intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Bước đầu đánh giá bệnh tồn lưu tối thiểu trên người bệnh bạch cầu cấp dòng tủy mang đột biến gen NPM1 type A bằng kỹ thuật RQ-PCR

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST
Báo xấu
1
lượt xem 0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Xác định bệnh tồn lưu tối thiểu trên người bệnh Bạch cầu cấp dòng tủy mang đột biến gen NPM1 type A bằng kỹ thuật RQ-PCR. Đối tượng: Người bệnh bạch cầu cấp dòng tủy mang đột biến gen NPM1 type A lúc chẩn đoán tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ tháng 10/2022 đến tháng 10/2023.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bước đầu đánh giá bệnh tồn lưu tối thiểu trên người bệnh bạch cầu cấp dòng tủy mang đột biến gen NPM1 type A bằng kỹ thuật RQ-PCR

  1. T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024 BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BỆNH TỒN LƯU TỐI THIỂU TRÊN NGƯỜI BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY MANG ĐỘT BIẾN GEN NPM1 TYPE A BẰNG KỸ THUẬT RQ-PCR Cao Văn Động1 , Châu Thúy Hà1 , Võ Lâm Hoàng Vũ2 , Phù Chí Dũng1 , Nguyễn Tấn Bỉnh3 , Phan Thị Xinh1,2 TÓM TẮT 44 Kết luận: Kỹ thuật RQ-PCR đường chuẩn có Mục tiêu: Xác định bệnh tồn lưu tối thiểu thể xác định dòng đột biến NPM1 type A ở mức trên người bệnh Bạch cầu cấp dòng tủy mang đột thấp, là công cụ hữu ích trong theo dõi tồn lưu tế biến gen NPM1 type A bằng kỹ thuật RQ-PCR. bào ác tính mang đột biến NPM1 type A. Đối tượng: Người bệnh bạch cầu cấp dòng Từ khóa: NPM1 type A, RQ-PCR, Bạch cầu tủy mang đột biến gen NPM1 type A lúc chẩn cấp dòng tuỷ. đoán tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ tháng 10/2022 đến tháng 10/2023. SUMMARY Phương pháp nghiên cứu: Tạo dòng INITIAL QUANTITATIVE plasmid từ DNA mẫu bệnh nhân bằng kit pGEM- ASSESSMENT OF MINIMAL T Easy vector TA cloning để xây dựng đường RESIDUAL DISEASE IN ACUTE cong chuẩn. Phản ứng RQ-PCR được thực hiện MYELOID LEUKEMIA CARRYING với mẫu nồng độ chuẩn, mồi, đầu dò và 2X NPM1 TYPE A MUTATION PrimeTime® Gene Expression Master Mix BY RQ-PCR (Integrated DNA Technologies-Mỹ) để tối ưu Objectives: Detection of minimal residual hóa. Xác định bệnh tồn lưu tối thiểu trên người disease in patients with acute myeloid leukemia bệnh bằng kỹ thuật RQ-PCR. carrying NPM1 type A mutation by RQ-PCR. Kết quả: Chúng tôi đã chuẩn hóa thành công Subjects: The patients with Acute Myeloid phản ứng RQ-PCR để định lượng đột biến NPM1 Leukemia carrying NPM1 type A mutation at type A với độ nhạy 10 -5 . Dựa trên kết quả động diagnosis in the Blood Transfusion and học của bệnh tồn lưu tối thiểu, có 13/17 NB cho Hematology Hospital from October 2022 to thấy mức giảm 3 log10 NPM1 sau điều trị. October 2023. Method: Cloning of the patient sample with pGEM-T Easy vector TA cloning kit was done to 1 produce plasmids for the generation of standard Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học curves. RQ-PCR reaction performed with 2 Bộ Môn Huyết Học, Đại Học Y dược TPHCM standard concentrations, primers, probes and 2X 3 Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch PrimeTime® Gene Expression Master Mix Chịu trách nhiệm chính: Phan Thị Xinh (Integrated DNA Technologies-USA) for SĐT: 0932728115 optimization. Detection of minimal residual Email: bsphanthixinh@ump.edu.vn disease in patients by RQ-PCR. Ngày nhận bài: 30/7/2024 Results: In this study, we developed RQ- Ngày phản biện khoa học: 01/8/2024 PCR to quantitation of NPM1 mutation A with Ngày duyệt bài: 17/9/2024 377
  2. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU sensitivities of 10 -5 . On the basis of minimal được đánh giá tồn lưu bằng kỹ thuật PCR residual disease kinetics in 11 patients who were định lượng (RQ-PCR) [5, 9]. monitored after treatment, 13/17 patients showed Gen NPM1 là phối tử trong chuyển vị 3-log10 reduction in the NPM1mut levels after NST của bệnh bạch cầu và lymphoma, kết treatment. quả là trong các tổ hợp chứa các vùng NPM Conclusion: RQ-PCR with standard curves đầu N, NPM xuất hiện để góp phần sinh u could detect NPM1 type A mutant clone at low bằng cách kích hoạt tiềm năng gây ung thư level, so it will be useful device in monitoring của các phối tử protein tổ hợp (ALK, MLF1, mesurable disease postreatment. hoặc RARα). Vì NPM được cho là có chức Keywords: NPM1 type A, RQ-PCR, AML. năng ức chế u, do đó rối loạn trong chuyển động của nó từ nhân ra tế bào chất có thể I. ĐẶT VẤN ĐỀ quan trọng đối với chuyển dạng ác tính [3] Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) là Nhiều nghiên cứu cho thấy, hơn 90% NB một trong những bệnh ung thư phổ biến trên BCCDT tái phát mang đột biến NPM1 tại thế giới, đặc trưng bởi sự rối loạn trong tăng thời điểm chẩn đoán vẫn còn hiện diện kiểu sinh và biệt hóa các tế bào tạo máu đầu dòng đột biến này tại thời điểm tái phát [4, 8, 10]. tủy. Sự bất thường này làm mất chức năng Theo Ivey và cộng sự, sau chu kỳ hóa trị thứ bảo vệ cơ thể dẫn đến tỉ lệ tử vong cao nếu hai, kết quả đánh giá BTLTT dựa trên đột không được chẩn đoán, điều trị kịp thời và biến NPM1 cho thấy nhóm có BTLTT dương hiệu quả. Trong các phác đồ điều trị đặc hiệu tính có tỷ lệ tái phát cao hơn và thời gian hiện nay, các người bệnh sẽ được điều trị tấn sống ngắn hơn so với nhóm người bệnh công trong thời gian đầu phát hiện bệnh. Tuy không phát hiện BTLTT [8]. Hiện nay, các nhiên, tỉ lệ bệnh tồn lưu tối thiểu cao sau phác đồ điều trị bệnh BCCDT trên thế giới điều trị dẫn đến nguy cơ tái phát cao. Do đó, đều cho rằng theo dõi BTLTT là một phần việc tìm ra các dấu ấn cho phép dự đoán tái không thể thiếu. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra phát, đáp ứng điều trị và hướng dẫn can thiệp rằng đột biến NPM1 là một tiêu chuẩn độc điều trị là rất cần thiết. Các dấu ấn được sử lập để theo dõi điều trị bệnh BCCDT sau các dụng để theo dõi điều trị (hay theo dõi bệnh giai đoạn điều trị. Việc theo dõi BTLTT bằng tồn lưu tối thiểu: BTLTT) trong bạch cầu cấp đột biến NPM1 được thực hiện bởi kỹ thuật dòng tủy chủ yếu là các bất thường di truyền real time PCR. Đây là một kỹ thuật sinh học thường gặp như PML/RARA, AML1/ETO, phân tử có độ nhạy cao, chuyên biệt để xác CBFB/MYH11 hay MLL/AF9. Đối với định chính xác số bản sao của gen. Tại Việt những người bệnh không mang các bất Nam, các NB BCCDT trong quá trình điều thường di truyền thường gặp cần có một chỉ trị được theo dõi bệnh tồn lưu tối thiểu bằng dấu sinh học khác để theo dõi hiệu quả điều các kỹ thuật như tế bào dòng chảy, PCR, trị. Theo hướng dẫn điều trị của Mạng lưới Real time PCR tổ hợp gen đặc hiệu. Tuy ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCCN: National nhiên, hiện chưa có nghiên cứu nào khảo sát Comprehensive Cancer Network) từ phiên định lượng đột biến gen NPM1 ở bệnh bạch bản 3.2022 và Mạng lưới bạch cầu Châu âu cầu cấp dòng tủy. Theo ghi nhận từ các (ELN: European Leukemia Net), Người bệnh nghiên cứu trên thế giới cho thấy type A là (NB) BCCDT mang đột biến NPM1 có thể kiểu đột biến phổ biến nhất chiếm khoảng 378
  3. T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024 80% tất cả các đột biến NPM1 trong BCCDT cho phản ứng (thực hiện quy trình trong 3 lần [2]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ở các nhiệt đột bắt cặp khác nhau). “Đánh giá bệnh tồn lưu tối thiểu trên người - Thực hiện phản ứng RQ-PCR đường bệnh bạch cầu cấp dòng tủy mang đột biến chuẩn định lượng đột biến NPM1 từ mẫu NB gen NPM1 type A bằng kỹ thuật RQ-PCR” mang đột biến gen type A lúc chẩn đoán ở nhằm đánh giá lui bệnh, phát hiện tái phát các giai đoạn sau điều trị. Đồng thời định sớm cho người bệnh. lượng gen ABL (gen giữ nhà) để đánh giá BTLTT cho người bệnh. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Thực hiện song song mẫu BN này với Người bệnh bạch cầu cấp dòng tủy mang kit thương mại Qiagen định lượng đột biến đột biến gen NPM1 type A lúc chẩn đoán tại NPM1 type A với độ nhạy 10-5 và tiến hành Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ tháng so sánh, đánh giá mức độ tương đồng, độ 10/2022 đến tháng 10/2023. nhạy của phản ứng RQ-PCR. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Thu thập và xử lý số liệu Địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại Dữ liệu thu được sau khi thực hiện phản Khoa Di truyền học phân tử, Bệnh viện ứng RQ-PCR được chúng tôi tiến hành tổng Truyền máu Huyết học. hợp phân tích bằng phần mềm Microsoft Thời gian: Từ 10/2022 đến 12/2023 Excel và kiểm định Wilcoxon. Các kết quả Thiết kế nghiên cứu: mô tả loạt ca. được trình bày theo tỷ lệ hoặc dưới dạng bảng và hình. Các bước tiến hành nghiên cứu - Ly trích RNA từ mẫu tủy xương chứa III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU trong ống EDTA với kit Maxwell® RSC Chuẩn hóa điều kiện RQ-PCR định simplyRNA Blood của hãng Promega (Mỹ). lượng đột biến gen NPM1 type A - Thiết kế các đoạn mồi và đoạn dò cho Dựa trên trình tự chuẩn của gen NPM1 phản ứng RQ-PCR bằng phần mềm Oligo mang accession number NM_002520, chúng 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của gen NPM1 tôi đã thiết kế các mồi NPM1-F: 5’- mang accession number NM_002520. GGTTGTTCTCTGGAGCAGCGTTC-3’, - Tạo dòng bằng kít pGEM-T Easy vector NPM1-R: 5’- TA cloning theo hướng dẫn của nhà sản xuất CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA và pha loãng dòng tế bào mang đột biến gen -3’ để khuếch đại gen làm nguyên liệu cho tạo NPM1 type A để được đường chuẩn (102 → dòng và xây dựng đường chuẩn NPM1. Các 106 ) và mẫu thử giới hạn phát hiện của kỹ mồi Q.NPM1-F1: 5’- thuật (10-4 , 10-5 , 10-6 ). TCAAGATCTCTGTCTG-3’; Q.NPM1-R1: - Thử nghiệm điều kiện cho phản ứng 5’- CACGGTAGGGAAAGTTCT-3’ và đoạn RQ-PCR với 2X PrimeTime® Gene dò NPM1-Probe1: 5’-6FAM- Expression Master Mix (Integrated DNA ATCTGGCTGTCCTTTTTATAATGCAG- Technologies-Mỹ) và các mồi, đoạn dò TAMRA-3’ dùng cho phản ứng RQ-PCR phát huỳnh quang đã thiết kế. Khảo sát nhiệt độ hiện đột biến gen NPM1 type A. Sau khi thử bắt cặp của mồi, đoạn dò lần lượt từ 58°C, nghiệm, chúng tôi ghi nhận đã khuếch đại 60°C và 62°C để tìm ra điều kiện tối ưu nhất thành công đoạn gen NPM1 (hình 1). 379
  4. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU Hình 1. Khuếch đại thành công gen NPM1 A: khuếch đại gen NPM1 ở 60o C (giếng 2); hình B là trình tự sản phẩm giếng 2 hình A Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại thành công được chúng tôi sử dụng để tạo dòng gen NPM1 bao gồm dòng WT và dòng đột biến type A, kết quả thu được như hình 2. Hình 2. Kết quả kết quả tạo dòng T-vector gen NPM1 A: Kết quả tạo khuẩn lạc; B: Kết quả giới hạn phát hiện của kỹ thuật 10-4, 10-5 , 10-6 . điện di sản phẩm PCR từ khuẩn lạc Phản ứng RQ-PCR khảo sát nhiệt độ lai Thực hiện ly trích DNA plasmid các khuẩn (Ta: annealing temperatures) sử dụng dãy nồng lạc thu được, đo mật độ quang ở bước sóng độ chuẩn chúng tôi ghi nhận, ở mức nhiệt độ 260 nm OD (A260 ) và 280 nm OD (A 280 ) cho lai 58°C và 62°C cho tín hiệu nền nhiễu và chu thấy ở các mẫu tỉ lệ A260 /A280 đều đạt  1,8. kỳ ngưỡng Ct của gen mục tiêu có nồng độ cao Xác định số bản sao DNA từ kết quả đo OD, là quá cao, các đường chuẩn cho độ tuyến tính dãy nồng độ bản sao tuyến tính được thiết lập rất thấp với các thông số như hiệu suất PCR, , bằng cách pha loãng để có các nồng độ của R2 lần lượt là 124%, 0,65, 0,94 (hình 3A) và đường chuẩn 102 , 103 , 104 , 105 , 106 và mẫu thử 66%, 0,66, 1 (hình 3B). 380
  5. T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024 Hình 3. Phản ứng RQ-PCR với nhiệt độ lai mồi và đoạn dò 58o C (A) và 62o C (B) Đối với nhiệt độ lai 60°C là nhiệt độ tối PCR Sacycler 96 cho phản ứng RQ-PCR như ưu mà chúng tôi ghi nhận được. Tại đó, các sau: biến tính ban đầu ở 95°C trong 10 phút, thông số của phản ứng RQ-PCR cũng tối ưu 50 chu kỳ tiếp theo với các bước biến tính như hiệu suất PCR đạt 99%,  = 0,16 và R2 = 95°C trong 15 giây, bắt cặp, tổng hợp chụp 0,999 (hình 4). Do đó, chúng tôi chọn hình 30 giây ở nhiệt độ 60°C. chương trình luân nhiệt trên máy Real Time Hình 4. Phản ứng RQ-PCR với nhiệt độ lai mồi và probe 60o C Tổng hợp các thông số của phản ứng thử nghiệm tối ưu hoá điều kiện RQ-PCR, chúng tôi đã xác định được nhiệt độ lai tối ưu, ngưỡng cut-off và các nồng độ chuẩn gen NPM1 cho phản ứng RQ-PCR như sau: Nhiệt độ lai của phản ứng là 60°C, ngưỡng cut-off là Ct = 39, các nồng độ chuẩn là 102 , 103 , 104 , 105 , 106 . 381
  6. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU Hình 5. Đường chuẩn thử nghiệm RQ-PCR định lượng đột biến gen NPM1 Các chấm đỏ: các mẫu nồng độ chuẩn; Giới hạn phát hiện của kỹ thuật RQ- chấm vàng: chứng dương PCR định lượng đột biến gen NPM1 type Như vậy, chúng tôi đã thiết lập và chuẩn A. hoá thành công điều kiện phản ứng RQ-PCR Chúng tôi pha loãng dòng tế bào mang định lượng đột biến gen NPM1 type A. Áp đột biến gen NPM1 type A và dòng wild type dụng điều kiện tối ưu này cùng với với các theo bậc thang nồng độ từ 10-4 đến 10-6 . Phản mẫu nồng độ chuẩn và chứng dương, nhóm ứng RQ-PCR sẽ thực hiện lặp lại 20 lần ở nghiên cứu tiến hành khảo sát giới hạn phát mỗi mức nồng độ này, để khảo sát giới hạn hiện của kỹ thuật. phát hiện của kỹ thuật. Hình 6 minh hoạ kết quả tối ưu của phản ứng RQ-PCR với mẫu nồng độ pha loãng 10-5 . Hình 6. Khảo sát giới hạn phát hiện của phản ứng RQ-PCR gen NPM1 382
  7. T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024 Phân tích các kết quả, chúng tôi ghi nhận công, 04 trường hợp còn lại được thu thập ở phản ứng RQ-PCR gen NPM1 trên các mẫu cả 02 thời điểm sau điều trị tấn công và sau ở mức pha loãng 10-5 đều cho kết quả định điều trị củng cố. Kết quả định lượng gen lượng dương tính và phù hợp với kết quả pha ABL cho thấy tất cả các mẫu đều cho số bản loãng. Như vậy, phản ứng RQ-PCR định sao ABL cao, trên 10.000 bản sao (bảng 1). lượng đột biến gen NPM1 thiết lập từ nghiên Các mẫu này được tổng hợp cDNA 1 lần và cứu này có thể đạt độ nhạy 10-5 . Từ các kết sử dụng chung cho các phản ứng RQ-PCR quả trên, nhóm nghiên cứu đã ứng dụng kỹ định lượng từ kít hoá chất Qiagen cũng như thuật này để xác định BTLTT trên người hoá chất đường chuẩn xây dựng từ nghiên bệnh. cứu này nhằm so sánh kết quả BTLTT ghi Xác định BTLTT trên NB BCCDT nhận được. Tiến hành so sánh kết quả đánh mang đột biến gen NPM1 type A sau điều giá BTLTT từ RQ-PCR đường chuẩn chúng trị. tôi xây dựng với kít hoá chất từ nhà sản xuất Đối với tất cả các phản ứng được thực Qiagen ghi nhận, có sự tương đồng về tỉ lệ hiện, chúng tôi ghi nhận các chứng âm 1 NPM1/ABL giữa 2 phương pháp này. Sử (mẫu người bình thường không mang đột dụng kiểm định Wilcoxon để so sánh từng biến gen NPM1) và chứng âm 2 (nước) đều cặp số bản sao NPM1, chúng tôi nhận được cho kết quả âm tính. Trong 17 NB, có 13 NB kết quả như bảng 1 và 2. được thu thập mẫu tại thời điểm điều trị tấn Bảng 1. Kết quả đánh giá BTLTT trên NB sau điều trị tấn công dựa trên RQ-PCR đường chuẩn và Kit từ hãng Qiagen Sau điều trị tấn công Mã NB ABL (bản sao) NPM1 TYPE A (bản sao) Tỷ lệ đột biến NPM1 NC Qiagen NC Qiagen NC Qiagen NP-1 45000 57200 136 266 0,003 0,005 NP-2 102300 89700 15900 14100 0,155 0,157 NP-3 121500 105000 2280 1950 0,019 0,019 NP-4 36400 28100 6190 4870 0,170 0,173 NP-5 15700 11600 233 164 0,015 0,014 NP-6 39700 30400 87600 68200 2,207 2,243 NP-7 42300 22900 19500 7520 0,461 0,328 NP8 40800 12000 211000 60200 5,172 5,017 NP-9 42900 38100 550 496 0,013 0,013 NP-10 191500 118000 5150000 3140000 26,893 26,610 NP-11 13100 10500 236 180 0,018 0,017 NP-12 179000 123000 97900 61600 0,547 0,501 NP-13 131000 125000 25000 24100 0,191 0,193 NP-14 301000 262000 9400000 5730000 31,229 21,870 NP-15 198300 128000 19,1 0,05 0,0001 0,0000 383
  8. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU NP-16 109300 61500 47800 22800 0,437 0,371 NP-17 389200 303000 9,5 7,5 0,00002 0,00002 So sánh cặp theo p < 0,001 p < 0,001 p = 0,131 Wilcoxon Bảng 2. Kết quả đánh giá BTLTT trên NB sau điều trị củng cố dựa trên RQ-PCR đường chuẩn và Kit từ hãng Qiagen Sau điều trị củng cố NPM1 TYPE A Tỷ lệ đột biến Mã NB ABL (bản sao) (bản sao) NPM1 NC Qiagen NC Qiagen NC Qiagen NP-1 125000 101000 30,1 17,5 0,00024 0,00017 NP-2 137400 135000 101 69 0,00074 0,0005 NP-3 182500 176000 52 38,9 0,00028 0,00022 NP-4 53700 48500 120 80,5 0,002 0,002 So sánh cặp theo Wilcoxon p < 0,001 p < 0,001 p = 0,131 Như vậy, tỉ lệ NPM1/ABL được phát thống kê (p < 0,001). Do đó RQ-PCR đường hiện bởi các 02 hoá chất khác biệt không có chuẩn ít nhất có thể khảo sát, định lượng số ý nghĩa thống kê (p = 0,131). Tuy nhiên, kết bản sao tuyệt đối tương đương kít hoá chất quả của RQ-PCR đường chuẩn do chúng tôi thương mại của hãng Qiagen. Trên cơ sở đó, xây dựng và chuẩn hoá có số bản sao ABL chúng tôi tiến hành đánh giá BTLTT trên và NPM1 cao hơn kít hoá chất thương mại người bệnh (bảng 3). của hãng Qiagen, sự khác biệt có ý nghĩa Bảng 3. Kết quả đánh giá BTLTT trên người bệnh mang đột biến NPM1 Chẩn đoán Sau điều trị tấn công Sau điều trị củng cố Tỷ lệ NPM1 Tỷ lệ Mã NPM1 Tỷ lệ đột NPM1 ABL ABL ABL đột TYPE đột NB TYPE A biến TYPE A (bản (bản sao) (bản sao) biến A (bản biến (bản sao) NPM1 (bản sao) sao) sao) NPM1 NPM1 NP-1 125000 2680000 21,440 45000 136 0,003 125000 30,1 0,00024 NP-2 62200 15200000 244,373 102300 15900 0,155 137400 101 0,00074 NP-3 206000 6380000 30,971 121500 2280 0,019 182500 52 0,00028 NP-4 968000 9680000 10,000 36400 6190 0,170 53700 120 0,002 NP-5 10100 7440000 736,634 15700 233 0,015 NP-6 10700 48580000 4540,187 39700 87600 2,207 NP-7 52900 472000000 8922,495 42300 19500 0,461 NP8 18300 170000000 9289,617 40800 211000 5,172 NP-9 16500 51700000 3133,333 42900 550 0,013 384
  9. T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024 NP-10 22800 14700000 644,737 191500 5150000 26,893 NP-11 51800 26900000 519,305 13100 236 0,018 NP-12 11600 69800000 6017,241 179000 97900 0,547 NP-13 11000 14000000 1272,727 131000 25000 0,191 NP-14 13600 425000 31,250 301000 9400000 31,229 NP-15 217000 2090000 9,631 198300 19,1 0,0001 NP-16 190000 2860000 15,053 109300 47800 0,437 NP-17 373000 6720000 18,016 389200 9,5 0,00002 ứng RQ-PCR. Các thử nghiệm được tiến Kết quả cho thấy, 13/17 NB đạt lui bệnh hành ở các nhiệt độ lai 58°C và 62°C đều về sinh học phân tử với tỷ lệ đột biến NPM1 < 0,01% hoặc giảm ≥ 3 log ở sau giai đoạn cho thấy nhiều tín hiệu nền, chu kỳ ngưỡng điều trị tấn công so với thời điểm chẩn đoán. Ct của các mẫu có nồng độ cao là cao. Trong Bốn trong 17 NB không đạt lui bệnh về sinh khi đó, các mẫu có nồng độ thấp không được học phân tử sau giai đoạn điều trị tấn công. khuếch đại. Điều này có thể do nhiệt độ lai Trong 04 NB này, có 01 trường hợp đạt lui của mồi chưa được tối ưu hoá, dẫn đến sự bắt bệnh về sinh học phân tử sau giai đoạn điều cặp giữa mồi, đoạn dò huỳnh quang và đoạn trị củng cố (NP-4, bảng 3) và 02 trường hợp gen mục tiêu không xảy ra hoặc xảy ra ít làm NP-10 và NP-14 còn tồn lưu tỷ lệ đột biến cho Ct cao, hoặc do sự bắt cặp, lai không đặc NPM1 rất cao, phù hợp với diễn tiến lâm hiệu đưa đến các sản phẩm phụ làm cho tín sàng của người bệnh khi NB NP-10 đã tái hiệu nền nhiễu. Các đoạn mồi và đoạn dò sử phát huyết học ở thời điểm 9 tháng sau đó, dụng trong nghiên cứu này được chúng tôi NB NP-14 hồi phục rất chậm sau điều trị tấn thiết kế sao cho nhiệt độ lai tối ưu gần nhau công với phác đồ phối hợp anthracycline và nhất, ở khoảng 60°C. Ghi nhận các kết quả cytarabine “7 + 3”, tỷ lệ blast tuỷ ngày thứ thử nghiệm ở nhiệt độ bắt cặp mồi và khuếch 70 là 50%. đại là 60o C cho thấy phản ứng có độ nhạy và độ tin cậy cao thông qua các thông số của IV. BÀN LUẬN các đường chuẩn. Sau nhiều lần lặp lại, hệ số Chuẩn hóa phản ứng RQ-PCR định tương quan đạt được là 0,9998, độ lệch lượng đột biến gen NPM1 type A chuẩn là 0,071, trong khi hiệu suất phản ứng Phản ứng RQ-PCR định lượng gen đạt 99%, giá trị slope đạt và ngưỡng cut-off NPM1 đột biến dựa trên đường chuẩn là lần lượt là -3,333 và 39,3 chu kỳ. Các chu kỳ đường tuyến tính được xây dựng từ các mẫu ngưỡng của mẫu nồng độ chuẩn ở mức có nồng độ chuẩn của bản sao gen NPM1 đột 1×106 và 1×105 đều thấp, lần lượt dưới 16 và biến. Do đó, việc xây dựng được đường 20 chu kỳ, trong đó tín hiệu nền không bị chuẩn có độ tuyến tính cao là điều kiện tiên nhiễu (hình 4). Điều này chứng tỏ phản ứng quyết để định lượng chính xác gen mục tiêu. đã tối ưu hoá, phù hợp với lý thuyết tối ưu Các mẫu nồng độ chuẩn được pha loãng hoá phản ứng Real-time PCR [1]. thành công là tiền đề giúp chúng tôi tiến Hầu hết các xét nghiệm RQ-PCR đánh hành thử để tìm ra điều kiện tối ưu cho phản giá BTLTT đều yêu cầu mẫu đầu vào là 385
  10. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU DNA bổ sung (cDNA) được tổng hợp từ này, giúp khuếch đại đặc hiệu alen đột biến RNA. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã mà không khuếch đại kiểu hoang dã (wild thiết kế các mồi, probe dựa trên trình tự tham type). Do đó, RQ-PCR định lượng đột biến chiếu mRNA của gen NPM1 để thiết lập các này có độ nhạy có thể đạt được lên tới 10-5 – điều kiện phản ứng như trên. Tuy nhiên, do 10-6 [12]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi động học phân huỷ nhanh của mRNA nên đã thiết kế đoạn dò gắn huỳnh quang có cấu phản ứng định lượng NPM1 cũng giống như trúc đầu 3’ bắt cặp bổ sung với trình tự đoạn các phản ứng qRT-PCR khác, luôn được đi chèn 4 nucleotide “TCTG” trên gen NPM1. kèm với định lượng 1 gen tham chiếu. Với Kết quả thử nghiệm cho thấy, phản ứng RQ- đặc tính biểu hiện ổn định, không khác biệt PCR định lượng đột biến gen NPM1 do đáng kể giữa các mẫu bình thường và bệnh chúng tôi thiết lập điều kiện và chuẩn hoá có bạch cầu khi chẩn đoán, ABL được xem như độ nhạy đạt 10−5 , tương đồng với nhiều báo là 1 gen tham chiếu tin cậy trong đánh giá đã ghi nhận [6], [11], [12]. BTLTT bằng nguyên liệu đầu vào là mRNA Phản ứng khảo sát giới hạn phát hiện ở NB bệnh bạch cầu [13]. được chúng tôi thực hiện với điều kiện đã Như vậy, nghiên cứu đã thiết lập và được tối ưu hoá cùng các mẫu đường chuẩn chuẩn hoá phản ứng RQ-PCR thành công với vừa được xây dựng. Các mẫu chuẩn nồng độ các thông số tối ưu cùng với kiểm soát chất 10-4 – 10-6 được pha loãng từ mẫu chuẩn của lượng mẫu bằng gen tham chiếu. Ứng dụng kit thương mại hãng Qiagen (10 mẫu) và từ kết quả này, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo tạo dòng ở nghiên cứu này (10 mẫu). Độ sát giới hạn phát hiện của kỹ thuật và đánh nhạy đạt được của phản ứng RQ-PCR định giá BTLTT cho NB BCCDT mang đột biến lượng đột biến gen NPM1 trong nghiên cứu NPM1 lúc chẩn đoán. này tương đương độ nhạy của bộ kit thương Giới hạn phát hiện của kỹ thuật RQ mại ipsogen NPM1 mut A, B&D MutaQuant PCR định lượng đột biến gen NPM1 type A kit – Qiagen (10-5 ). Theo khuyến cáo của ELN, RQ-PCR Trong một nghiên cứu của Caprioli và cùng với ddPCR (Droplet Digital PCR: PCR cộng sự năm 2018 nghiên cứu trên 27 mẫu kỹ thuật số) và NGS (Next-Generation cDNA của BN BCCDT ở giai đoạn sau điều Sequencing: giải trình tự thế hệ mới) là 3 trị tấn công, với RQ-PCR đạt độ nhạy 10-4 phương pháp hữu hiệu để đánh giá BTLTT cho thấy, lượng tồn lưu NPM1 đột biến < dựa trên các bất thường di truyền liên quan 0,1% có liên quan đến nguy cơ tái phát thấp đến bệnh bạch cầu. Trong nhiều nghiên cứu hơn (P = 0,035) [14]. Trong khi đó, Kapp- gần đây, RQ-PCR đã được sử dụng rộng rãi Schwoerer và cộng sự năm 2018 sử dụng để đánh giá BTLTT dựa trên đột biến NPM1 RQ-PCR có độ nhạy 10-5 – 10-6 khảo sát trên trên nhóm NB BCCDT mang đột biến này 6339 mẫu cDNA ghi nhận, NB có mức giảm lúc chẩn đoán [6], [11], [12] với độ nhạy đạt NPM1 đột biến ≥ 3 log sau 2 chu kỳ hoá trị được là 10−5 . liệu và đạt được mức âm tính ( 0,01%) khi Đột biến NPM1 là đột biến chèn đoạn 4 kết thúc điều trị có tỷ lệ tái phát tích luỹ thấp nucleotide đặc trưng, điều này cho phép việc hơn [15]. Tổng hợp từ nhiều nghiên cứu khác thiết kế các mồi hoặc đoạn dò có cấu trúc cũng cho thấy phản ứng RQ-PCR định lượng đầu 3’ bắt cặp với vùng chèn đoạn đặc trưng đột biến NPM1 đạt độ nhạy tối thiểu 10−4 386
  11. T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024 [7], [10]. Điều này đòi hỏi phương pháp định quả cho thấy, tỉ lệ NPM1/ABL được phát lượng đột biến NPM1 có độ nhạy phải đạt ít hiện bởi các 02 hoá chất khác biệt không có nhất là 10−4 . ý nghĩa thống kê (p = 0,131). Do đó RQ- Như vậy, qua những phân tích cho thấy PCR đường chuẩn có thể khảo sát, định với độ nhạy của phương pháp chúng tôi đã lượng số bản sao tuyệt đối tương đương kít xây dựng, phản ứng RQ-PCR thiết lập và hoá chất thương mại của hãng Qiagen. được chuẩn hoá từ nghiên cứu này hoàn toàn Tái phát bệnh là nguyên nhân chính dẫn đáp ứng được các yêu cầu về độ nhạy, điều đến thất bại điều trị và tử vong ở bệnh kiện chuẩn hoá để đánh giá BTLTT cho NB BCCDT. Mặc dù hơn 80% bệnh nhân đạt BCCDT mang đột biến gen NPM1 sau các được lui bệnh sau điều trị tấn công hoặc sau giai đoạn điều trị. khi hóa trị liệu khảo sát bằng kỹ thuật tủy đồ, Xác định BTLTT trên NB BCCDT nhưng một số lượng đáng kể bệnh nhân trong mang đột biến gen NPM1 type A sau điều số đó bị tái phát bệnh. Do đó, việc theo dõi trị. Theo khuyến cáo của ELN, những NB BTLTT là tiêu chuẩn vàng để phân nhóm BCCDT có đột biến NPM1, hoặc có tổ hợp nguy cơ tái phát cho bệnh nhân. Theo ghi gen RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH11, nhận kết quả của nghiên cứu này, 13/17 NB PML-RARA, nên được đánh giá BTLTT dựa đạt lui bệnh về sinh học phân tử với tỷ lệ đột trên các bất thường này tại các thời điểm khi biến NPM1 < 0,01% hoặc giảm ≥ 3 log 10 ở chẩn đoán, sau 2 chu kỳ hóa trị liệu tấn sau giai đoạn điều trị tấn công so với thời công/củng cố và khi kết thúc điều trị [11]. điểm chẩn đoán (bảng 2). Những NB này Việc đánh giá đúng mức giảm các bất thường được phân nhóm có nguy cơ tái phát thấp phụ thuộc vào chất lượng mRNA dùng để hoặc tỷ lệ tái phát tích luỹ thấp [7], [10], định lượng. Do đó, gen giữ nhà ABL như là [14], [15]. Trong nhóm này, tất cả những NB 1 tham chiếu để phán ánh kết quả BTLTT đã kết thúc điều trị trên 6 tháng và hiện chưa cho NB. Trong nghiên cứu này, hai mươi ghi nhận trường hợp nào tái phát. Bốn trong mốt mẫu cDNA sau điều trị tấn công và/ tăng 17 NB còn lại không đạt lui bệnh sau giai cường của 17 NB được đánh giá cho số bản đoạn điều trị tấn công là các trường hợp NB sao gen ABL trên 10.000, với NB có số bản mang các mã số NP-4, NP-10, NP-14 và NP- sao thấp nhất 10.100, cao nhất đạt 968.000 16 (bảng 2). Trong đó, 01 NB NP-10 đã tái bản sao (bảng 1). Điều này cho thấy các mẫu phát huyết học sau 9 tháng điều trị, NB NP- cDNA đều đạt chất lượng cao, tin cậy làm 14 không lui bệnh sau điều trị tấn công với mẫu cho phản ứng định lượng đột biến gen phác đồ phối hợp anthracycline và cytarabine NPM1. “7 + 3”, tỷ lệ blast tuỷ ngày thứ 70 là 50%. Trước khi đánh giá BTLTT, chúng tôi đã Đối với NP-4, NB đã đạt lui bệnh ở lần đánh tiến hành so sánh kết quả định lượng ABL và giá sau điều trị củng cố. Riêng trường hợp NPM1 từ RQ-PCR đường chuẩn do chúng NP-16 ở thời điểm hiện tại NB đang trong tôi xây dựng và kít hoá chất thương mại giai đoạn điều trị tăng cường 1, nhưng với ipsogen NPM1 mut A, B&D MutaQuant kit việc mức BTLTT sau giai đoạn tấn công rất của hãng Qiagen với cùng nguyên liệu đầu cao (0,437) và kèm đột biến FLT3-ITD High , vào là các mẫu cDNA được tổng hợp 1 lần chúng tôi đề nghị cần theo dõi diễn tiến NB và sử dụng chung cho cả 02 kít hoá chất. Kết chặt chẽ đồng thời tiến hành đánh giá 387
  12. KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU BTLTT tại các thời điểm kết thúc mỗi giai đoán NB không phát hiện bất thường di đoạn điều trị hoặc thời điểm có diễn tiến bất truyền bằng NST đồ và không phát hiện các thường trên lâm sàng. bất thường thường gặp bằng kỹ thuật FISH, Đối với 02 NB là những trường hợp có RT-PCR. Kết quả NGS phát hiện đột biến BTLTT dương tính rất cao sau giai đoạn điều trên các gen CEBPA, DNMT3A, NPM1 và trị tấn công (mức tỷ lệ NPM1 lần lượt là WT1, trong khi kết quả Sanger ghi nhận NB 26,89 và 31,22), đây là điểm đáng ghi nhận mang đột biến FLT3-ITD High .Vì vậy các kỹ cho thấy khả năng lui bệnh và tiên lượng tái thuật như FISH, RT-PCR không được sử phát bệnh dựa trên BTLTT. Chúng tôi khai dụng để đánh giá BTLTT sau các giai đoạn thác thêm các thông tin từ hồ sơ bệnh án của điều trị, trong khi đột biến FLT3-ITD High 02 NB này để có góc nhìn rõ hơn về vai trò hiện vẫn chưa được coi là chỉ dấu để theo dõi của đánh giá BTLTT dựa trên đột biến BTLTT. Trên diễn tiến lâm sàng và các kết NPM1. quả xét nghiệm khác, NB cho thấy hồi phục NB NP-10 trong mẫu nghiên cứu của rất chậm sau điều trị tấn công với phác đồ chúng tôi được điều trị với phác đồ phối hợp phối hợp anthracycline và cytarabine “7 + anthracycline và cytarabine “7 + 3”. Đây là 3”. Kết quả đánh giá BTLTT dựa trên đột một NB sinh năm 1988, tại thời điểm chẩn biến gen NPM1 cho thấy NB còn tồn lưu đoán NB phát hiện bất thường di truyền bằng mức NPM1/ABL rất cao (31,22), điều này NST đồ với kết quả 46,XX,der(11) gợi ý NB không lui bệnh sau điều trị. Kết t(11;?)(q23;?)[4]/46,XX[16], tuy nhiên kết quả đánh giá tuỷ ngày 70 trong quá trình điều quả FISH không phát hiện bất thường nhiễm trị cho thấy tỷ lệ blast tuỷ là 50%. sắc thể 11q23 và không phát hiện các bất Như vậy, các kết quả nghiên cứu cho thường thường gặp bằng kỹ thuật RT-PCR. thấy, chúng tôi đã thành công trong thiết kế, Kết quả NGS phát hiện đột biến trên các gen xây dựng quy trình và chuẩn hóa điều kiện IDH1, NPM1 và PTPN11, trong khi không phản ứng RQ-PCR định lượng đột biến gen phát hiện đột biến gen FLT3 bằng kỹ thuật NPM1 type A với giới hạn phát hiện của kỹ Sanger. Bất thường NST được phát hiện trên thuật đạt 10-5 . Việc đánh giá BTLTT dựa trên NST đồ không thuộc trong các bất thường đột biến gen NPM1 mang lại độ chính xác thường gặp, do đó chúng tôi không thực hiện cao, giúp theo dõi điều trị, xác định lui bệnh, lại các kỹ thuật này để đánh giá sau các giai phân nhóm nguy cơ và phát hiện những đoạn điều trị. Để đánh giá BTLTT sau giai trường hợp tái phát sớm. đoạn tấn công, nhóm nghiên cứu sử dụng kỹ thuật RQ-PCR định lượng đột biến gen V. KẾT LUẬN NPM1. Kết quả ghi nhận BTLTT sau giai Đánh giá BTLTT trên NB BCCDT mang đoạn tấn công của NB này rất cao, ở mức tỷ đột biến gen NPM1 type A ghi nhận 13/17 lệ NPM1/ABL là 26,89. NB được phân NB đạt lui bệnh về sinh học phân tử, 4 trong nhóm nguy cơ trung gian và NB đã tái phát 17 NB không đạt lui bệnh về sinh học phân huyết học sau 9 tháng trong quá trình điều tử sau giai đoạn điều trị tấn công. Một NB trị. trong số 04 NB này đã đạt lui bệnh về sinh Một NB khác mang mã số NP-14 là một học phân tử sau giai đoạn điều trị củng cố. NB nữ, sinh năm 1986, tại thời điểm chẩn 388
  13. T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024 Kỹ thuật RQ-PCR đường chuẩn trong 8. Ivey A, Hills RK, Simpson MA, Jovanovic JV, et al. Assessment of Minimal Residual nghiên cứu này có thể xác định dòng đột biến Disease in Standard-Risk AML. N. Engl J NPM1 type A ở mức thấp, là công cụ hữu ích Med (2016) 374:422–33. trong theo dõi tồn lưu tế bào ác tính mang 9. NCCN Clinical Practice Guidelines in đột biến NPM1 type A. Oncology, Version 2.2022 — June 14, 2022 10. Schnittger, S.; Kern, W.; Tschulik, C.; Weiss, T.; Dicker, F.; Falini, B.; TÀI LIỆU THAM KHẢO Haferlach, C.; Haferlach, T. Minimal 1. Phạm Hùng Vân (2009) PCR và real-time residual disease levels assessed by NPM1 PCR: Các vấn đề cơ bản và các áp dụng mutation-specific RQ-PCR provide thường gặp, Nhà xuất bản y học, Hồ Chí important prognostic information in AML. Minh, tr.1-8. Blood 2009, 114, 2220–2231. 2. Cancer Research UK. AcuteMyeloid 11. Schuurhuis G.J., Heuser M., Freeman S., Leukaemia (AML) Incidence Statistics. Béné M.C., Buccisano F., Cloos J., Available online: https://www.cancer Grimwade D., Haferlach T., Hills R.K., researchuk.org/health-professional/cancer- Hourigan C.S., et al. Minimal/measurable statistics/statistics-by-cancer-type/leukaemia- residual disease in AML: A consensus aml/incidence# heading-Zero. document from the European LeukemiaNet 3. Chen, W., G.Z. Rassidakis, and L.J. MRD Working Medeiros (2006),"Nucleophosmin gene Party. Blood. 2018;131:1275–1291. mutations in acute myeloid leukemia". Arch 12. Gorello P, Cazzaniga G, Alberti Pathol Lab Med. 130(11): p. 1687-92. F, Dell'Oro MG, Gottardi E, Specchia G, 4. Cocciardi S, Dolnik A, Kapp-Schwoerer S, et al. Quantitative assessment of minimal et al. Clonal Evolution Patterns in Acute residual disease in acute myeloid leukemia Myeloid Leukemia With NPM1 carrying nucleophosmin (NPM1) gene Mutation. Nat Commun (2019) 10:2031. mutations. Leukemia. 2006; 20: 1103– 8. 5. Forghieri F, Comoli P, Marasca R, 13. Weisser M, Haferlach T, Schoch C, et al., Potenza L, Luppi M. Minimal/Measurable The use of housekeeping genes for real-time Residual Disease Monitoring in NPM1- PCR-based quantification of fusion gene Mutated Acute Myeloid Leukemia: A transcripts in acute myeloid leukemia, Clinical Viewpoint and Perspectives. Int J Leukemia: official journal of the Leukemia Mol Sci. 2018 Nov 6;19(11):3492. Society of America, Leukemia Research 6. Hantel, A.; Stock, W.; Kosuri, S. Fund, U.K. 2004; 18 (9): 1551-1553. Molecular Minimal Residual Disease Testing 14. Caprioli C., Lussana F., Stefanoni P., et al. in Acute Myeloid Leukemia: A Review for Comparison between multiparametric flow the Practicing Clinician. Clin. Lymphoma cytometry and RT-QPCR assay in evaluating Myeloma Leuk 2018, 18, 636–647. minimal residual disease before allogeneic 7. Hubmann, M.; Kohnke, T.; Hoster, E.; et stem cell transplantation in NPM1 acute al. Molecular response assessment by myeloid leukemia. HemaSphere. 2018;2:443. quantitative real-time polymerase chain 15. Kapp-Schwoerer S., Corbacioglu A., reaction after induction therapy in NPM1- Weber D., et al. Impact of NPM1 MRD mutated patients identifies those at high risk status after two cycles of intensive of relapse. Haematologica 2014, 99, 1317– chemotherapy to inform type of post- 1325. remission therapy: A study of the AML study group (AMLSG) HemaSphere. 2018;2:434. 389
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2