zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Khoa Học Tự Nhiên

Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 4 - ThS. Nguyễn Thành Luân

Chia sẻ: Cvcxbv Cvcxbv | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:53

Báo xấu

200
lượt xem 23
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào Bài 4 Các qui trình kiểm tra vi sinh vật truyền thống và phi truyền thống nêu sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp. Trực tiếp như đếm trên kính hiển vi.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 4 - ThS. Nguyễn Thành Luân

4/01/2013 BÀI 4 CÁC QUI TRÌNH KIỂM TRA VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHI TRUYỀN THỐNG Lớp phân tích vi sinh GV: ThS. Nguyễn Thành Luân luannt@cntp.edu.vn Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật (Nhắc lại) Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp  Trực tiếp như đếm trên kính hiển vi  Gián tiếp thông qua:  Phương pháp đo độ đục  Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định  Định lượng một cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN). 1
4/01/2013 Phƣơng pháp đếm trực tiếp • Ƣu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu. • Nhƣợc điểm: - Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết - Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu - Khó đạt được độ chính xác cao - Không thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp. Phƣơng pháp đếm trực tiếp THIẾT BỊ GÌ?? • Buồng đếm hồng cầu • Buồng đếm Breed • Kính hiển vi huỳnh quang 2
4/01/2013 Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc • Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp cho độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp • Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc • Phương pháp này dễ sai số nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất ba đĩa. • Ƣu điểm: Độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu 3
4/01/2013 Phƣơng pháp MPN (Most Probable Number)  Là phương pháp định lượng vi sinh vật theo xác suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích mẫu  Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại Thông thường là lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp.  Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của phương pháp này càng lớn. Phƣơng pháp đo độ đục • Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh vật. • Định lượng mật độ tế bào thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610 nm. • Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng 4
4/01/2013 CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA • Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSV • Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa. • Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV: • Cách truyền thống • Sử dụng các bộ KIT • Sử dụng các thiết bị tự động 5
4/01/2013 Thử nghiệm khả năng lên men • Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn CH của các VSV • Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid  giảm pH môi trường • Các loại carbohydrate • Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose … • Dicarbonhydrate: sucrose, lactose … • Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose • Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO • Các loại đường rượu: chứa chức -OH 6
4/01/2013 Phenol Red Carbohydrate Broth Trypticase 10g NaCl 5g Cao thịt 1g Phenol red (7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%) 0,018g Carbohydrate* 1g Hấp ở 115oC trong 15 phút Thử nghiệm khả năng lên men • Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm • VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH  thay đổi màu chất chỉ thị phenolred • Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng • Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ 7
4/01/2013 Thử nghiệm Citrate • Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất. • Cở sở sinh hóa: • VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm hóa MT • VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT Thử nghiệm Citrate Môi trường Simmon citrate agar Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g NaCl 5g Sodium citrate 2g MgSO4 0,2g Bromothymol blue 0,08g Agar 13g 8
4/01/2013 Thử nghiệm Citrate • Chú ý - Cấy lượng sinh khối vừa đủ - Có đối chứng trắng (BLANK) đi kèm Đối chứng trắng Pứ âm tính Pứ dương tính Thử nghiệm Urease • Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease • Cơ sở sinh hoá: (NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2  tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ) • Môi trường sử dụng: • Urea Broth (Rustigian – Stuart) • Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng) 9
4/01/2013 Môi trƣờng Urea Broth Urea 20g Cao nấm mem 0,1g Na2HPO4 9,5g K2HPO4 9,1g Phenol red 0,01g Nước cất 1 lít Thử nghiệm Urease • Thực hiện • Chuẩn bị môi trường • Cấy VSV vào 5ml môi trường • ủ 37oC/24 giờ • Quan sát 10
4/01/2013 Thử nghiệm khả năng sinh H2S • Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S • Cơ sở sinh hóa: desulfohydrase Acid amin chứa S H2S thiosulfate reductase Thiosulfate H2S  H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS) Thử nghiệm khả năng sinh H2S • Để phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giống Proteus • Môi trường sử dụng: • KIA, TSI (thạch nghiêng) • SIM, PIA (thạch sâu) • BSA (thạch đĩa) Cấy vsv lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48h) 11
4/01/2013 Thử nghiệm khả năng sinh H2S • Đọc kết quả: (+) Xuất hiện màu đen trong môi trường (-) Không xuất hiện màu đen trong môi trường ĐC (+) Thử nghiệm khả năng sinh H2S Pancreatic digest of 20.0 g casein (casitone) Peptic digest of animal 6.1 g tissue (beef extract) Ferrous ammonium 0.2 g sulfate Sodium thiosulfate 0.2 g Agar 3.5 g (+) (-) (+) 12
4/01/2013 Thử nghiệm khả năng sinh Indol • Mục đích Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym tryptophanase 37oC / 24h Thuốc thử Kovac’s Chủng VSV MT canh trypton Pứ dương tính Pứ âm tính Thử nghiệm khả năng sinh Indol • Là phản ứng giúp phân biệt • E. coli (+) với Klebsiella (-) • Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+) • Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-) … • Đối chứng (+) Proteus rettgeri (-) Serratia marcescens 13
4/01/2013 Thử nghiệm KIA/TSI • KIA: Kligler iron agar (trang 99) Pepton 20g Lactose 20g Glucose 1g NaCl 5g Feric ammonium citrate 0,5g Sodium thiosulphate 0,5g Agar 15g Phenol red 0,025g Nước cất 1 lít pH 7,4±0,2 Thử nghiệm KIA/TSI • TSI: Triple sugar iron agar (trang 106) Pepton 20g Lactose 10g Sucrose 10g Glucose 1g NaCl 5g Feric ammonium sulphate o,2g Sodium thiosulphate 0,2g Agar 13g Phenol red 0,025g Nước cất 1 lít pH 7,4±0,2 14
4/01/2013 Thử nghiệm KIA/TSI • Mục đích: phát hiện khả năng • sử dụng các nguồn cacbonhydrate • sinh H2S • tạo hơi (gas) Ủ 37oC/24 giờ Quan sát: Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S Thử nghiệm KIA/TSI ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 15
4/01/2013 Thử nghiệm MR (Methyl red) • Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên men glucose. • Cơ sở sinh hóa: • Chất chỉ thị pH: methyl red dưới 4,4 5,0 – 5,8 trên 6,0 • MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid • MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính  Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC Thử nghiệm MR (Methyl red)  Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth) ủ 2 – 5 ngày 37oC Chủng VSV MR-VP broth Pứ âm tính Pứ dương tính ĐC 16
4/01/2013 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men glucose • Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn. 2 pyruvate acetoin + 2 CO2 17
4/01/2013 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Môi trường sử dụng: MR-VP • Phương pháp tiến hành: • Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP • Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC • Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ • Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ. Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng (+) : Enterobacter cloacea (-) : E. coli • Đọc kết quả: (+): màu đỏ trên môi trường (-): mặt môi trường không đổi màu (-) (+) 18
4/01/2013 Thử nghiệm Bile Esculin • Mục đích: xác định khả năng thủy giải glucoside esculin thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật. • Cơ sở sinh hoá: • Esculin là hợp chất nhân tạo • Esculetine được phóng thích phản ứng với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đen Môi trường Bile Esculine Agar Beef extract 3g Pepton 5g Esculin 1g Mật bò (Oxgall) 40g Ferric citrate 0,5g Agar 15g Nước cất 1 lít 19
4/01/2013 Esculetine Phân tử Esculine Glucose Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine Thử nghiệm Bile Esculin 20

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.