Báo cáo khoa học: Nghiên cứu chiết xuất tinh dầu từ vỏ quả và lá Quất bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

1 LỜI MỞ ĐẦU       Tinh dầu thiên nhiên hiện nay là một sản phẩm khá thông dụng trên thị trường.   Nó được ứng dụng tương đối phổ biến trong nhiều lĩnh vực như  thực phẩm, dược  phẩm, y học, mỹ phẩm và một số lĩnh vực khác…       Hiện nay, có nhiều phương pháp để chiết rút tinh dầu từ thực vật, trong đó có   phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đơn giản, dễ thực hiện và cho hiệu xuất   thu hồi tinh dầu tương đối cao. Tinh dầu Citrus được sử  dụng phổ  biến do nó có  mùi thơm dễ chịu, có tác dụng trị  cảm, giảm stress và thanh nhiệt…Quất thuộc họ  Citrus nhưng chưa có công trình nào được nghiên cứu sâu về nó, do đó chúng tôi sẽ  thực hiện đề  tài “Nghiên c ứ u chi ế t xu ấ t tinh d ầu t ừ  v ỏ  qu ả  và lá Quấ t bằ ng   ph ươ ng  pháp   ch ư ng   c ấ t  lôi   cu ố n  h ơ i  n ướ c”   và   phân  tích   xác   đ ị nh  các   tính  ch ấ t hóa­ lý  c ủ a tinh d ầ u thành ph ẩ m thu  đượ c đ ể  đánh giá chấ t lượ ng và  kh ả  năng  ứ ng d ụ ng làm h ươ ng li ệ u c ủ a nó.  2 Ch ươ ng 1. KHÁI QUÁT CHUNG         Trong cu ộc s ống hàng ngày ta th ườ ng s ử  d ụ ng tinh d ầu thiên nhiên vào   r ấ t nhi ề u  m ục   đích khác  nhau,  ch ẳ ng h ạn nh ư  ch ữa   b ệnh,   làm đ ẹ p,     nướ c  gi ả i khát, bánh k ẹ o, s ữ a t ắ m, n ướ c hoa…Nh ư  v ậy có th ể  nói tinh d ầ u thiên  nhiên   gi ữ   m ộ t   vai   trò   không   th ể   thay   th ế   trong   các   lĩnh   v ự c   y   h ọ c,   d ượ c  ph ẩ m, m ỹ  ph ẩ m…và c ả  trong cu ộc s ống đ ờ i thườ ng, nh ấ t là trong th ờ i đạ i  ngày   nay   khi   mà   xu   h ướ ng   s ử   d ụ ng   các   s ả n   ph ẩ m   có   ngu ồ n   g ố c   t ừ   thiên  nhiên.               Hi ện nay, trên th ế  gi ới đã có r ấ t nhi ề u công trình nghiên c ứ u v ề  tinh   d ầ u, nh ấ t là các lo ạ i tinh d ầu thu ộc h ọ  Citrus nh ư  Cam, Chanh, …vì các tác  d ụ ng  ư u vi ệ t c ủa nó mang l ạ i nh ư  thanh nhi ệt, gi ải c ảm, gi ảm stress...           Tinh d ầu t ừ  v ỏ  qu ả, lá và hoa c ủ a các cây thu ộ c h ọ   Citrus là m ộ t ch ấ t  t ạ o mùi và h ươ ng th ơ m t ự  nhiên và đượ c s ả n xu ấ t hàng nghìn tấ n kh ố i m ỗ i  năm.   Các   nghiên  c ứ u  v ề   tinh  ch ấ t   v ật  lý,   thành  ph ầ n  hóa   h ọ c   và   hoạ t  tính   sinh h ọc c ủ a tinh d ầu h ọ   Citrus thu nh ậ n đ ượ c b ằ ng các k ỹ  thu ậ t tách chi ế t  hi ệ n đ ạ i đã đượ c quan tâm nhi ề u trong nh ữ ng năm g ầ n đây. Ch ẳ ng h ạ n nh ư ,  Lin  và   Rouseff   (2001)  và   Napapor   Thavanapong  thu ộc   khoa   D ượ c,   Đ ạ i  h ọ c  Silpakorn,   Thái   Lan   (2006)   đã   nghiên   c ứ u   v ề   tinh   d ầu   B ưở i   b ằng   ph ươ ng   pháp  ép   l ạ nh;   Atti­Santos,   Serafini,   Moyna   và   cs.   (2005)   đã   nghiên   c ứ u  xác  đ ị nh   đi ề u   ki ệ n   t ối   ư u   cho   vi ệc   chi ết   tinh   d ầu   chanh   b ằng   ph ươ ng   pháp   ch ư ng c ấ t h ơi n ướ c (HD) và chi ế t b ằ ng CO 2  siêu t ớ i h ạ n (CO 2 ­SFC); M. M.  Ahmad, Salim­ur­rehman, F. M. Anjum, E. E. Bajwa (2006)  đã nghiên c ứ u tinh  ch ấ t   lý   h ọ c   c ủ a   tinh   d ầu   chi ết   t ừ   v ỏ   c ủa   các   lo ạ i   Citrus  khác   nhau  (6,7,9,10).Trong n ướ c, có công trình nghiên c ứ u   “Kh ả o sát tinh d ầ u v ỏ  trái   gi ố ng Citrus h ọ  Rutaceae”   c ủ a Nguy ễ n Minh Hoàng (2006) hay   “Tách tinh  d ầ u và alkaloid t ừ  qu ả  Qu ất (Citrus japonica Thumb.)”   c ủ a Nguy ễ n Th ị  Lý  và Cs…hay đ ề  tài t ố t nghi ệ p Đạ i h ọ c  “Nghiên c ứ u chi ế t xu ấ t tinh d ầu t ừ  v ỏ  b ưở i   Năm  Roi   ( Citrus   grandis  (L.)   Osbeck  var.  grandis)  b ằ ng  ph ươ ng   pháp  ch ư ng c ấ t lôi cu ố n h ơ i n ướ c”  (2010) c ủ a Sinh viên Nguy ễ n Đắ c Phát Tr ườ ng  Đ ạ i h ọ c Nha Trang .(2,3,5)  3  Cac dang ch ́ ̣ ưng cât tinh dâu –  ́ ̀ Ưu  và nhược điểm Trong công nghiệp, người ta chia các phương pháp chưng cất hơi nước ra   thành ba dạng chính: chưng cất bằng nước   (water  distillation), chưng cất bằng  nước và hơi nước (water and steam distillation) và chưng cấy bằng hơi nước trực  tiếp nước (direct steam distillation). a) Chưng cât b ́ ằng nươc  ́ (Water Distillation):  Nguyên   liêụ   và  nươć   cung  ̀ cho   vaò   môṭ   Sinh  ́ ̣ thiêt bi. Khi đun sôi, h ơi nươc bay ra se cuôn ́ ̃ ́  hàn ̀ ơi ngưng tu bay ra se thu đ theo tinh dâu, h ̣ ̃ ược  ̃ ợp gôm n hôn h ̀ ươc va tinh dâu, hai thanh phân ́ ̀ ̀ ̀ ̀  nay  ̀ không  tan   vaò   nhau  nên  dễ  dang ̀   tach  ́ ra  Bình  ̉ khoi nhau.  Nước +  hứng  Phương phap nay đ ́ ̀ ơn gian, thiêt bi re tiên ̉ ́ ̣ ̉ ̀  Nguyên  liệu ̀ ̃ ́ ̣ ̀ ợp vơi nh va dê chê tao, phu h ́ ưng c ̃ ơ  sở  san̉   xuât́   nho,̉   vôn ̀   tư   it. ́   đâu ́   Tuy   nhiên,   phương  phap nay có ́ ̀  nhược  điêm nh ̉ ư  hiêu suât thâp, ̣ ́ ́   ́ ượng tinh dâu không cao do nguyên liêu chât l ̀ ̣   Hình 1.1. Thiết bị chưng cất  ́ ực tiêp v tiêp xuc tr ́ ́ ơi thiêt bi nên dê bi chay ́ ́ ̣ ̃ ̣ ́       bằng nước ́ ́ ̀ ̉ ́ ́ ̃ ̣ khet, kho điêu chinh cac thông sô ky thuât như  ́ ̣ ̀ ̣ ̣ ưng cât. tôc đô va nhiêt đô ch ́ b) Chưng   cât́   băng ̀   hơi   nươć   không   có  nôì   hơi   riêng  (Water   and   Steam  Distillation): ̣ ̀ ươc cung cho vao môt thiêt bi nh Nguyên liêu va n ́ ̀ ̀ ̣ ́ ̣ ưng cach nhau b ́ ởi môt vi nôi. ̣ ̉ ̀  Khi đun sôi, hơi nươc bôc lên qua khôi nguyên liêu keo theo tinh dâu va đi ra thiêt bi ́ ́ ́ ̣ ́ ̀ ̀ ́ ̣  ngưng tu. Đê nguyên liêu khoi r ̣ ̉ ̣ ̉ ơi vao phân co n ̀ ̀ ́ ươc ta co thê lot trên vi m ́ ́ ̉ ́ ̉ ột hay   ̀ ơp bao tai tuy theo t nhiêu l ́ ̉ ̀ ưng loai nguyên liêu. Ph ̀ ̣ ̣ ương phap nay phu h ́ ̀ ợp vơí  nhưng c ̃ ơ sở san xuât co qui mô trung binh. ̉ ́ ́ ̀ So vơi ph ́ ương phap ch ́ ưng cất bằng nước trực tiếp, phương phap nay co  ́ ̀ ́ưu   ̉ điêm h ơn, nguyên liêu it bi chay khet vi không tiêp xuc tr ̣ ́ ̣ ́ ́ ̀ ́ ́ ực tiêp v ́ ới đay thiêt bi, cac ́ ́ ̣ ́   4 nhược điêm khac vân ch ̉ ́ ̃ ưa khăc phuc đ ́ ̣ ược. Phương phap nay thich h ́ ̀ ́ ợp cho nhưng ̃   ̣ ̣ ̣ ược nhiêt đô cao. loai nguyên liêu không chiu đ ̣ ̣ Van  Ống ngưng tụ  khóa Vỉ nồi Nguyên  liệu Van xả  nước ngưng Nguồn nhiệt Hình 1.2. Thiết bị chưng cất hơi nước không có nồi hơi riêng c) Chưng cât băng h ́ ̀ ơi nươc co nôi h ́ ́ ̀ ơi riêng (Steam Distillation): Trong phương pháp này hơi nươc đ ́ ược tao ra t ̣ ư môt nôi h ̀ ̣ ̀ ơi riêng va đ ̀ ược dân ̃  ́ ̣ ưng cât. Ph vao cac thiêt bi ch ̀ ́ ́ ương phap nay phu h ́ ̀ ̀ ợp vơi nh ́ ưng c ̃ ơ sở san xuât l ̉ ́ ớn.  Ưu điểm của phương phap nay là cung môt luc co thê phuc vu đ ́ ̀ ̀ ̣ ́ ́ ̉ ̣ ̣ ược cho nhiêu thiêt ̀ ́  ̣ ưng cât, điêu kiên lam viêc cua công nhân nhe nhang h bi ch ́ ̀ ̣ ̀ ̣ ̉ ̣ ̀ ơn, dê c ̃ ơ  khi hoa va t ́ ́ ̀ ự  ̣ ́ ́ ̣ ̉ ́ ́ ́ ́ ơn cac thông sô công nghê, rut ngăn đông hoa cac công đoan san xuât, không chê tôt h ́ ́ ̣ ́ ́  được thơi gian san xuât. Ngoai ra, ph ̀ ̉ ́ ̀ ương phap nay đa khăc phuc đ ́ ̀ ̃ ́ ̣ ược tinh trang ̀ ̣   ̣ ̣ ́ ̀ ́ ̉ ̀ ơi qua nhiêt đê ch nguyên liêu bi khê, khet va co thê dung h ́ ̣ ̉ ưng cât theo yêu câu cua ́ ̀ ̉   ̣ ́ ơi môt sô tinh dâu trong điêu kiên ch công nghê. Tuy nhiên, đôi v ́ ̣ ́ ̀ ̀ ̣ ưng cât  ́ ở nhiêt đô va ̣ ̣ ̀  ̃ ̣ ̉ ̉ ́ ượng. Hơn nưa, cac thiêt bi s ap suât cao se bi phân huy lam giam chât l ́ ́ ̀ ̃ ́ ́ ̣ ử dung trong ̣   phương phap nay kha ph ́ ̀ ́ ưc tap va đăt tiên.  ́ ̣ ̀ ́ ̀  5 Hơi nước  và hơi  Nước lạnh tinh dầu Nước nóng Tinh  dầu Hơi nước Nhiệt Nước hoa Hình 1.3. Thiết bị chưng cất hơi nước có nồi hơi riêng       Ưu­ nhược điểm của phương pháp chưng cất   Ưu điểm:  ­ Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản. ­ Thiết bị gọn, dễ chế tạo. ­ Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ. ­ Thời gian chưng cất tương đối nhanh.  Nhược điểm: ­ Không hiệu quả đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp. ­ Chất lượng tinh dầu có thể  bị   ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu   phần dễ bị phân hủy. ­ Không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó là những chất  định hương thiên nhiên rất có giá trị). ­ Trong nước chưng luôn luôn còn một lượng tinh dầu tương đối lớn. ­ Những tinh dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém. Phương pháp chiết (Extraction) Cơ  sở  của phương pháp dựa trên hiện tượng thẩm thấu, khuếch tán và hòa  tan của tinh dầu có trong các mô nguyên liệu khi tiếp xúc với dung môi hữu cơ.  Phương pháp chiết thường dùng để  tách các hương liệu dễ  bay hơi mà phương  pháp chưng cất tỏ ra kém hiệu quả.   6 Trong phương pháp này nguyên liệu được ngâm trong dung môi hữu cơ thích  hợp, sau đó cất chân không để  thu hồi dung môi, phần còn lại là hỗn hợp tinh dầu  và sáp được gọi là tinh dầu cô kết (gọi là “concrete oil”). Dùng cồn tuyệt đối hòa   tan “concrete oil” rồi để lạnh, khi đó phần sáp sẽ đông đặc và được tách loại, phần   dịch còn lại được đem chưng cất lôi cuốn hơi nước để  thu tinh dầu tinh khiết (gọi   là “absolute oil”). Đây cũng chính là hai dạng sản phẩm chính của chất thơm hiện   lưu hành trên thị trường. Yêu cầu của dung môi chiết Yếu tố  quan trọng nhất cho sự  thành công của phương pháp này là phẩm   chất và đặc tính của dung môi sử  dụng, do đó dung môi chiết cần phải đạt được   những yêu cầu sau:  Hòa   tan hoàn  toàn  và  nhanh chóng  các  cấu phần  có   mùi  thơm  trong  nguyên liệu.  Hòa tan kém các hợp chất khác như sáp, nhựa dầu có trong nguyên liệu.  Không có tác dụng hóa học với tinh dầu.  Không biến chất khi sử dụng lại nhiều lần.  Hoàn toàn tinh khiết, không có mùi lạ, không độc, không ăn mòn thiết bị,   không tạo thành hỗn hợp nổ với không khí và có độ nhớt kém.  Nhiệt độ  sôi thấp vì khi chưng cất dung dịch ly trích để  thu hồi dung  môi, nhiệt độ sôi cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu. Điểm sôi   của dung môi nên thấp hơn điểm sôi của cấu phần dễ  bay hơi nhất   trong tinh dầu.  Ngoài   ra,   cần  có   thêm  những  yếu  tố   phụ   khác   như:  giá   thành  thấp,  nguồn cung cấp dễ tìm, … Thường thì không có dung môi nào thỏa mãn tất cả những điều kiện kể trên.   Người ta sử  dụng cả  dung môi không tan trong nước (như  dietyl ete, ete dầu hỏa,   hexan, cloroform…) lẫn dung môi tan trong nước (như etanol, axeton…). Trong một   số trường hợp cụ thể, người ta còn dùng một hỗn hợp dung môi. Ưu và nhược điểm của phương pháp  7 ­ Ưu điểm: Sản phẩm thu được theo phương pháp này thường có mùi thơm tự  nhiên. Hiệu suất sản phẩm thu được thường cao hơn các phương pháp khác. ­ Khuyết điểm: Yêu cầu cao về thiết bị, thất thoát dung môi, quy trình tương  đối phức tạp. Phương pháp ướp (Enfleurage) Cơ sở của phương pháp dựa trên hiện tượng hấp phụ chất thơm bởi các chất  béo dạng lỏng hay rắn (vaselin, parafin, dầu oliu hoặc mỡ động vật) đã tinh chế.   Người ta dùng các khay sâu 8cm, rộng 60cm, dài 100cm đáy là mặt kính có phủ lớp   chất béo để hấp phụ chất thơm. Các khay có thể xếp chồng lên nhau, trên mặt khay  xếp đều nguyên liệu để trích hương và để  yên trong khoảng từ 12­72 giờ tùy từng   loại nguyên liệu, sau đó thay lớp nguyên liệu mới và để hấp phụ từ 10­15 lần cuối  cùng thu được chất béo có mùi thơm. Đem lắc chất béo với etanol cao độ để trích ly  tinh dầu, sau đó để lạnh ­100C để loại bỏ hết chất béo bị kéo theo rồi cô đuổi etanol  dưới áp suất thấp để thu tinh dầu. Kỹ thuật này thuờng được dùng để chiết hương  thơm   của   các   loài   hoa   để   thu   sản   phẩm   dưới   dạng   tinh   dầu   cô   đặc   (“essence  concentrée”) dùng trong mỹ phẩm. Phương pháp ngâm (Hot Maceration) Phương pháp này dựa trên hiện tượng hấp thụ  chất thơm bởi các loại dầu  béo. Hoa được ngâm trong dầu béo đã tinh chế trong một thiết bị được làm nóng bởi   hơi nước  ở  45­600C trong thời gian từ 1­2h. Sau mỗi lần ngâm, vớt hoa ra cho vào  máy vẩy ly tâm để thu hồi dầu và cho tiếp nguyên liệu mới vào. Mỗi mẻ dung môi   có thể  dùng để  chiết 10­15 lần. Dầu béo đã bão hòa chất thơm được đem lắc với   etanol rồi cô dưới áp suất thấp để  thu được tinh dầu cô đặc tương tự  như  trong   phương pháp ướp. Phương pháp ép (Expression hay Cold Pressing) Phương pháp này áp dụng cho các loại dược liệu có hàm lượng tinh dầu cao   và tế bào chứa tinh dầu ở phần vỏ thuộc chi Citrus. Nguyên liệu chiết được trích tinh dầu bằng cách ép  ở  nhiệt độ  thường sử  dụng các loại máy ép trục vít vô tận hoặc cối ép dùng nêm (giống như  ép các loại   dầu béo). Phần thu được là một hỗn hợp gồm tinh dầu và dịch cùi có thể  dễ  dàng    8 tách bằng cách cho thêm nước muối bão hòa, tinh dầu sẽ  nổi lên trên có kéo theo  một phần sáp và nhựa. Dùng etanol 75 ­ 800 để hòa tan tinh dầu, sau đó làm lạnh để  loại bỏ sáp. Sau khi cô dưới áp suất thấp để loại bỏ etanol ta có sản phẩm tinh dầu   có lẫn một ít nhựa. Phương pháp này có thể  cho hiệu suất trên 90% so với hàm   lượng tinh dầu định lượng trong phòng thí nghiệm. Ngoài ra, ngày nay người ta còn sử dụng các phương pháp mới trong việc ly   trích tinh dầu như phương pháp chưng cất hay chiết dưới sự hỗ trợ bởi vi sóng, bởi  siêu âm, kỹ  thuật vi chiết pha rắn (SPME:   Solid phase micro­extraction), kỹ  thuật  chiết siêu tới hạn (SFE: Supercritical fluid extraction), chiết kết hợp với chưng cất  (SDE:  Simultaneous distillation extraction),…Tuy nhiên, các phương pháp trên  chi  phí đắt và thiết bị phức tạp hơn nên ít phổ biến hơn trong thực tế. So với các phương pháp trên thì phương pháp chưng cất lối cuốn bằng hơi   nước dễ áp dụng trong điều kiên phòng thí nghiệm, chi phí đầu tư  ít, dễ  dàng vận  hành, cho hiệu quả  chiết tương đối cao. Do đó chúng tôi đã áp dụng phương pháp   chưng cất lôi cuốn bằng hơi nước để chưng cất tinh dầu từ vỏ và lá quất sử  dụng   cho đề tài        Trong s ố các loài thu ộc h ọ  Citrus thì Qu ấ t cũng khá ph ổ  bi ế n nh ư ng v ẫ n   ch ư a   đ ượ c   quan   tâm   nhi ề u.   Qu ấ t   là   cây   c ả nh   d ễ   tr ồ ng   t ạ i   Vi ệ t   Nam,   nh ư  v ậ y vi ệc chúng ta t ậ n d ụng ngu ồn nguyên li ệ u phong phú và r ẻ  ti ề n này đ ể  chi ế t   xu ấ t   tinh   d ầu   s ẽ   mang   l ại   hi ệu   qu ả   kinh   t ế   cao   (theo   kh ảo   s át   thị  tr ườ ng có th ể  trên 100.000 đ ồ ng/10ml),  đ ồ ng th ờ i góp ph ầ n gi ả i quy ế t v ấ n  đ ề  môi tr ườ ng đang nóng b ỏ ng hi ệ n nay(11).                Xu ấ t phát t ừ  yêu c ầ u th ự c ti ễ n trên đây, đ ượ c s ự  đ ồ ng ý củ a Tr ườ ng   Đ ạ i h ọ c Nha Trang và khoa Công ngh ệ  Th ự c ph ẩ m, d ướ i s ự  h ướ ng d ẫn c ủa   TS. Vũ Duy Đô và TS. Hoàng Th ị  Hu ệ  An, chúng em đã ti ế n hành nghiên c ứ u   và th ự c hi ệ n đ ề  tài:  “Nghiên c ứ u chi ế t xu ấ t tinh d ầu t ừ  v ỏ qu ả và lá Qu ấ t   b ằ ng ph ươ ng pháp ch ư ng c ấ t lôi cu ố n h ơ i n ướ c”.           M ụ c tiêu c ủ a đ ề  tài chúng tôi là: nghiên c ứ u các y ế u t ố   ả nh h ưở ng t ớ i   hi ệ u su ấ t chi ế t tinh d ầu Qu ất đ ể  làm c ơ  s ở  khoa h ọ c cho vi ệc s ản xu ất trên   quy mô công nghi ệp. C ụ  th ể là:  9 ­ Xác l ậ p đi ề u ki ệ n t ối  ư u cho vi ệc tách chi ế t tinh d ầ u t ừ  v ỏ  qu ả  và lá Quấ t  b ằ ng ph ươ ng pháp ch ư ng c ấ t lôi cu ố n h ơ i n ướ c.  ­ Đ ư a  ra  quy trình  ch ư ng  c ấ t t ối   ư u  đ ể   thu  nh ậ n  tinh  d ầ u  t ừ  v ỏ   qu ả   và  lá  Qu ấ t.  ­ Xác đ ị nh các ch ỉ  s ố  lý­hóa c ơ  b ả n và thành ph ầ n hóa h ọ c c ủ a s ả n ph ẩ m đ ể  s ử  d ụ ng làm h ươ ng li ệ u.               K ế t qu ả  nghiên c ứ u c ủ a đ ề  tài có th ể  xem là c ơ  s ở  khoa h ọ c ban đầ u   c ủ a vi ệ c xây d ự ng quy trình s ả n xu ấ t tinh d ầu t ừ  v ỏ  qu ả  và lá Quấ t trên quy   mô công nghi ệp cũng nh ư  cung c ấ p nh ững d ẫn li ệu khoa h ọc v ề  thành phầ n   hóa h ọ c và tính ch ấ t lý­hóa c ơ  b ả n c ủ a tinh d ầu Qu ất nh ằm phát tri ể n các   kh ả  năng  ứ ng d ụ ng khác.                 Do ki ến th ức và kinh nghi ệm nghiên c ứ u còn h ạ n ch ế  cũng nh ư  khó   khăn v ề  đi ề u ki ệ n th ự c nghi ệm và đi ề u ki ệ n v ề  kinh phí nên mặ c dù đã rấ t  c ố  g ắ ng song  đ ề  tài này không tránh kh ỏ i nh ững thi ếu sót. R ấ t mong nh ậ n  đ ượ c   s ự   ch ỉ  b ả o c ủa  quý  th ầ y  cô  cũng nh ư   s ự   góp  ý  ki ế n t ừ   các  b ạ n  sinh   viên đ ể  đ ề  tài này đ ượ c hoàn thi ệ n h ơ n.                                               Nha Trang, ngày 18 tháng 11 năm 2011                                                                      Sinh vi ên th ự c hi ệ n                                                                     Ph ạ m Th ị  M ỹ  Loan                                                                      Phan Anh qu ốc  10 Ch ươ ng 2: Đ Ố I T ƯỢ NG VÀ PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN  CỨU 2.1. Đ ố i t ượ ng nghiên c ứ u  2.1.1. Nguyên li ệ u chính          Nguyên li ệ u s ử  d ụ ng tách tinh d ầ u trong nghiên c ứ u này là v ỏ  qu ả  và lá  Qu ấ t ( Citrus japonica Thumb) đ ượ c thu mua t ừ  TP.HCM. Nguyên li ệ u t ươ i,  v ỏ  qu ả  có màu vàng sáng bóng đ ặ c tr ư ng, không bị  n ấ m m ố c và lá xanh t ươ i,   đ ạ t đ ộ  tr ưở ng thành và không b ị  sâu b ệ nh.                      Hình 2.1. Qu ả  Qu ấ t                                        Hình 2.2. Lá Qu ấ t 2.1.2. D ụ ng c ụ ­ Thi ết b ị ­ Hóa chấ t  a. D ụ ng c ụ  ­ Thi ết b ị  ­ Cân k ỹ  thu ậ t 1 mg (Shimadzu, Nh ật)  ­ Cân k ỹ  thu ậ t 1 g (Vi ệt Nam) ­ Cân phân tích 0,1 mg (Satorius, Nh ật)   ­ B ộ  ch ư ng c ấ t tinh d ầu đị nh l ượ ng, có h ồ i lư u ki ể u Clevenger dùng cho tinh  d ầ u nh ẹ  h ơn n ướ c (ISOLAB, Đ ứ c)  ­ B ế p đun bình c ầ u 1000 ml (Trung Qu ốc)  ­ Máy xay đi ệ n (Sanyo, Nh ật)  ­ T ủ  s ấ y 10C (Memmert , Đứ c)  ­ T ủ  l ạ nh tr ữ  m ẫu ­20 0 C.  ­ Bình đo t ỷ  tr ọng 25 ml (Bomex, Trung Qu ốc)   11 ­ Buret, pipet, bình tam giác, c ố c th ủ y tinh, đũa th ủ y tinh. ­ H ệ  th ống s ắc ký khí ghép kh ố i ph ổ  hai l ầ n v ới thi ết b ị  GC model G3440A   c ủ a   hãng   Agilent   (Agilent,   USA)   ghép   v ớ i   detector   MS/MS   model   Quattro   microTMGC c ủa hãng Waters (USA)  b. Hóa ch ấ t  ­ N ướ c c ấ t.  ­ NaCl ­ Na 2 SO 4  khan  ­ KOH 0.1N và 0.5N ­ HCl 0.5N ­ Etanol 90 0 ­ Dung d ị ch ch ỉ th ị  phenolphtalein 1%  2.2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứ u  2.2.1. Xác định thành phần khối lượng của quả Quất        Chọn các quả Quất và lá đạt yêu cầu như đã nêu, tiến hành rửa sạch để loại bỏ  các tạp chất và vi sinh vật có trên bề mặt nguyên liệu và để ráo nước. Đối với quả  thì tiến hành xác định thành phần khối lượng như sau:  ­ Cân một lượng quả nhất đinh ta được khối lượng là mQ  ­  Lột lấy phần vỏ bên ngoài có chứa các túi tinh dầu. Đem cân phần này ta được   khối lượng mV  ­ Phần ruột quả (múi quả) đem cân ta được khối lượng là mR       Thành phần khối lượng của quả Quất được tính như sau:         Vỏ(%)  =   (mQ. mV)/mQ *100%        Ruột(%) = (mQ. mR)/mQ *100%  2.2.2. Chuẩn bị nguyên liệu         Nguyên liệu quả sau khi rửa sạch thì để ráo nước, đối với lá sau khi ráo thì cân  chính xác 100g/mẫu rồi cho vào túi polyetylen cột kín để hạn chế sự không khí tới   mức tối đa, rồi đem nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ ­200C đến khi nghiên cứu.   12       Khi sử dụng, đối với quả thì ta dùng tay lột lấy phần vỏ vàng bên ngoài, rồi cân   chính xác 100g/mẫu. Thực hiện cắt nhỏ  nguyên liệu, trộn đều để  đồng nhất mẫu   và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.3. Phương pháp chưng cất          Đây là phương pháp đầu tiên được dùng để tách tinh dầu ra khỏi nguyên liệu   thực vật. Cơ  sở  của phương pháp này là nhiệt độ  sôi của hỗn hợp sẽ  thấp hơn   nhiệt độ sôi của các cấu tử thành phần. Do đó, khi chưng cất hơi nước các cấu tử  tinh dầu sẽ được tách ra ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của nước, vì vậy sẽ hạn  chế sự biến tính hóa học (sự oxy hóa, nhiệt phân...) các cấu tử tinh dầu. Trong quá  trình chưng cất, hơi nước sẽ được thẩm thấu vào các mô nguyên liệu, sau đó sẽ hòa   tan, khuếch tán và lôi cuốn theo các hợp chất hữu cơ  trong thành phần tinh dầu.   Dịch chưng cất sẽ được ngưng tụ và phân tách thành 2 lớp (lớp tinh dầu bên trên và  lớp nước  ở  bên dưới) trong hệ  thống ngưng tụ. Sự  khuếch tán sẽ  dễ  dàng khi tế  bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong  một thời gian nhất định. Trường hợp các mô thực vật có các hợp chất khó bay hơi   (như  sáp, nhựa, acid béo dây dài mạch thẳng) thì quá trình chưng cất phải được  thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi  chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn(4).   Những yếu tố chính ảnh hưởng hiệu suất chưng cất tinh dầu  Sự khuếch tán Ngay cả khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu   bị  vỡ  và cho tinh dầu thoát tự  do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi. Theo Von   Rechenberg,  ở nhiệt độ  sôi của nước phần lớn tinh dầu còn lại trong các mô thực   vật sẽ được hòa tan vào trong nước có sẵn trong tế bào thực vật. Dung dịch này sẽ  thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị  hơi nước cuốn đi. Còn nước sẽ  thẩm  thấu vào nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục bị  hòa tan vào  lượng nước này. Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô   thoát ra ngoài hết. Như  vậy, sự  hiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong   trường hợp chưng cất sử dụng hơi nước quá nhiệt, chú ý tránh đừng để nguyên liệu   bị khô. Tuy nhiên, nếu lượng nước sử dụng thừa quá thì cũng không có lợi, nhất là   trong trường hợp tinh dầu có chứa những cấu phần tan dễ trong nước.  13  Sự thủy phân Những cấu phần este trong tinh dầu dễ bị thủy phân cho ra acid e và alcol khi  đun nóng trong một thời gian dài với nước. Do đó, để  hạn chế hiện tượng này, sự  chưng cất hơi nước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt.  Nhiệt độ Nhiệt độ  cao sẽ  làm phân hủy tinh dầu. Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi   nước quá nhiệt (trên 1000C) nên thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của  sự chưng cất, sau khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết. Thực ra, hầu hết   các tinh dầu đều kém bền dưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề  là làm sao cho thời   gian chịu nhiệt độ cao của tinh dầu càng ngắn càng tốt. Tóm lại, dù 3  ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế  thì chúng  có liên quan với nhau và quy về   ảnh hưởng của nhiệt độ. Khi tăng nhiệt độ, sự  khuếch tán, thẩm thấu sẽ  tăng, sự  hòa tan tinh dầu trong nước sẽ  tăng nhưng sự  phân hủy cũng tăng theo.    2.2.4. Dự kiến quy trình tách chiết tinh dầu từ Quất   Quy trình chung dự kiến tách chiết tinh dầu Quất bằng phương pháp chưng cất   lôi cuốn hơi nước được trình bày trên hình 2.3.   14 Nguyên liệu Xử lý Xay Nghiên cứu tỷ lệ nước ngâm nguyên liệu  Ngâm Nghiên cứu nồng độ NaCl, thời gian  ngâm Chưng cất lôi cuốn hơi nước Nghiên cứu thời gian chưng  cấ t Ngưng tụ Phân ly Tinh dầu thô Làm khan Na2SO4 khan Lắng, gạn Tinh dầu  Hình 2.3. Sơ đồ quy trình dự kiến tách chiết tinh dầu từ Quất 2.2.5. Bố trí thí nghiệm 2.2.5.1. Thí nghiệm xác định tỉ lệ nước ngâm nguyên liệu       M ục đích : Thí nghiệm xác định lượng nước bổ sung vào khi ngâm nhằm đánh  giá khả  năng phân li tinh dầu trong nguyên liệu, đây là một yếu tố  quan trọng  ảnh    15 hưởng đến hiệu quả của quá trình chưng cất và nó cũng quyết định thời gian cất tối   ưu.        Các thí nghiệm được tiến hành với lượng nước thay đổi theo tỉ lệ nước/nguyên  liệu là: 2/1; 3/1; 4/1; 5/1; 6/1 đối với mẫu vỏ quả và với các tỉ lệ: 3/1; 4/1; 5/1; 6/1;  7/1; 8/1 đối với mẫu lá. Sơ đồ thí nghiệm được bố trí như sau: Vỏ quả đã xử lý Xay Bổ sung nước với tỉ lệ nước/cái:  2/l  3/1  4/1  5/1  6/1  Chưng cất (1h) Ngưng tụ Phân ly Tinh dầu thô Xác định tỷ lệ tinh dầu thu được, chọn tỉ lệ nước bổ sung thích hợp Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nước bổ sung khi ngâm vỏ quả Ét ­ 16 ­         Sơ  đồ  bố  trí thí nghiệm xác định tỉ  lệ  nước bổ  sung khi ngâm  lá được bố  trí  tương tự như sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nước bổ sung khi ngâm vỏ quả. Cơ sơ chọn khoảng khảo sát cho thông số chọn tỉ lệ nước/nguyên liệu Dựa váo các tài liệu tham khảo về  tách chiết tinh dầu họ  citrus và tinh dầu   Quất. Đây là cơ sở giúp định hướng trong việc chọn khoảng khảo sát cho thông số  nước/nguyên liệu. Dựa vào quá trình bố  trí thí nghiệm và thực nghiệm tại phòng thí nghiệm. Từ  đó   đưa ra khoảng khảo sát phù hợp cho tỉ lệ nước/nguyên liệu.        Cách tiến hành: Lấy 100g nguyên liệu đã xử lý cho vào máy xay, thêm vào đó  một lượng nước cất như đã nói ở  trên. Xay trong 2 phút để  làm mẫu dập nát, tăng   diện tích tiếp xúc với môi trường nước thúc đẩy quá trình khuếch tán của tinh dầu.  Sau đó, chuyển toàn bộ nguyên liệu đã xay vào bình cầu của hệ thống chưng cất và  tiến hành chưng cất hỗn hợp trong 60 phút dưới áp suất khí quyển. Đọc thể  tích  tinh dầu thô tách ra trên  ống ngưng tụ  (có khắc vạch thể  tích) và so sánh thể  tích  tinh   dầu   thu   được   ở   các   nồng   độ   khác   nhau   như   trên.   Từ   đó,   chọn   tỷ   lệ  % nước/nguyên liệu thích hợp cho từng loại mẫu. 2.2.5.2. Thí nghiệm xác định hàm lượng NaCl       M ục đích:  NaCl có tác d ụ ng tăng kh ả  năng th ẩ m th ấ u c ủa n ướ c trong t ế  bào, tăng đ ộ  phân c ự c c ủ a dung d ị ch, nh ờ đó làm giả m l ự c t ươ ng tác giữ a các   c ấ u t ử  tinh d ầ u kém phân c ự c v ớ i n ướ c. Nh ờ  đó, tinh d ầ u s ẽ  d ễ  dàng bay h ơ i   trong quá trình ch ư ng c ấ t.         Thí nghiệm được tiến hành với mẫu quả  có hàm lượng NaCl (w/v) thay đổi:   0%; 5%; 10%;  15%; 20% và mẫu lá: 0%; 2,5%; 5%; 7,5%; 10%, với tỷ lệ nước/cái   bổ sung đã chọn thích hợp.  Ét ­ 17 ­  Bố trí thí nghiệm xác định theo hình 2.5. Vỏ đã xử lý Xay Bổ sung tỷ lệ nước / cái thích hợp NaCl (w/v,%): Chưng cất (1h) 0 5  10 15 20  Ngưng tụ Phân ly Tinh dầu thô Đánh giá hiệu suất tách tinh dầu, chọn hàm lượng NaCl thích hợp Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng NaCl bổ sung  đối với mẫu vỏ  quả Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng NaCl bổ sung khi ngâm lá được bố trí  tương tự như sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nước bổ sung khi ngâm vỏ quả. Cơ sở chọn các khoảng khảo sát cho các thông số hàm lượng NaCl Dựa trên các tài liệu tham khảo liên quan đến chiết tinh dầu từ vỏ và lá Quất. Đây  là cơ sở khoa học giúp định hướng trong việc chọn khoảng khảo sát cho các thông   số hàm lượng NaCl. Dựa trên quá trình bố  trí thí nghiệm, tiến hành thực hiện  ở  các khoảng khảo sát   khác nhau, các thí nghiệm được làm lặp lại ít nhất là 3 lần. Sau đó đưa ra khoảng   khảo sát thích hợp.      Cách ti ế n hành:   Ét ­ 18 ­       Lấy 100g nguyên liệu đã xử  lý cho vào máy xay điện, thêm vào đó một lượng  nước cất với tỷ lệ nước/nguyên liệu đã chọn được thông qua lô thí nghiệm trước.   Thêm NaCl vào ở các nồng độ biến thiên như trên, áp dụng cho từng loại mẫu. Xay  trong 2 phút. Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã xay vào bình cầu của hệ thống chưng  cất và chưng hỗn hợp trong 60 phút dưới áp suất khí quyển. Đọc thể  tích tinh dầu  tách ra trên ống ngưng tụ và so sánh. Từ đó, chọn nồng độ NaCl thích hợp. 2.2.5.3. Thí nghiệm xác định thời gian ngâm:  %       Mục đích:        Thời gian ngâm là một yếu tố quan trọng ả% nh hưởng đ % ến thể tích tinh dầu thu %   được bởi vì sự thẩm thấu của muối và nước hay sự khuếch tán của các cấu tử tinh  dầu ra môi trường không thể  thực hiện được trong giây lát mà đòi hỏi phải trong   một khoảng thời gian nhất định.        Thí nhiệm được tiến hành với các thời gian thay đổi như sau: 0h; 1h; 2h; 3h; 4h;   5h đối với cả  2 mẫu. Các thông số  khác của quy trình được chọn: tỉ  lệ  nước/cái  thích hợp; hàm lượng NaCl (w/v,%) thích hợp.         Ét ­ 19 ­ Sơ đồ thí nghiệm trình bày trên hình 2.6. NL đã xử lý Xay Ngâm với thời gian (h) ­ Tỷ lệ cái/nước thích  hợp ­ NaCl (w/v) thích hợp 0  1  2 3 4 5 Chưng cất (1h) Ngưng tụ Phân ly Tinh dầu thô Đánh giá hiệu suất tách tinh dầu, chọn thời gian ngâm thích hợp Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ngâm nguyên liệu Cách thực hiện:       Lấy 100g nguyên liệu đã xử  lý cho vào máy xay điện, thêm vào đó một lượng   nước cất và NaCl với tỷ lệ nước/nguyên liệu và nồng độ  NaCl thích hợp đã chọn.  Xay trong 2 phút. Chuyển toàn bộ  nguyên liệu đã xay vào bình cầu của hệ  thống   chưng cất. Thay đổi thời gian ngâm nguyên liệu lần lượt là: 1h; 2h; 3h; 4h; 5h Sau  đó, chưng cất hỗn hợp trong 60 phút dưới áp suất khí quyển. Đọc thể tích tinh dầu   tách ra trên ống ngưng tụ và so sánh. Từ đó, chọn thời gian ngâm muối thích hợp.  Ét ­ 20 ­ Ét ­ 21 ­ 2.2.5.4. Thí nghiệm xác định thời gian chưng cất       Mục đích:        Thời gian chưng cất có vai trò quyết định lượng tinh dầu thu hồi. Nếu chưng   cất trong thời gian quá ngắn thì lượng tinh dầu trích ly chưa hết hoàn toàn hay nó   vẫn còn tồn tại trong các tế  bào tiết, do vậy sẽ    làm giảm thể  tích tinh dầu thu  được. Ngược lại, khi chưng cất quá thời gian tối ưu thì vừa tốn thời gian, vừa tổn   hao năng lượng và nghiêm trọng hơn là chất lượng tinh dầu thu được cũng bị giảm   đi đáng kể.           Thí nghiệm tiến hành chưng cất nguyên liệu với các khoảng thời gian biến   thiên từ  10 phút, 20 phút, 30 phút…thường xuyên theo dõi và cứ  sau 10phút ghi lại   thể tích tinh dầu ngưng tụ cho đến khi thấy thể tích tinh dầu thô th