quy trình phân loại nhóm nguy cơ của u nguyên bào thần kinh khuếch đại MYCN

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN LOẠI NHÓM NGUY CƠ<br /> CỦA U NGUYÊN BÀO THẦN KINH KHUYẾCH ĐẠI MYCN<br /> Trương Đinh Kiều Diễm*, Nguyễn Nhật Quỳnh Như*, Võ Văn Thành Niệm*, Nguyễn Thị Hà Giang*,<br /> Bùi Thị Thanh Huyền**, Tô Thùy Nhi**, Vũ Trường Nhân**, Nguyễn Đình Văn**, Hồ Trần Bản*,<br /> Trương Đình Khải*, Carol J.Thiele***, Bùi Chí Bảo*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Phân loại nhóm nguy cơ cao UNBTK kết hợp đặc điểm lâm sàng và quy trình PCR định lượng<br /> xác định khuyếchđại MYCN.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Có 60 khối UNBTK sẽ được phân thành 2 nhóm: (1) nhóm mô được tách chiết<br /> DNA để phân tích với các dấu ấn di truyền như: MYCN bằng kĩ thuật PCR định lượng (qPCR) và kiểm tra với<br /> tế bào dòng có hoặc không khuếch đại MYCN. Kết quả được phân tích tương quan với giữa đặc tính sinh học với<br /> đặc trưng lâm sàng.<br /> Kết quả: Nghiên cứu đã thu nhận 60 hệ DNA từ mô sinh thiết và nuôi cấy thành công 5/60 khối tế bào sơ<br /> cấp thu từ sinh thiết UNBTK thuộc nhóm nguy cơ cao. Nhóm khuyếch đại MYCN chiếm 11/60 (khoảng 18,3%)<br /> và có tương quan với dòng tế bào khuyếch đại MYCN. Nghiên cứu này góp phần định hướng liệu trị can thiệp cá<br /> thể dựa vào phân loại nhóm nguy cơ để tác động hiệu quả hơn trong liệu trị ung thư.<br /> Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình định lượng khuếch đại MYCN bằng phương pháp<br /> qPCR. Từ đó có thể góp phần hỗ trợ cho việc tiên lượng điều trị nguy cơ UNBTK. Đề tài được hỗ trợ bởi quỹ phát<br /> triển khoa học và công nghệ quốc gia Nafosted, mã số 106-YS.06-2014.48.<br /> Từ khóa: U nguyên bào thần kinh, phân nhóm nguy cơ, MYCN, FISH, qPCR.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> MYCN STRATIFICATION OF RISK IN NEUROBLASTOMA BY BY Q-PCR<br /> Truong Dinh Kieu Diem, Nguyen Nhat Quynh Nhu, Vo Van Thanh Niem, Nguyen Thi Ha Giang,<br /> Bui Thi Thanh Huyen, To Thuy Nhi, Vu Truong Nhan, Nguyen Dinh Van, Ho Tran Ban,<br /> Truong Dinh Khai, Carol J.Thiele, Bui Chi Bao<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 19 - No 5 - 2015: 1 - 7<br /> Objective: Since MYCN amplification is closely associated to high-stage neuroblastomas and an inverse<br /> correlation with clinical neuroblastoma stages, the aims are to study amplified MYCN classified the risk groups<br /> by quantitative PCR.<br /> Methods: A total of 60 NBs will be assigned into 2 groups: (1) tissue genomic DNA was extracted for<br /> MYCN amplification by quantitative PCR (qPCR) and confirmed with control cell lines (with or without MYCN<br /> amplification).<br /> Results: The study has collected DNA from 60 tissue biopsy system and successfully cultured primary cells<br /> 5/60 blocks from biopsies obtained NB high risk group. MYCN amplification Group occupies 11/60<br /> (approximately 18.3%) and correlated with MYCN amplified cell lines.<br /> <br /> * Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh.<br /> ** Bệnh viện Nhi Đồng 2.<br /> ***Pediatric Oncology Branch, Center for Cancer Research.<br /> Tác giả liên lạc: TS.BS Bùi Chí Bảo,<br /> ĐT: 0909708225,<br /> Email: bcbao@ump.edu.vn.<br /> <br /> Chuyên Đề Ngoại Nhi<br /> <br /> 1<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> Conclusion: This study contributes highly to the molecular control of MYCN based marker to stratify the<br /> NB risks and further help clinicians to work more effectively in cancer treatment.<br /> Key words: Neuroblastoma, risk stratification, MYCN, FISH, qPCR.<br /> lượng bệnh u nguyên bào thần kinh như: mất<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> đoạn ở cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 (1p) (gặp<br /> U nguyên bào thần kinh (UNBTK) là khối u<br /> khoảng 35% trường hợp u nguyên bào thần<br /> đặc nằm ngoài hộp sọ phổ biến và là nguyên<br /> kinh) và mất đoạn ở cánh dài NST số 11 (11q)<br /> nhân gây ra 15% ca trong tổng số ca tử vong có<br /> (gặp 43% trường hợp u nguyên bào thần kinh),<br /> liên quan đến ung thư ở trẻ em (5). Mặc dù đã có<br /> thêm đoạn cánh dài NST số 17 (17q) (gặp khoảng<br /> nhiều kết hợp phương pháp điều trị đa mô<br /> 50% trường hợp)(2). Những biến đổi di truyền<br /> phương thức hiện đại, bao gồm hóa trị, giải<br /> này đều có tiên lượng xấu, hoặc tiên lượng tái<br /> phẫu, xạ trị, cấy tế bào gốc, tác động biệt hóa<br /> phát đối với việc điều trị trong u nguyên bào<br /> bằng Retinoic acid và kể cả liệu pháp miễn dịch,<br /> thần kinh.<br /> đa số bệnh nhân UNBTK ở giai đoạn trễ (giai<br /> Như vậy có nhu cầu cho chỉ thị sinh học giúp<br /> đoạn IV) và có tỉ lệ sống sót 5 năm của bệnh<br /> trong việc chẩn đoán và theo dõi điều trị của<br /> nhân thấp hơn 40% (5,6). Nhu cầu các chỉ thị sinh<br /> bệnh nhân UNBTK là cần thiết. Ngoài ra, việc<br /> học mới có thể cải thiện phương pháp phân tầng<br /> sàng lọc tế bào gốc ung thư mục tiêu cho thuốc<br /> nguy cơ của bệnh lý này và phát triển những<br /> có thể ngăn chặn tình trạng tái phát đang diễn ra<br /> chiến thuật trị liệu có hiệu quả hơn nhằm cải<br /> và góp phần hỗ trợ cho chiến lược điều trị đa mô<br /> thiện kết quả điều trị là cần thiết, tuy nhiên vẫn<br /> thức trên ung thư.<br /> chưa được xây dựng và phát triển. Một vài chỉ<br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> thị di truyền phân tử nhằm tiên lượng kết quả<br /> điều trị tốt như Calreticulin và các gene mục tiêu<br /> Nghiên cứu phân loại nhóm nguy cơ cao<br /> TrkA, GRP75, và B4GALNT3 hoặc tiên lượng<br /> UNBTK kết hợp đặc điểm lâm sàng và quy trình<br /> xấu như MYCN, ALK, ATRX và các bất thường<br /> PCR định lượng xác định khuyếch đại MYCN.<br /> cấu trúc ở NST -1p, -11q, +17q, đã được nghiên<br /> <br /> cứu(8,10).<br /> MYCN - là gen tiền ung thư nằm trên<br /> cánh ngắn NST số 2 (2p24)(10,4). Sự khuyếch<br /> đại MYCN thường gặp ở giai đoạn muộn<br /> (III, IV) của u nguyên bào thần kinh tiên phát<br /> trên các bệnh nhân chưa được điều trị, hoặc<br /> đôi khi được phát hiện ở các u nguyên bào<br /> thần kinh có độ ác tính cao, với tỷ lệ gặp<br /> khoảng 20-25%(3). Đối với u nguyên bào thần<br /> kinh có khuyếch đại gen MYCN thì dù ở lứa<br /> tuổi hay giai đoạn bệnh nào, đều có tiên<br /> lượng xấu, tỷ lệ sống trên năm năm của bệnh<br /> nhân chỉ khoảng 30%(4,1).<br /> Ngoài ra, có một số biến đổi về cấu trúc<br /> nhiễm sắc thể khác, tồn tại độc lập hoặc có mối<br /> liên quan chặt chẽ với sự khuyếch đại gen<br /> MYCN cũng có ý nghĩa quan trọng trong tiên<br /> <br /> 2<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> <br /> Mẫu mô UNBTK được thu nhận từ bệnh<br /> viện Nhi Đồng 2.<br /> <br /> Thu nhận mẫu<br /> Mẫu mô được thu nhận tại bệnh viện Nhi<br /> đồng 2. Mẫu mô sau quá trình phẫu thuật sẽ<br /> được giữ trong môi trường DMEM, 10% huyết<br /> thanh bào thai bê (Fetal bovine serum - FBS), 1%<br /> penicillin và streptomycin và được chuyển đến<br /> phòng thí nghiệm Trung tâm Y Sinh học phân tử<br /> trong 24 giờ.<br /> <br /> Phân lập và nuôi cấy tế bào<br /> SH-SY5Y dòng tế bào neuroblastoma không<br /> khuyếch đại MYCN và IMR-32 khuyếch đại<br /> MYCN được nuôi và duy trì như mô tả trước<br /> (NCI, Carol Thiele Lab). Cấy chuyền thực hiện<br /> <br /> Chuyên Đề Ngoại Nhi<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> thao tác tách tế bào bằng cách sử dụng 0,25%<br /> trypsin / EDTA 1%.<br /> Trong nghiên cứu này tế bào ung thư sơ cấp<br /> thu nhận từ sinh thiết từ khối mô được nuôi<br /> trong môi trường DMEM bổ sung 10% huyết<br /> thanh thai bò (FBS), 1% penicillin và<br /> streptomycin, ở 370C, 5% CO2.<br /> <br /> Thu nhận mẫu<br /> Mẫu mô được thu nhận tại bệnh viện Nhi<br /> đồng II. Mẫu mô sau quá trình phẫu thuật sẽ<br /> được giữ trong môi trường DMEM, 10% huyết<br /> thanh bào thai bê (Fetal bovine serum - FBS), 1%<br /> penicillin và streptomycin và được chuyển đến<br /> phòng thí nghiệm Trung tâm Y Sinh học phân tử<br /> trong 24 giờ.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> phản ứng (không có hiện tượng hai mồi bắt cặp<br /> với nhau (dimer primers) và các sản phẩm<br /> không đặc hiệu khác).<br /> <br /> Phân tích dữ liệu<br /> Phương pháp so sánh Ct để tính số bản sao<br /> DNA của MYCN (2p24) trên UNBTK. Chu kỳ<br /> ngưỡng được sử dụng để xác định giá trị Ct cho<br /> từng mẫu. Ct được định nghĩa là phân đoạn chu<br /> kỳ PCR mà tại đó các tín hiệu huỳnh quang đạt<br /> giá trị ngưỡng.<br /> Công thức ΔCt để chuyển đổi giá trị Ct<br /> thành số bản sao với các hiệu chuẩn (mẫu đối<br /> chứng DNA bình thường) số bản sao được thiết<br /> lập như sau:<br /> Q = E∆Ct(1)<br /> <br /> Tách chiết DNA<br /> <br /> Q = E(Ct của gen kiểm soát nội bộ - Ct của gen MYCN) (2)<br /> <br /> DNA được tách chiết từ khối u bằng Wizard<br /> Genomic DNA Purification Kit (Promega).<br /> <br /> Trong đó:<br /> <br /> Khối u được cắt thành những miếng nhỏ và<br /> đồng nhất trong dung dịch PBS. Dịch mô được ủ<br /> với Nuclei Lysis Solution ở 65ºC trong 1 giờ và<br /> làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Bổ sung Protein<br /> Precipitation Solution vào hỗn hợp ly giải, ủ trên<br /> đá trong 5 phút và ly tâm hỗn hợp ở tốc độ cao<br /> trong 15 phút ở 4ºC. Thu dịch nổi chứa DNA.<br /> Thêm isopropanol với tỷ lệ 1: 1 và trộn đều dung<br /> dịch cho đến khi xuất hiện sợi trắng của DNA.<br /> Ly tâm ở tốc độ cao trong 10 phút ở 4ºC. Loại bỏ<br /> dịch nổi, rửa mẫu bằng Ethanol 70% và để khô<br /> tự nhiên. Hòa tan DNA bằng dung dịch DNA<br /> Rehydration ở 65ºC trong 1 giờ bằng máy ủ lắc.<br /> DNA được lưu trữ ở 20ºC để sử dụng sau.<br /> <br /> Phương pháp PCR định lượng (qPCR)<br /> Mẫu DNA sau khi tách chiết tiến hành chạy<br /> Realtime-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen NMyc và gen POLR2D (gen kiểm soát nội bộ)<br /> bằng SYBR Green I Takara Kit, theo chu trình<br /> nhiệt 950C trong 3 phút, 950C 15 giây, 600C 1<br /> phút, trong 40 chu kỳ. Đối với mỗi phản ứng<br /> qPCR cần thiết lập một phân tích đường cong<br /> nóng chảy → phân tích điểm chảy (melting<br /> curve) để đảm bảo tính đặc hiệu trong mỗi ống<br /> <br /> Chuyên Đề Ngoại Nhi<br /> <br /> - Q là giá trị biểu diễn sự khác biệt của gen<br /> bệnh so với gen chứng nội<br /> - E là hiệu suất của phản ứng QPCR (khi<br /> hiệu suất đạt 100% thì E = 2)<br /> (De Preter, Speleman et al. 2002, Ryan S<br /> McCulloch et al. 2012).<br /> Sử dụng công thức định lượng để tính ∆ Ct,<br /> ∆ Ct ≥ 4 thì kết luận MYCN khuếch đại, ngược<br /> lại ∆ Ct < 4 thì kết luận MYCN không khuếch<br /> đại.<br /> <br /> Lai huỳnh quang tại chỗ trên NST với tế bào<br /> thu từ khối u NB<br /> Mẫu mô bảo quản trong môi trường DMEM<br /> vận chuyển về phòng thí nghiệm. Cắt nhỏ mô ủ<br /> trong trypsin 1X trong 30 phút. Lọc và ly tâm thu<br /> tế bào, cố định trong dung dịch Carnoy (3<br /> methanol: 1 acid acetic) sau đó nhỏ dung dịch tế<br /> bào lên lam kính và đánh dấu vùng tế bào, để<br /> khô ít nhất 1 giờ. Để probe ở nhiệt độ phòng đến<br /> khị tự rã đông hoàn toàn. Nhỏ probe lên vùng tế<br /> bào đã được đánh dấu sau đó đậy bằng miếng<br /> kính mỏng và dán keo. Đặt vào tủ lai với chương<br /> trình như sau: 750C trong 5 phút, 370C trong 18<br /> giờ. Sau khi lai, rửa lam kính trong dung dịch<br /> rửa 2X SSC trong 2 phút ở 720C, để khô tự nhiên,<br /> <br /> 3<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> nhuộm nhân với DAPI. Quan sát hình ảnh của<br /> probe, Các tế bào bình thường có 2 tính hiệu đỏ<br /> (gen MYCN) và 2 tính hiệu xanh cho gen chứng<br /> nội (LAF). Các tế bào khuếch đại N-myc có<br /> nhiều hơn hai tín hiệu đỏ. Slides có thể được lưu<br /> trữ -200C.<br /> <br /> xuất hiện (Hình 2). Lai FISH cho thấy một số tế<br /> bào ung thư tách chiết từ khối mô có xuất hiện<br /> khuếch đại MYCN (Hình 3).<br /> <br /> Phân tích thống kê<br /> So sánh giữa các nhóm được thực hiện bằng<br /> cách sử dụng phần mềm GraphPad Prism (La<br /> Jolla, CA, USA) và các gói số liệu thống kê R (R,<br /> phiên bản 2.15.1; http://www.r-project.org/). Giá<br /> trị P được xác định bởi việc sử dụng t-test (twotailed unpaired t-test) trong đó lô được tạo ra<br /> trong R.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> Hình 2: Giải phẫu bệnh khối u nhúng paraffin phân<br /> tích với Haemotoxylin và Eosin. Sự xâm lấm bất<br /> thường của tế bào vào vùng giáp ranh () và vào<br /> trong stroma (*) của u ác tính có xâm lấn.<br /> <br /> Phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư sơ cấp<br /> Mẫu khối UNBTK được tách tế bào đơn<br /> bằng biện pháp cơ học và nuôi cấy trong môi<br /> trường DMEM bổ sung 10% FBS. Sự tăng sinh<br /> của tế bào được ghi nhận trong 12 ngày (Hình 1).<br /> <br /> B<br /> A<br /> <br /> Hình 3: Kết quả FISH trên mẫu u nguyên bào thần<br /> kinh. A Không khuếch đại MYCN,<br /> B: Khuếch đại MYCN.<br /> <br /> Hình 1: Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào đơn thu nhận<br /> từ mẫu khối UNBTK (x20)<br /> Kết quả nhuộm Hematoxiline – Eosin cho<br /> mô nhúng paraffin và FISH.<br /> Đầu tiên chúng tôi thu thập và kiểm tra hình<br /> thái giải phẫu bệnh (Hình 2) và lai huỳnh quang<br /> tại chỗ (Hình 3) các mô UNBTK. Trong đó các<br /> phiến, nhóm tế bào ung thư đặc trung của<br /> UNBTK được nhìn thấy rõ ở nhuộm HE. Bên<br /> cạnh đó các tế bào stroma và các hệ mạch cùng<br /> <br /> 4<br /> <br /> Kết quả kiểm tra độ nhạy mẫu DNA bệnh<br /> nhân<br /> Tiến hành kiểm tra độ nhạy của mẫu DNA<br /> bệnh nhân với tỉ lệ phần trăm DNA của khối u<br /> khác nhau tương ứng là 20%, 40% và 60%. Nghĩa<br /> là lấy 20% mẫu DNA từ khối u được chẩn đoán<br /> là UNBTK kết hợp với 80% mẫu DNA bình<br /> thường. Đối với tỉ lệ phần trăm DNA của khối u<br /> là 40% và 60% làm tương tự trên.Gen POLR2D<br /> được sử dụng gen chứng nội trong phản ứng<br /> qPCR. Sau khi thực hiện phản ứng qPCR, kết<br /> quả giá trị Ct có được như bảng số 1.<br /> <br /> Chuyên Đề Ngoại Nhi<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> Bảng 1: Kiểm tra độ nhạy mẫu DNA bệnh nhân.<br /> Lư ng DNA (%)<br /> DNA<br /> DNA c a m u Ct MYCN Ct POLR2D<br /> u nguyên bào<br /> bình<br /> th n kinh<br /> thư ng<br /> 80<br /> 20<br /> 20,83<br /> 21,43<br /> 60<br /> 40<br /> 21,01<br /> 21,70<br /> 40<br /> 60<br /> 21,29<br /> 22,66<br /> <br /> ∆Ct<br /> <br /> 0,6<br /> 0,69<br /> 1,37<br /> <br /> Nhận xét: Từ kết quả qPCR cho thấy: với tỉ lệ<br /> 20% mẫu DNA được chẩn đoán là UNBTK vẫn<br /> đủ lớn để phát ra tín hiệu huỳnh quang và có giá<br /> trị ΔCt = 0,6, với tỉ lệ 40% mẫu DNA được chẩn<br /> đoán là UNBTK thì giá trị ΔCt cao hơn so với<br /> 20% (ΔCt = 0,69). Tương tự, với tỉ lệ 60% mẫu<br /> DNA được chẩn đoán là UNBTK thì giá trị ΔCt<br /> cao hơn so với 40% (ΔCt = 0,77).<br /> Kết luận: Với tỉ lệ % của mẫu DNA được<br /> chẩn đoán là UNBTK càng cao thì sẽ cho kết quả<br /> qPCR càng chuẩn xác, càng nhạy và hiệu quả<br /> phản ứng càng cao. Tỉ lệ % tối ưu nhất được<br /> chọn là 20%. Điều này chứng tỏ rằng qPCR có độ<br /> nhạy rất cao, chỉ cần một lượng nhỏ DNA vẫn có<br /> thể phát hiện được.<br /> <br /> Kết quả tối ưu hóa nồng độ DNA<br /> Bảng 2: Tối ưu hóa nồng độ DNA ban đầu.<br /> Lư ng DNA Ct MYCN Ct POLR2D<br /> 0,1 ng<br /> <br /> 32,07<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1 ng<br /> <br /> 29,10<br /> <br /> 0<br /> <br /> 10 ng<br /> 25 ng<br /> <br /> 25,68<br /> 24,81<br /> <br /> 33,16<br /> 32,21<br /> <br /> ∆Ct<br /> Giá tr không ý<br /> nghĩa<br /> Giá tr không ý<br /> nghĩa<br /> 7,48<br /> 7,4<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Nhận xét: Tiến hành kiểm tra lượng DNA<br /> ban đầu để xác định nồng độ tối thiểu của DNA<br /> cần cho một phản ứng QPCR bằng cách thử<br /> nghiệm với lượng DNA ban đầu khác nhau là<br /> 0,1 ng, 1 ng, 10 ng, và 25 ng. Biết được nồng độ<br /> tối thiểu từ đó có thể sử dụng lượng DNA thích<br /> hợp cho các phản ứng QPCR sau đó và cho hiệu<br /> quả phản ứng cao, đồng thời tiết kiệm được thời<br /> gian và vật liệu phản ứng.<br /> Kết quả cho thấy, với nồng độ DNA là 0,1 ng<br /> và 1 ng thì lượng DNA không đủ lớn để phát ra<br /> tín hiệu huỳnh quang. Bắt đầu từ nồng độ 10 ng<br /> thì lượng DNA ban đầu đã đủ lớn để phát ra tín<br /> hiệu huỳnh quang. Điều đó cho thấy, nồng độ<br /> DNA tối ưu là 10 ng.<br /> Kết luận: Lượng DNA ban đầu càng nhiều<br /> thì tín hiệu huỳnh quang xuất hiện càng sớm<br /> (xem hình 2) và phản ứng đạt hiệu quả cao.<br /> <br /> Kết quả MYCN (2p24) khuếch đại của các<br /> mẫu u nguyên bào thần kinh<br /> Tiến hành trên 10 mẫu mô (n = 10) được<br /> chuẩn đoán là UNBTK và được phân tích bằng<br /> qPCR. Chi tiết về kết quả được trình bày trong<br /> bảng 4. Các mẫu được xem là có MYCN khuếch<br /> đại khi số lượng bản sao MYCN lớn hơn hoặc<br /> bằng 10.<br /> <br /> Bảng 3: Danh sách của các bệnh nhân, chẩn đoán lâm sàng và kết quả về số bản sao gen MYCN của các mẫu trên<br /> UNBTK.Ghi chú: X là khuếch đại, O là không khuếch đại.<br /> Trư ng<br /> h p<br /> <br /> Tu i<br /> <br /> Giai đo n<br /> <br /> N ng đ<br /> DNA (ng/ l)<br /> <br /> Ct<br /> MYCN<br /> <br /> Ct<br /> POLR2D<br /> <br /> ∆Ct<br /> <br /> S b n sao<br /> (2x2∆Ct)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 20 tháng<br /> <br /> 1<br /> <br /> 535<br /> <br /> 23,41<br /> <br /> 23,77<br /> <br /> 0,36<br /> <br /> 2<br /> <br /> O<br /> <br /> 2<br /> <br /> 5 tu i<br /> <br /> 4<br /> <br /> 6<br /> <br /> 22,69<br /> <br /> 23,16<br /> <br /> 0,47<br /> <br /> 2<br /> <br /> O<br /> <br /> 3<br /> <br /> 9 tu i<br /> <br /> Không xác đ nh<br /> <br /> 419<br /> <br /> 24,97<br /> <br /> 25,75<br /> <br /> 0,78<br /> <br /> 3<br /> <br /> O<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3 tu i<br /> <br /> Không xác đ nh<br /> <br /> 989<br /> <br /> 23,33<br /> <br /> 23,72<br /> <br /> 0,39<br /> <br /> 2<br /> <br /> O<br /> <br /> 5<br /> <br /> 4 tháng tu i<br /> <br /> 1<br /> <br /> 779<br /> <br /> 22,84<br /> <br /> 24,33<br /> <br /> 1,49<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1 tu i<br /> <br /> Không xác đ nh<br /> <br /> 130<br /> <br /> 26,14<br /> <br /> 29,05<br /> <br /> 2,91<br /> <br /> 15<br /> <br /> X<br /> <br /> 7<br /> <br /> Không xác đ nh<br /> <br /> 4<br /> <br /> 20<br /> <br /> 15,25<br /> <br /> 22,68<br /> <br /> 7,43<br /> <br /> 344<br /> <br /> X<br /> <br /> 8<br /> <br /> 2 tu i<br /> <br /> Không xác đ nh<br /> <br /> 1539<br /> <br /> 28,25<br /> <br /> 33,84<br /> <br /> 5,59<br /> <br /> 96<br /> <br /> X<br /> <br /> 9<br /> <br /> 3 tu i<br /> <br /> 4<br /> <br /> -19<br /> <br /> 26,49<br /> <br /> 28,04<br /> <br /> 1,55<br /> <br /> 5<br /> <br /> 10<br /> <br /> 11 tháng tu i<br /> <br /> Không xác đ nh<br /> <br /> 46<br /> <br /> 23,82<br /> <br /> 30,48<br /> <br /> 6,66<br /> <br /> 202<br /> <br /> Chuyên Đề Ngoại Nhi<br /> <br /> Khu ch đ i Không khu ch<br /> (+)<br /> đ i (-)<br /> <br /> O<br /> <br /> O<br /> X<br /> <br /> 5<br /> <br />