Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 10 - Bùi Hồng Quân

Chia sẻ: Caphesuadathemmatong | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:22

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 10 Các phương pháp phân tích DNA, cung cấp cho người học những kiến thức như: Chiết tách DNA; Các phương pháp định tính và định lượng sơ bộ acid nucleic; Kỹ thuật cắt, nối, lai DNA và ứng dụng; Các phương pháp xác định trình tự DNA; Kỹ thuật PCR. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 10 - Bùi Hồng Quân

Chương 10 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA http://buihongquan.com
Các phương pháp phân tích DNA • Chiết tách DNA • Các phương pháp định tính và định lượng sơ bộ acid nucleic • Kỹ thuật cắt, nối, lai DNA và ứng dụng • Các phương pháp xác định trình tự DNA • Kỹ thuật PCR http://buihongquan.com
Chiết tách vật liệu di truyền • Nguyên tắc chung: 3 bước – Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa học – Chiết tách acid nucleic: Phenol-Chloroform – Kết tủa acid nucleic: cồn tuyệt đối • Các trường hợp cụ thể: – Plasmid: mục tiêu loại NST bằng sự khác nhau về cấu dạng - kích thước – ADN thực khuẩn: tủa phage bằng PEG, loại bỏ capsid – Tế bào Thực vật: phá tế bào bằng cách nghiền – Tế bào Động vật: phá tế bào bằng enzym - chất tẩy – ARN: bất hoạt RNase, tủa bằng LiCl 8M, loại ADN bằng DNase – Tủa lượng ADN nhỏ: độn bằng tARN – Tủa bằng isopropanol, tert-butanol,… • Các kỹ thuật khác – Loại carbohydrat, lipid bằng CTAB – Thu hồi ADN bằng sắc ký hấp phụ http://buihongquan.com
• Tinh chế acid Siêu ly tâm, ly tâm phân đoạn nucleic – Gradient liên tục / không liên tục của cesium chloride (CsCl) – Gradient saccharose • Sắc ký – Sắc ký ái lực: sử dụng pha tĩnh là U-Sepharose hay oligodT- cellulose để tinh chế mARN. – Sắc ký lọc gel để tách các nucleotid tự do sau khi tạo mẫu dò đánh dấu. – Sắc ký trao đổi ion trên vi cột, áp dụng để thu hồi những lượng ADN rất nhỏ. – Sắc ký lỏng hiệu năng cao: dùng để tinh chế các oligonucletid tổng hợp (độ phân giải là 1 nucleotid), plasmid, phân tách các đoạn ADN. • Điện di: – Agarose – PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) http://buihongquan.com
Định tính - định lượng acid nucleic • Quang phổ kế: OD260nm – 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi – 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn – 30 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base) – Kiểm tra độ tinh khiết bằng tỷ lệ OD260/230 hoặc OD260/280, OD320nm • Điện di gel: phân tách acid nucleic bằng dòng điện trong gel – Định tính theo kích thước – Định lượng bằng so sánh với chuẩn http://buihongquan.com
Điện di http://buihongquan.com
Các enzym biến đổi acid nucleic • Enzym cắt hạn chế / methylase – Cắt ADN tại vị trí xác định – Tạo ra đầu dính hoặc đầu tù – Lưu ý tính tương thích khi cắt nối • Polymerase – ADN polymerase phụ thuộc ADN – Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc ADN) – ADN Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu – ARN polymerase phụ thuộc ADN • Ligase – Nối hai đoạn ADN C-A-T-G-A-T A-T-G-A-T-G C-A-T-G-A T-G-T-G-A-T-G C-A-T-G-A G-T-G-A-T-G G-T-A-G-T-A T-A-G-T-A-C G-T-A-G-T-A-C A-C-T-A-C G-T-A-G-T-A-C A-C-T-A-C Nối được Nối được Không được http://buihongquan.com
Kỹ thuật lai acid nucleic • Là sự bắt cặp bổ sung đặc hiệu của hai phân tử acid nucleic mạch đơn G-T-A-G-T-C-C + T-C-A-G-G-T G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T  Các yếu tố ảnh hưởng – Nồng độ ADN và thời gian phản ứng – Nhiệt độ – Độ dài của các trình tự – Lực ion http://buihongquan.com
Kỹ thuật lai acid nucleic • Southern Blot: lai ADN Chiết tách ADN vi khuẩn • Northern Blot: lai ARN ADN đích Gắn ADN vào màng Màng • Lai tại chỗ (in situ) B B Lai với đ o ạ n d ò đánh Đ ò được đánh • Mẫu dò (probe) d ấ u b ằ n g b i o t i n o ạ n d d ấ u b i o t i n B B • Hệ thống phát hiện – Phóng xạ Streptavidin – Enzym B B – Huỳnh quang AP B Alkaline phosphatase AP AP biotinyl hóa B B AP B B AP AP B B AP B B Cơ c h ấ t A l k a l i n e p h o s p h a t a s e Phát quang AP AP B B AP B B AP AP B B AP B B http://buihongquan.com
Kỹ thuật PCR • Nguyên lý: sao chép ADN in vitro – Trong điều kiện có sẵn nucleotid – Enzym polymerase sẽ kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung nếu đầu 3’-OH trống • Kỹ thuật PCR gồm 3 bước: – biến tính dsADN thành các sợi đơn nhờ nhiệt độ, – ủ các đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp đặc hiệu) với các ssADN, – enzym kéo dài các đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với khuôn mẫu. Polymerase nucleotid 5’-P 3’-OH 3’-OH 5’-P http://buihongquan.com
PCR http://buihongquan.com
PCR - Các yếu tố kỹ thuật • Chương trình PCR – Biến tính khởi đầu: 95oC / 5-10 phút – Chu kỳ nhiệt: gồm 3 bước lặp lại 25-40 lần • Biến tính: 94-95oC / 30’-vài phút • Gắn mồi: 40-70oC (< Tm của mồi) / 30’-60’ • Kéo dài: 65-74OC / thời gian tùy theo độ dài khuôn – Kéo dài kết thúc: 72-74oC / vài lần thời gian kéo dài • Thành phần phản ứng: 20-100 µl – Khuôn mẫu – Mồi (oligo 15-30 nucleotid, được thiết kế đặc hiệu) – Đệm có nồng độ Mg++ thay đổi (cần tối ưu hóa) – dNTP: A, T, G và C – DNA polymerase chịu nhiệt http://buihongquan.com
Ưu nhược điểm và các biến thể • Ưu – Nhanh, Đơn giản, Nhạy, Đặc hiệu • Nhược – Phải biết trình tự 2 đầu để thiết kế mồi – Ngoại nhiễm  mất tính đặc hiệu • Biến thể – Nested PCR (tổ): dùng 2 bộ mồi  tăng tính đặc hiệu, nhạy khi khuôn mẫu không tốt – Multiplex PCR: dùng nhiều bộ mồi của nhiều khuôn mẫu trong một phản ứng – RT-PCR: khuôn mẫu ARN – Realtime-PCR: PCR song song với phát hiện sản phẩm – …… http://buihongquan.com
Ứng dụng PCR • Tạo đoạn ADN mong muốn • Giải trình tự • Gây đột biến • Chẩn đoán, Phát hiện và định danh sinh vật • Xác định quan hệ di truyền • Nhận dạng tội phạm,… http://buihongquan.com
Phương pháp giải trình tự Sanger • Phương pháp enzym/dideoxy: dựa vào sự ngừng tổng hợp ADN khi gặp phải dideoxy nucleotid (Frederick Sanger) • Qui trình: – Thực hiện 4 phản ứng PCR riêng biệt với 1 mồi: 1. A: có dNTP + ddATP 2. T: có dNTP + ddTTP 3. G: có dNTP + ddGTP 4. C: có dNTP + ddCTP – Mỗi ống sản phẩm được nạp vào một giếng điện di – Kết quả điện di được đọc  trình tự http://buihongquan.com
Đọc kết quả Phương pháp Sanger 5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’ ddG ddA ddT ddC 3’ 5’ http://buihongquan.com
Kỹ thuật tự động mới nhất (Harold Swerdlow) • Các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau • Thực hiện một phản ứng PCR duy nhất với sự hiện diện của các dNTP và ddNTP • Sử dụng điện di mao quản để tách sản phẩm • Đọc kết quả bằng đầu dò laser http://buihongquan.com
Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert • Phương pháp hóa học: dựa vào sự thủy giải đặc trưng của ADN (Allan Maxam và Walter Gilbert) • Qui trình: – Tạo ADN sợi đơn từ đoạn ADN cần giải trình tự – Đánh dấu các phân tử ADN ở một đầu – Thực hiện 4 (hoặc 5) ống phản ứng riêng biệt: 1. G: + dimethyl sulphate  Guanine bị methyl hóa 2. AG: + formic acid  Adenin và Guanine bị methyl hóa 3. TC: + Hydrazine  biến đổi Thymin và Cytosin 4. C: + Hydrazine + 1,5 M NaCl  biến đổi Cytosin – Xử lý 4 ống trên với piperidine 1M/90oC để cắt ADN ở liên kết phosphat kế nucleotid bị biến đổi 5. A>C: NaOH 1,2N/90oC cắt ADN ở Adenin > Cytosin – Mỗi ống được nạp vào một giếng điện di – Kết quả điện di được đọc và biện luận  trình tự http://buihongquan.com
Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert ADN cần giải trình tự Tạo sợi ADN đơn Đánh dấu bằng P32 Cắt tại các base đặc hiệu Phản Phản Phản Phản ứng tại ứng tại ứng tại ứng tại G A/T T/C C http://buihongquan.com
Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert Điện di Tách theo kích thước Phóng xạ ký Kích thước của sản phẩm (số 3’ nucleotid) 5’ G A/G T/C C Đọc trình tự http://buihongquan.com 394