Những nội dung chính được trình bày trong bài giảng "Công cụ và kỹ thuật khám phá Protein" gồm có: Giới thiệu về Proteomics, các phương pháp trong Proteomics, điện di 2 chiều,... Mời các bạn cùng tham khảo để nắm bắt kiến thức chi tiết, phục vụ nhu cầu học tập và nghiên cứu.
AMBIENT/
Chủ đề:
Nội dung Text: Bài giảng Công cụ và kỹ thuật khám phá Protein
- Coâng cuï vaø kyõ thuaät khaùm phaù
theá giôùi Protein
Thaønh Phoá Hoà Chí Minh 5/2004
- Giôùi thieäu veà Proteomics
Thuaät ngöõ Proteome: caùc phaàn protein chuyeân bieät
veà thôøi gian vaø veà maët teá baøo ñöôïc bieåu hieän töø
Genome.
Boä gen: khaù oån ñònh, ñoàng nhaát trong teá baøo cuûa
moät sinh vaät vaø khoâng coù nhieàu thay ñoåi trong loaøi.
Protein laïi bieán ñoäng theo thôøi gian vaø deã daøng
phaûn öùng vôùi caùc yeáu toá beân ngoaøi, vaø ñaëc bieät laø
khaùc nhau raát nhieàu veà caên baûn giöõa caùc loaïi teá baøo
khaùc nhau.
- Giôùi thieäu veà Proteomics
Proteomics laø quaù trình nghieân cöùu toaøn boä protein hay caùc phaàn
protein boå sung hình thaønh töø moät moâ hay moät doøng teá baøo.
Ngaøy nay, proteomics coù theå ñöôïc chia thaønh proteomics kinh ñieån
(Classical) vaø Proteomics chöùc naêng.
Classical proteomics taäp trung nghieân cöùu vaøo toaøn boä heä protein töø
hai doøng teá baøo ñöôïc xöû lyù khaùc nhau, trong khi ñoù Proteomics chöùc
naêng nghieân cöùu vaøo moät nhoùm protein giôùi haïn hôn.
Coù ba vaán ñeà chính ñöôïc ñaët ra cho Proteomics:
1) Caùc loaïi protein naøo hieän dieän?
2) Moät protein ñaëc tröng coù töông taùc gì vôùi caùc protein khaùc?
3) Protein ñaëc tröng ñoù nhö theá naøo (veà maët caáu truùc)?
- Giôùi thieäu veà Proteomics
Thuaät ngöõ Proteomics bao haøm moät söï nghieân cöùu roäng nhaèm muïc ñích tìm
hieåu vaø giaùm saùt hoaït ñoäng chöùc naêng cuûa caùc protein.
Proteomics bao goàm caùc coâng vieäc töông töï tìm trình töï di truyeàn baèng caáu
truùc khoâng gian ba chieàu cuûa protein vaø trong chöùc naêng protein, phaùt trieâûn
caùc kyõ thuaät taùch chieát protein vaø laäp hoà sô protein, nghieân cöùu caùc töông
taùc giöõa protein vôùi protein.
Proteomics höùa heïn khaùm phaù ra nhöõng muïc tieâu môùi cho nghieân cöùu döôïc
phaåm thoâng qua vieäc nghieân cöùu chöùc naêng cuûa haøng ngaøn protein chöa xaùc
ñònh maø ngöôøi ta mong muoán seõ ñöôïc phaùt hieän trong nghieân cöùu boä gen
ngöôøi.
Proteomics cung caáp döõ lieäu nghieân cöùu ñeå caûi thieän caùc chöông ttrình phaàn
meàm maùy tính nhaèm döï ñoaùn caáu truùc protein töø caùc trình töï DNA; Noù cho
pheùp chuùng ta coù theå giaûi thích thoâng tin coù chöùa trong toaøn boä gen.
- Proteomes
Nghieân cöùu caùc protein ñöôïc bieåu hieän
töø Gene
Phaân tích Protein moät caùch heä thoáng vaø ñoàng boä
- Boä gen seõ cung caáp nhöõng ñieàu
kyø dieäu???
DNA
Teá baøo mRNA proteins
(genes)
- Boä gen seõ cung caáp nhöõng ñieàu
kyø dieäu???
Nhöng, chæ coù 30,000 gene trong boä gene ngöôøi, maø coù tôùi hôn
100,000 protein trong heä Proteome ngöôøi.
Genomics ñaõ cung caáp moät löôïng raát lôùn döõ lieäu, nhöng haàu
heát chuùng ta vaãn chöa giaûi thích ñöôïc cho ñeán nay.
Trong moät soá tröôøng hôïp, Genomics cho chuùng ta nhieàu caâu
hoûi hôn laø caâu traû lôøi.
Caùc vaán ñeà naûy sinh cuûa proteomics höùa heïn traû lôøi cho moät
soá caâu hoûi ñoù baèng vieäc nghieân cöùu coù heä thoáng taát caû caùc
protein ñöôïc maõ hoùa bôûi boä gene.
- CAÙC PHÖÔNG PHAÙP TRONG
PROTEOMICS
Ñieän di hai chieàu - Two-dimensional electrophoresis (2-DE) laø coâng
cuï thí nghieäm truyeàn thoáng ñaùng tin caäy nhaát trong phaân taùch haøng
ngaøn protein treân cuøng moät baûn gel.
Xaùc ñònh Protein baèng khoái phoå (mass spectrometry) laø coâng cuï toát
nhaát hieän nay trong phaân tích protein vaø laø moät trong nhöõng kyõ
thuaät chuû yeáu trong caùc laõnh vöïc nghieân cöùu protein.
Protein microarrays cung caáp moät quaù trình phaân tích ñònh löôïng
moät löôïng lôùn caùc töông taùc giöõa caùc phaân töû. Nhieàu thí nghieäm söû
duïng Microarray thöôøng thöïc hieän chung vôùi khoái phoå.
Caùc phöông phaùp khaùc:
X-ray crystallography, NMR, Edman degradation, etc.
- ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU
(2D-electrophoresis)
• Keát hôïp giöõa isoelectic focusing (IEF) vaø
SDS-PAGE – cho keát quaû coù ñoä phaân giaûi
cao hôn raát nhieàu so vôùi töøng phöông phaùp
rieâng bieät .
• IEF- phaân taùch protein döïa treân ñieän tích
hay ñeåm ñaúng ñieän (isoelectric points);
• SDS-PAGE – Phaân taùch protein theo kích
thöôùc (size).
- 2-D PAGE for Protein Separations
IPG
Sample
SDS-PAGE
Prep
Cô quan / 2-D Array Stain / blot
Phaân ñoaïn/ Nhuoäm hay
moâ / 2-D array
Hoøa tan chuyeån leân
Teá baøo
maøng lai
- Öùng duïng ñieän di hai chieàu
trong nghieân cöùu Proteomics
1) Phaùc thaûo neân moät phöông phaùp ñeå khaùm
phaù proteomics.
2) Xaùc ñònh caùc phöông phaùp ñeå toái öu hoùa caùc
keát quaû ñieän di hai chieàu.
3) Ñöa ra caùc choïn löïa cho vieäc chuaån bò maãu
ñeå phaân tích caùc heä thoáng phöùc taïp.
4) Cho pheùp phaân tích caùc bieåu hieän phaân bieät
trong Proteomics.
- ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU
(2D-electrophoresis)
Böôùc ñaàu tieân trong phaân tích 2-DE analysis laø quaù trình
chuaån bò maãu; proteins coù trong teá baøo hay moâ caàn nghieân
cöùu phaûi ñöôïc hoøa tan vaø taát caû DNA vaø caùc chaát taïp
nhieãm phaûi ñöôïc loaïi ra khoûi dung dòch.
Caùc phöông phaùp chuaån bò maãu tuøy thuoäc vaøo muïc ñích cuûa
nghieân cöùu vaø ñaây chính laø chìa khoaù ñeå caùc thí nghieäm
ñöôïc thöïc hieän thaønh coâng.
Caùc yeáu toá nhö ñoä hoøa tan, kích thöôùc, ñieän tích vaø ñieåm
ñaúng ñieän (pI) cuûa protein phaûi ñöôïc tính ñeán trong quaù
trình chuaån bò maãu.
- ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU
(2D-electrophoresis)
Ñieän di chieàu thöù hai: quaù trình ñieän di SDS-PAGE thoâng
thöôøng, caùc strip IPG ñöôïc duøng nhö laø maãu ñieän di. Vieäc
choïn löïa gel söû duïng cho ñieän di chieàu thöù hai tuøy thuoäc
vaøo troïng löôïng phaân töû (MW) caàn taùch.
Ñeå coù theå phaân tích löôïng lôùn protein, coù theå chaïy nhieàu
gel cuøng luùc.
Caùc thang protein chuaån ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh troïng
löôïng phaân töû cuûa protein caàn phaân tích.
- ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU
Chuaån bò maãu – chìa khoùa thaønh coâng
Quaù trình chuaån bò maãu hieäu quaû seõ:
1. Hoøa tan taát caû protein coù trong maãu
2. Ngaên caûn söï tích tuï vaø giaûm tính tan trong khi ñieän di
3. Ngaên caûn vieäc giaûm hoaït tính veà maët hoùa hoïc hay
enzyme cuûa protein maãu.
4. Loaïi boû hoaëc tieâu huûy hoaøn toaøn caùc acid nucleic hay
caùc phaân töû gaây aûnh höôûng khaùc.
5. Hieäu suaát thu hoài caùc protein mong muoán ôû möùc phaùt
hieän ñöôïc.
- ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU
Chuaån bò maãu – chìa khoùa thaønh coâng
Haàu heát caùc protein ñeàu caàn thieát moät soá thí nghieäm ñeå xaùc
ñònh caùc ñieàu kieän toái öu cho ñieän di 2 chieàu. Söï khaùc nhau
veà noàng ñoä caùc chaát söû duïng coù theå aûnh höôûng ñeán keát quaû
phaân tích.
Urea vaø thiourea ñöôïc duøng ñeå giuùp hoaø tan protein, Urea
thöôøng ñöôïc söû duïng ôû noàng ñoä 8M.
Caùc chaát taåy khaùc cuõng ñöôïc söû duïng ñeå laøm taêng tính hoøa
tan cuûa protein ôû ñieåm ñaúng ñieän.
Caùc chaát mang löôõng tính Ampholytes laøm trung hoøa vaø
giuùp caùc protein khoâng keát tuûa trong quaù trình ñieän di.
- ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU
Chuaån bò maãu – chìa khoùa thaønh coâng
Caùc chaát khöû nhö DTT hay TBP ñöôïc söû duïng ñeå phaù vôõ
caàu noái disulfide.
Noàng ñoä DTT quaù cao seõ aûnh höôûng ñeán gradient pH vì
pKa cuûa DTT xaáp xæ 8.
Bio-Rad cung caáp moät giaûi phaùp toái öu cho quaù trình chuaån
bò maãu Protein:
ReadyPrep sequential extraction Kit
- ReadyPrep Sequential Extraction Kit
MAÃU 40–80%
Dung dòch 1
Supernatant
Tris, pH 9.5
Residue 1
12–49%
Dung dòch 2
Urea/CHAPS/Tris Supernatant
Bio-Lyte® / TBP
Residue 2
5–8%
Dung dòch 3
Urea/thiourea/CHAPS/SB3-10
Tris/Bio-Lyte® / TBP Supernatant
Residue 3 1%– 6%
- Extract 1
8%
Sequential Extraction
16%
4 7 Extract 2
Whole lysate
200 g of E. coli
proteins - each gel
Extract 3
- ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU
(2D-electrophoresis)
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
